CC BY
45OECD+WoS: 4.01+AM (Agronomy) https://doi.org/10.31993/2308-6459-2020-103-4-13272
Полнотекстовая статья
ВЛИЯНИЕ ХИТИНА НА БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ШТАММОВ
BACILLUS SUBTILIS
И.Л. Краснобаева, Н.М. Коваленко*, Э.В. Попова
Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург
* ответственный за переписку, e-mail: nadyakov@mail.ru
Цель работы состояла в оценке влияния различных форм хитина и хитозана при глубинном культивировании штаммов Bacillus subtilis, составляющих основу лабораторного образца Витаплан, КЖ, на синтез хитиназы, а также на антагонистическую активность и индуцирующий эффект штаммов B. subtilis на примере патосистем: пшеница - Cochliobolus sativus и Puccinia recondita f. sp. tritici. Включение в среду для глубинного культивирования бактерий хитина в форме сухого порошка или хитина и хитозана в виде коллоидной суспензии показало, что только коллоидный хитин повышал антагонистическую активность штаммов B. subtilis в отношении тест-культур - Alternaria solani, Clavibacter michiganensis. Экспериментально обнаружена способность штаммов B. subtilis синтезировать внеклеточную хитиназу, при культивировании в среде, содержащий коллоидный хитин. Выявлен более высокий фунгистатический эффект лабораторного образца Витаплан КЖ + коллоидный хитин по отношению к Cohliobolus sativus по сравнению с исходным образцом. Показано, что лабораторный образец Витаплан, КЖ+ коллоидный хитин в 1.5-2.0 раза эффективнее повышает устойчивость пшеницы к темно-бурой пятнистости и бурой ржавчине, чем Витаплан,КЖ. В результате проведенных исследований получен лабораторный образец Витаплан, КЖ + коллоидный хитин с повышенной антагонистической и индуцирующей активностью по сравнению с исходной формой- Витаплан, КЖ.
Ключевые слова: лабораторный образец Витаплан, антибактериальная активность, фунгистатический эффект, коллоидный хитин, Cochliobolus sativus, индуцированная устойчивость
Поступила в редакцию: 23.04.2020
Разработка новых экологизированных технологий защиты сельскохозяйственных культур от вредных организмов - одно из самих перспективных направлений современной сельскохозяйственной науки. Исследователи всего мира уделяют все больше внимания этому направлению, создавая методы защиты растений, которые альтернативны химическим и безопасны для окружающей среды, нетоксичны для людей и животных (Максимов др.,2011, Zalila-Kolsi et al., 2016). Этим требованиям отвечают микробиологические препараты, являющиеся основным элементом современных технологий фитосанитарной оптимизации агроценозов. Принцип действия таких биопрепаратов отличается от классических химических средств защиты растений и основан на регуляции численности фитопатогенов.
В нашей стране широко известен биопрепарат Витаплан, КЖ созданный в ВИЗР на основе высокоактивных штаммов Bacillus subtilis (ВКМ B-2604D и ВКМ B-2605D) с широким спектром активности, который используется для защиты сельскохозяйственных культур от грибных и бактериальных болезней (Новикова и др., 2011, 2013, 2017). Защитное действие препаратов на основе B. subtilis обусловлено комплексом взаимодействий, например, антибиозом, лизисом клеток патогенных грибов, запуском системной индуцированной устойчивости (СИУ) и системной приобретенной устойчивости (СПУ), а также конкуренцией с патогенной микрофлорой за пространство для колонизации и за питательные вещества (Максимов и др.,2015; Новикова и др., 2011; Wang et al., 2015; Cao Y et al., 2012).
Считается, что антагонизм бактерий рода Bacillus ко многим фитопатогенным грибам обусловлен, в первую очередь, синтезом соединений антибиотической природы
Принята к печати: 29.11.2020
(Сидорова и др., 2018; Wang et al., 2015, 2018). Доказано также, что в разрушении клеточной стенки мицелиальных грибов участвует комплекс гидролитических ферментов, продуцируемых антагонистами, в том числе хитинолити-ческих (Актуганов и др., 2003, 2008; Широков и др., 2003). Хитинолитическая активность зачастую рассматривается как один из важнейших критериев, определяющий антагонистические свойства бактерий, и как признак, коррелирующий с их миколитической активностью и способностью утилизировать биомассу грибов (Актуганов и др., 2007). Среди внеклеточных гидролаз, способных разрушать структурные полисахариды клеточной стенки и лизиро-вать гифы грибов, наибольший интерес представляют хитиназы (Широков, 2003; Журавлева и др., 2004). В большинстве случаев хитиназы являются индуцибельными ферментами, образующимися в присутствии специфического субстрата.
В этой связи для усиления биологической активности лабораторного образца Витаплан, КЖ целесообразным представляется включение в среду для культивирования соединений, способствующих индукции хитиназ, в частности, хитин и хитинсодержащие субстраты.
С другой стороны, известно, что хитин, хитозан и их олигомеры считаются мощными элиситорами иммунитета растений (Yin et al.,2013; Deepmala et al.,2014). Эти природные полисахариды в последнее время активно используются для улучшения биологической активности биопрепаратов, так как предполагается, что хитин и хи-тозан могут индуцировать (отдельно или в комбинации с бактериальными клетками) системную устойчивость к фитопатогенам. Это нашло подтверждение в ряде работ, в которых было установлено, что добавление хитоза-на к микробам-антагонистам повышало эффективность
биоагентов в защите овощных культур и клубники от мучнистой росы (Abdel-Kader et al., 2012), а добавление хитина к штаммам Bacillus значительно сокращало увядание растений хлопка (Rajendran et al., 2008).
Цель работы состояла в оценке влияния различных форм хитина и хитозана при добавлении их в стандартную
Материа
В экспериментах использовали штаммы фитопа-тогенных микроорганизмов (Alternaría solani Sorauer, Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis (Smith) Davis et al (штамм101)), Cohliobolus sativus (S. Itod Kurib.) Drechler ex Dastur, Puccinia recóndita Roberge ex Desmaz f. sp. triticí), а также штаммы микробов-антагонистов B. subtilis ВКМ B-2604D и B. subtilis ВКМ В- 2605D из «Государственной коллекции микроорганизмов, патогенных для растений и их вредителей» Центра коллективного пользования научным оборудованием "Инновационные технологии защиты растений" ВИЗР. Возбудители темно-бурой пятнистости (St-19) и бурой ржавчины (Lr-19), получены из растений пшеницы сорта Галина в Ленинградской области, находящиеся в рабочей коллекции лаборатории ВИЗР.
Лабораторный образец, названный нами, Витаплан, КЖ, представляет собой культуральную жидкость высокоактивных штаммов Bacillus subtilis (B.subtilis ВКМ В-2604D и B. subtilis ВКМ В-2605D), полученных методом глубинного культивирования при соотношении 1:1 с титром жизнеспособных клеток B.subtilis 1010 КОЕ/мл. Для глубинного культивирования штаммов B.subtilis использовали кукурузно-меласссовую среду оптимизированного состава (кукурузный экстракт - 30г/л; меласса - 15г/л (рН=7.8). В состав культуральной жидкости входят споры штаммов-продуцентов, остатки питательной среды и метаболиты, выделенные в среду микроорганизмами в процессе ферментации.
Поскольку синтез хитиназ индуцируется только специфическими индукторами, такими как хитин и хитин-со-держащие субстраты, то в стандартную среду для глубинного культивирования включали хитин с молекулярной массой 100 кДа («Биопрогресс», РФ) в виде сухого порошка и коллоидной суспензии. Получение коллоидного хитина проводили по методу Roberts and Selitrennikoff (1988). Хитозан с молекулярной массой 60 кДа и степенью деа-цетилирования 85 % был получен методом окислительной деструкции (Muzzarelli, 1977) из хитозана с молекулярной массой 150 кДа («Биопрогресс», РФ). Коллоидный хитозан получали по модифицированному нами методу Ильиной и Варламова (2004), путем осаждения растворенного в водном 2.5 % растворе молочной кислоты хитозана (ММ 60 кДа) раствором гидроксида натрия (1.5 %) до доведения pH=8.
Для получения различных вариантов лабораторных образцов в исходную кукурузно-мелассовую среду вносили испытуемые вещества в соответствующей концентрации. Затем колбы с питательной средой стерилизовали, остужали и засевали 5-ти суточной культурой штаммов B.subtilis. Время культивирования - 3-е суток на орбитальной качалке (180 оборотов/мин) при Т = 27-28 °C. Варианты при культивировании штаммов в среде с добавлением хитина и других компонентов названы лабораторными образцами.
среду для глубинного культивирования штаммов B.subtilis, входящих в состав лабораторного образца Витаплан, КЖ, на синтез хитиназы, а также на антагонистическую и индуцирующую активность биопрепарата на примере пато-систем пшеница Cochliobolus sativus и Puccinia recondita.
и методы
Варианты лабораторных образцов Витаплан, КЖ:
1. Контроль - лабораторный образец Витаплан, КЖ - культуральная жидкость двух штаммов B. subtilis ВКМ В-2604D и B. subtilis ВКМ В-2605D в соотношении 1:1 (титр жизнеспособных клеток 1010 КОЕ/мл).
2. Лабораторный образец Витаплан, КЖ + хитин. Сухой хитин вводили в состав питательной среды при культивировании штаммов в концентрации 1.0 %.
3. Лабораторный образец Витаплан, КЖ + коллоидный хитин. Коллоидный хитин вводили в состав питательной среды для культивирования штаммов в концентрации 1.0 % (из расчета на сухой вес хитина).
4. Лабораторный образец Витаплан, КЖ + коллоидный хитозан. Коллоидный хитозан вводили в состав питательной среды для культивирования штаммов в концентрации 1.0 % (из расчета на сухой вес хитозана).
Титр жизнеспособных клеток определяли стандартным методом серийных разведений с последующим высевом на агаризованную среду СПА и подсчетом количества выросших колоний (КОЕ/мл).
Для лабораторных опытов in vitro использовали следующие агаризованные питательные среды (Билай, 1982): синтетическая среда Чапека: NaNO3 - 2г, KH2PO4 - 1г, MgSO4 - 0.5г, KCl - 0.5г, FeSO4 - 0.01г, сахароза - 20г, агар-агар - 20г, вода - 1л (Биокомпас-С); сухой питательный агар (СПА) на основе гидролизата рыбной муки (НПО «Микроген»).
Оценку способности штаммов B. subtilis биопрепарата Витаплан к синтезу внеклеточных хитиназ проводили чашечным экспресс-методом (Rasul et al., 2015, Adhikari et al., 2017). Для выявления хитиназной активности использовали агаризованную среду Чапека, куда добавляли коллоидный хитин (1.0 %). Активность хитиназы оценивали по величине зон просветления вокруг лунок, куда при помощи стерильной пипетки вносили культуральную жидкость (0.2 мл) полученных образцов и выражали в условных единицах в виде диаметра зон гидролиза непрозрачного субстрата (коллоидного хитина) в мм.
Оценку антибактериальной активности образцов по отношению к возбудителю бактериального рака томатов C. michiganensis (штамм 101) и антигрибной активности по отношению к возбудителю альтернариоза томата A. solani проводили методом бумажных дисков по диаметру зоны лизиса тест-культур фитопатогенов на агаризованной питательной среде (Билай, 1982). Для этого поверхность агаризованных сред в чашках Петри засевали сплошным газоном суспензией тест-культуры с титром 105 КОЕ/мл, а затем на поверхность агара помещали стерильные бумажные фильтры диаметром 8 мм, на которые пипеткой наносили суспензию (0.1 мл) лабораторного образца с титром бактериальных клеток 1010 КОЕ/мл. Выращивание тест-культур проводили в термостате при 22-25 °C в течение 3-5 суток.
Изучение прямого фунгистатического действия исследуемых образцов проводили in vitro методом агаровых блоков (Билай, 1982). В стерильные чашки Петри разливали охлажденную до 40 °C агаризованную среду Чапека. После застывания на поверхность среды равномерно наносили суспензии испытуемых образцов (0.2 мл), а затем помещали блоки 10 суточного микромицета C. sativus диаметром 6 мм. В качестве контроля служили чашки с агаризованной средой Чапека с блоками тест-культуры без испытуемых образцов. Чашки инкубировали в темноте при 25 °C. Диаметры колоний гриба измеряли на 3-е, 5-е, 7-е сутки совместного культивирования, после чего оценивали фунгистатическое действие испытуемых образцов по формуле Эббота:
П = Дк-Доп/ Дк х 100, где П - подавление роста гриба по сравнению
с контролем, %; Дк - диаметр колонии гриба в контроле, мм; Доп - диаметр колонии гриба в опыте, мм.
Повторность опыта 3-х кратная.
Опыты по оценке индуцирующей активности образцов проводили методом отделенных листьев (Михайлова, 2012). Для оценки индуцирующей активности 7-дневные проростки пшеницы сорта Саратовская 29 опрыскивали исследуемыми растворами лабораторных образцов за 24 ч до инокуляции патогеном. Для опрыскивания растений культуральную жидкость Витаплан, КЖ, и Витаплана, КЖ
+ коллоидный хитин разводили дистиллированной водой в 10 раз (титр рабочего раствора составил 109 КОЕ/мл). В контрольных вариантах растения пшеницы обрабатывали водой и 0.1 % коллоидным хитином.
Заражение листьев пшеницы проводили суспензией спор (4000 спор/мл) гемибиотрофа C. sativus и суспензией пустул биотрофа P. recóndita (4000 пустул/мл). Интенсивность развития болезни листьев пшеницы оценивали при инокуляции C. sativus на 4-е сутки после заражения, а при инокуляции P. recóndita на 7-е сутки после заражения по степени поражения площади листа. Все опыты проводили в 3-кратной повторности, полученные данные обрабатывали с использованием методов описательной статистики (на основе стандартных ошибок средних ±SEM, 95 % доверительных интервалов и t-критерия Стьюдента).
Статическая обработка
Все опыты проводили в 3-кратной повторности, полученные данные обрабатывали с использованием методов описательной статистики (на основе стандартных ошибок средних ±SEM, 95 % доверительных интервалов и t-критерия Стьюдента). В табл. 2 приведены средние арифметические значения и их доверительные интервалы, рассчитанные по стандартным ошибкам. Уровень различий между средними значениями в табл. 1 и 3 определяли по критерию наименьшей существенной разницы (НСР) при р < 0.05).
Результаты
Включение хитина и хитозана в среду при глубинном культивировании штаммов В. suЫШs не оказало влияния на концентрацию клеток бактерий; титр клеток штаммов во всех вариантах опыта был одинаковым (табл. 1). Антагонистическая активность испытуемых образцов №1 и №3
в отношении фитопатогенных организмов была на уровне контроля. Введение в среду при глубинном культивировании штаммов В. subtШs коллоидного хитина повышало антагонистическую активность образца №2 в отношении обеих тест-культур - А. solani, С. michiganensis (табл. 1).
Таблица1. Влияние коллоидного хитозана, сухого и коллоидного хитина при глубинном культивировании штаммов (B. subtilis ВКМ B-2604D) и (B. subtilis ВКМ B-2605D) в стандартной питательной среде на число клеток
и его антагонистическую активность Table 1. Influence of colloidal chitosan, dry and colloidal chitin during submerged cultivation of strains (B. subtilis VKM B-2604D) and (B. subtilis VKM B-2605D) of laboratory sample Vitaplan, CL in a standard nutrient medium
on the number of cells and its antagonistic activity
Вариант опыта, Титр штамма-продуцента, 'Диаметр зоны отсутствия роста, мм
лабораторные образцы КОЕ/мл A. solani, 5 сутки C. michiganensis 101, 2 сутки
Витаплан, КЖ. (контроль) 1010 40.3±0.2 31.9±0.2
1. Витаплан, КЖ + 1 % сухой хитин 1010 37.8±0.2 31.9±0.2
2. Витаплан, КЖ + 1 % коллоидный хитин 1010 43.6±0.2 34.8±0.1
3. Витаплан, КЖ + 1 % коллоидный хитозан 1010 36.0±0.15 31.6±0.1
НСР 0.05 1.1 0.9
* Д - среднее из трех значений
Таким образом, экспериментально показано, что лабораторный образец Витаплан, КЖ + коллоидный хитин обладает повышенной антагонистической активностью по отношению к тест объектам - A. solani, C. michiganensis (штамм 101).
Сравнительная оценка способности штаммов-продуцентов B. subtilis биопрепарата Витаплан к синтезу внеклеточных хитиназ показала, что штаммы B. subtilis ВКМ B-2604D и ВКМ B-2605D, составляющие основу лабораторных образцов Витаплан, КЖ, не обладают конститутивным синтезом внеклеточной хитиназы. Из всех
вариантов опыта только при глубинном культивировании в среде, содержащей коллоидный хитин, была обнаружена способность этих штаммов к синтезу индуцибильной хитиназы, активность которой на 8 сутки опыта составила 34±0.5 мм (диаметр зоны просветления на агаризованной среде вследствие расщепления коллоидного хитина).
На данном этапе исследований нашей задачей был подбор для включения в состав оптимальной для глубинного культивирования бактерии В. suЫШs среды, той формы полисахарида, которая позволит штамму-антагонисту синтезировать индуцибильную хитиназу и демонстрировать
повышенную антагонистическую активность по сравнению с исходным образцом.
На основании этих критериев был отобран лабораторный образец Витаплан, КЖ+ коллоидный хитин, как наиболее перспективный для изучения антигрибной активности по отношению к микромицету С. sativus и способности индуцировать устойчивость пшеницы к темно-бурой пятнистости и бурой ржавчине.
Высокая антигрибная активность лабораторных образцов Витаплан, КЖ и Витаплан, КЖ + коллоидный хитин подтверждена и по отношению к микромицету С. sativus (табл.3). Так, на 7 сутки опыта образец Витаплан, КЖ подавлял рост мицелия С. sativus на 81.2 %; образец Ви-таплан, КЖ + коллоидный хитин ингибировал рост этого микромицета на 88.1 % (табл. 2).
Таблица 2. Влияние различных лабораторных образцов Витаплана КЖ на линейный рост гриба Cochliobolus sativus Table 2. Influence of laboratory sample Vitaplan, CL formulation on the mycelial growth of Cochliobolus sativus
Вариант опыта, лабораторный образец Титр, КОЕ/мл Ингибиров 5- *Д мм ание линейного рос сутки % ингибирования та мицелия гриб 7- *Д мм а C.sativus, % сутки % ингибирования
Контроль Витаплан, КЖ Витаплан, КЖ + коллоидный хитин 1 % 1010 1010 52.5± 0.5 13.5±0.5 8.0±0.2 74.3 84.9 80.0± 1.2 15.0±1.2 9.5±1.0 81.2 88.1
* Д - среднее из трех значений.
Более высокий фунгистатический эффект лабораторного образца Витаплан КЖ + коллоидный хитин по сравнению с исходным, по всей видимости, является результатом совместного действия антибиотических веществ штаммов B. subtilis и способности индуцибельной хитина-зы, лизировать клеточные стенки микромицета C. sativus. Полученные результаты согласуются с исследованиями Актуганова и др. (2007, 2008), которые продемонстрировали способность миколитических ферментов штаммов Bacillus и именно хитиназы, лизировать клеточные стенки микромицета C. sativus.
Известно, что штаммы Bacillus spp. могут не только непосредственно подавлять жизнедеятельность вредных организмов антибиотическими веществами и гидролитическими ферментами, но и влиять на их развитие опосредованно через активацию защитных механизмов самого хозяина, т.е. развивать системную устойчивость (Максимов и др. 2015; Wang et al. 2018).
Следующей задачей исследования была оценка влияния коллоидного хитина, включенного в среду для культивирования бактерии B. subtilis, на индуцирующую активность лабораторных образцов Витаплана, КЖ (табл. 3).
Таблица 3. Влияние различных лабораторных образцов Витаплана, КЖ на устойчивость пшеницы к темно-бурой пятнистости и бурой ржавчине, (метод отделенных листьев, сорт Саратовская 29) Table 3. Effect of spraying Vitaplan, CL formulation on wheat resistance to Puccinia recóndita and Cochliobolus sativus
Вариант опыта, лабораторный образец Титр штаммов продуцентов, КОЕ/мл Поражение л! Темно-бурая пятнистость, НСР0.05=45 стьев, % Бурая ржавчина, НСР0.05=90
Контроль (вода) Коллоидный хитин 0.1 % Витаплан, КЖ Витаплан, КЖ+ коллоидный хитин 1 % 109 109 65 65 50 40 90 90 80 70
В контрольных растениях пшеницы, инфицированных С. sativus, площадь поражения листьев составила 65 %. Предварительная обработка растений пшеницы лабораторным образцом Витаплан, КЖ с последующим заражением возбудителем темно-бурой пятнистости С. sativus, снизила площадь поражения листьев на 15 % по отношению к контролю. Опрыскивание растений пшеницы лабораторным образцом Витаплана, КЖ + коллоидный хитин сократило пораженность листьев на 25 % по отношению к контролю, что свидетельствует о более высокой индуцирующей активности этого образца по сравнению с исходным. В опыте с заражением пшеницы бурой ржавчиной предобработка растений Витапланом, КЖ уменьшила
пораженность листьев на 10 % по отношению к контролю, в то время как лабораторный образец Витаплан, КЖ + коллоидный хитин, показал более высокий индуцирующий эффект, снизив площадь поражения листьев на 20 %.
Коллоидный хитин (0.1 %) не повлиял на интенсивность развития болезней. Хитин - нейтрально заряженный линейный полимер, цепь которого состоит из ^аце-тил гликопиранозных звеньев. Хитин не растворим в воде и коллоидная суспензия полимера имеет низкую биологическую активность, так как для ее проявления необходимо определенное соотношение ацетильных и аминных групп в молекуле (Тютерев, 2014).
Обсуждение
В плане обсуждения механизмов, лежащих в основе взаимоотношений в патосистемах пшеница - C. sativus и P. recóndita, можно говорить, как о прямом биоцидном воздействии бактерий рода Bacillus на микромицеты, так и об их способности усиливать системную устойчивость
растений. Прямое биоцидное действие B. subtilis связывают с синтезом ими различных метаболитов с антибиотической активностью - антибиотиков, биосурфактантов, сидерофоров и др. (Cao et al.2012; Rezuanul et al.2012; Wang et al., 2015). В некоторых случаях снижение болезни
связано главным образом с антибиозом, как например, согласно исследованиям Romero et al (2007) шурин и фен-гицин играют основную роль в антагонизме B. subtilis по отношению к грибу Podosphaera fusca, вызывающего мучнистую росу тыквенных.
Согласно исследованиям Шенина и др., (1995) и Новиковой и др. (2011) высокая биологическая эффективность биопрепаратов обусловлена синтезом штаммами B. subtilis метаболитного комплекса сложного состава, включающего пептидные и полиеновые антибиотики. Следовательно, экспериментально установленная высокая фунгистати-ческая активность образца Витаплан, КЖ по отношению к C. sativus (81.2 %) (табл.2), по-видимому, определяется синтезом штаммами B. subtilis антибиотических веществ, подавляющих или замедляющих рост фитопатогена. Повышенная фунгистатическая активность образца Вита-план, КЖ + коллоидный хитин по отношению к C. sativus (88.1 %), по всей видимости, является результатом совместного действия метаболитного комплекса штаммов B. subtilis и хитиназы, синтезируемой ими (табл. 2).
Помимо прямого антагонистического действия на клетки возбудителя, бациллы способны повышать болезнеустойчивость растений синтезируя соединения - элиси-торы, благодаря которым происходит активация системной индуцированной устойчивости (СИУ) и системной приобретенной устойчивости (СПУ) (Ongena et al., 2007; Ahn et al., 2002). Элиситорами, запускающими защитный механизм растения, могут быть белки, липопептиды, полисахариды и другие соединения, ассоциированные с клеточной стенкой бактерии B. subtilis (Van der Ent S et al., 2009; Van Loon et al., 2007; De Vleesschauwer D., Höfte M., 2009), а также антибиотики и биосурфактанты (Ongena et al., 2007, 2010; Falardeau et al., 2013). Бактериальные метаболиты, обладающие свойствами индукторов устойчивости, включают цепочку взаимосвязанных друг с другом защитных реакций, в том числе образование активных форм кислорода, фосфорилирование белков, запуск базовых механизмов фитоиммунитета, которые приводят к развитию системной устойчивости (Максимов и др., 2014, 2015; Pieterse et al., 2014; Veselova et al. 2014). Так, Park et al., (2007) на примере пяти штаммов Bacillus показали, что снижение развития ризоктониоза у томатов происходит не из-за прямого антагонизма, а в результате активации генов устойчивости растения-хозяина.
Индуцирующая активность исходного образца Вита-план, КЖ проявилась в понижении пораженности листьев пшеницы C. sativus и P. recóndita на 15-10 % (соответственно) по отношению к контролю (табл. 3). Полученные результаты согласуются с имеющимися в литературе
Библиографический
Актуганов ГЭ, Мелентьев АИ, Кузьмина ЛЮ, Галимзяно-ва НФ и др. (2003) Хитинолитическая активность бактерий Bacillus Cohn - антагонистов фитопатогенных грибов. Микробиология 72(3):356-360 Актуганов ГЭ, Галимзянова НФ, Мелентьев АИ, Кузьмина Л.Ю (2007) Внеклеточные гидролазы штамма Basillus sp. 739 и их участие в лизисе клеточных стенок микро-мицетов. Микробиология 76:471-479 Актуганов ГЭ, Галимзянова НФ, Мелентьев АИ, Широков АВ (2008) Исследование миколитических свойств
данными. Так, по мнению Kriuchkova (2017) снижение развития болезни в результате опрыскивания листьев ячменя фильтратом культуральной жидкости штамма B. amyloliquefaciens перед инокуляцией C. sativus, обусловлено запуском индуцированной устойчивости. По данным Максимова и др. (2015), штамм B. subtilis 26Д индуцировал системную устойчивость растений пшеницы инфицированных гемибиотрофным грибом Septoria nodorum. В своей работе Jasem et al (2018) выявили несколько бактериальных штаммов, в основном относящихся к Bacillus spp., которые эффективно подавляли развитие офиоболеза при опрыскивании всходов пшеницы до инокуляции патогеном, причем индукция защитных реакций растений была основным механизмом подавления развития болезни.
По нашему мнению, обнаруженная у образца Вита-план, КЖ + коллоидный хитин более высокая способность индуцировать устойчивость пшеницы к темно-бурой пятнистости и бурой ржавчине по сравнению с исходным, обусловлена хитоолигосахаридами, образующимися при гидролизе коллоидного хитина хитиназами бактерии (San-Lang et al., 2006). Известно, что хитоолигосахариды являются эффективными элиситорами индуцированной устойчивости в растениях (Yin et al., 2013; Deepmala et al, 2014). В результате их взаимодействия с рецепторами происходит активация комплекса защитных реакций неспецифического иммунитета растений. Механизм индуцирующего действия хитоолигосахаридов включает активацию генов защитных белков, в том числе растительной хитиназы (Kavitha et al., 2012), усиление генерации активных форм кислорода, прежде всего Н2О2, которая, в свою очередь, может также выполнять сигнальную функцию, активируя гены белков через редокс-контроль транскрипционных факторов или с помощью взаимодействия с другими сигнальными компонентами (Torres, 2010; Sewelam et al., 2013).
Полученные нами данные согласуются с работами, утверждающими, что добавление хитина при культивировании штаммов Bacillus позволяет увеличить их эффективность; например, в защите хлопка от ризоктониозного увядания (Rajendran, 2008), гороха от фузариозного увядания, а арахиса от микромицета A. niger (Manjula, Podile, 2001).
Таким образом, в результате проведенных исследований получен лабораторный образец Витаплан, КЖ + коллоидный хитин с повышенной биоцидной и индуцирующей активностью по сравнению с исходной формой Витаплан, КЖ.
список (References)
аэробных спорообразующих бактерий - продуцентов внеклеточных хитиназ. Микробиология 77(6):788-797 Андреева ЕИ, ред (1990) Методические рекомендации по испытанию химических веществ на фунгицидную активность. Черкассы: НИИТЭХИМ. 67 с. Билай ВИ, ред (1982) Методы экспериментальной микологии. К.: Наукова думка. 275 с. Журавлева НВ, Лукьянов ПА (2004) Хитинолитические ферменты: источники, характеристика и применение в биотехнологии. Вестник ДВО РАН (3):76-86
Ильина А.В., Варламов В.П. (2004) Гидролиз хитозана в молочной кислоте. Прикладная биохимия и микробиология 40(3):354-358 Максимов ИВ, Абизгильдина РР, Пусенкова ЛИ (2011) Стимулирующие рост растений микроорганизмы как альтернатива химическим средствам защиты от патогенов. Прикладная биохимия и микробиология 47(4):373-385 Максимов ИВ, Абизгильдина РР, Сорокань АВ, Бурха-нова ГФ (2014) Регуляция пероксидазной активности под влиянием сигнальных молекул и Bacillus subtilis 26Д инфицированных Phytophthora infestans растениях картофеля. Прикладная биохимия и микробиология 50(2):197-202
Максимов ИВ, Веселова СВ, Нужная ТВ, Сарварова ЕР и др. (2015) Стимулирующие рост растений бактерии в регуляции устойчивости растений к стрессовым факторам. Физиология растений 62(6):763-775 Михайлова ЛА, Мироненко НВ, Коваленко НМ (2012) Желтая пятнистость пшеницы. Методические указания по изучению популяций возбудителя желтой пятнистости Pyrenophora tritici-repentis и устойчивости сортов. СПб: ВИЗР. 56 с. Новикова ИИ, Шенин ЮД (2011) Выделение, идентификация и антигрибная активность метаболитов комплекса Гамаир, образуемого штаммом Bacillus subtilis М-22 -продуцентом биопрепарата для защиты растений от микозов и бактериозов. Биотехнология 47(98):45-58. Новикова ИИ, Бойкова ИВ, Павлюшин ВА, Зейрук ВН и др. (2013) Перспективы использования биопрепаратов на основе микробов-антагонистов для защиты картофеля от болезней при хранении. Вестник защиты растений 4:12-21
Новикова ИИ, Титова ЮА, Бойкова ИВ, Зейрук ВН и др. (2017) Биологическое обоснование оптимизации препаративных форм биопрепаратов на основе микробов антагонистов для контроля популяций фитопатогенных грибов и бактерий - возбудителей болезней растений. Вестник защиты растений 3(93):16-23 Сидорова ТМ, Асатурова АМ, Хомяк АИ (2018) Биологически активные метаболиты Bacillus subtilis и их роль в контроле фитопатогенных микроорганизмов (обзор). Сельскохозяйственная биология 53(1):29-37. https://doi. org/10.15389/agrobiology.2018.1.29rus Тютерев СЛ (2014) Природные и синтетические индукторы устойчивости растений к болезням. СПб: ВИЗР. 212 с.
Шенин ЮД, Новикова ИИ, Кругликова ЛФ, Калько ГВ (1995) Характеристика Алирина Б, основного компонента фунгицидного препарата, продуцируемого штаммом Bacillus subtilis-10-ВИЗР. Антибиотики и химиотерапия 40(5):3-7
Широков АВ (2003) Хитинолитическая активность бактерий Bacillus Cohn - антагонистов фитопатогенных грибов. Микробиология 72(3):356-360. Abdel-Kader MM, El-Mougy NS, Aly MD, Lashin SM (2012) Integration of biological and fungicidal alternatives for controlling foliar diseases of vegetables under greenhouse conditions. Int J Agric Forestry 2(2): 8-48 https://doi. org/10.5923/j.ijaf.20120202.07 Adhikari M, Yadav DR, Kim SW, Um YH, Kim HS et al (2017) Biological control of bacterial fruit blotch of
watermelon pathogen (Acidovorax citrulli) with rhizosphere associated bacteria. Plant Pathol J 33(2):170-183. https:// doi.org/10.5423/ppj.oa.09.2016.0187 Ahn I-P, Park K, Kim C-H. (2002) Rhizobacteria-induced resistance perturbs viral disease progress and triggers defense-related gene expression. Mol Cells 13 (2):302-308. Cao Y, Xu Z, Ling N, Yuan Y, Yang X et al (2012) Isolation and identification of lipopeptides produced by B. subtilis SQR 9 for suppressing Fusarium wilt of cucumber. Sci Hortic 135:32-39. http://doi.org/10.1016Zj.scienta.2011.12.002 Deepmala K, Hemantaranjan A, Bharti S, Nishant Bhanu A (2014) A future perspective in crop protection: chitosan and its oligosaccharides. Adv Plants Agric Res 1(1):23-30. https://doi.org/10.15406/apar.2014.01.00006 De Vleesschauwer D, Höfte M (2009). Rhizobacteria-induced
systemic resistance. Adv Bot Res 51:223-281 Falardeau J, Wise C, Novitsky L, Avis TJ (2013) Ecological and mechanistic insights into the direct and indirect antimicrobial properties of Bacillus subtilis lipopeptides on plant pathogens. J Chem Ecol 39:869-878. http://doi. org/10.1007/s10886-013-0319-7 Jasem AM, Sharii R, Abbasi S (2018) Induced systemic resistance to wheat take-all disease by probiotic bacteria. J Plant Protect Res 58 (3):304-310. https://doi.org/10.24425/ jppr.2018.124639 Kavitha K, Nakkeeran S, Chandrasekar G (2012) Rhizobacterial-mediated induction of defense enzymes to enhance the resistance of turmeric (Curcuma longa L.) to Pythium aphanidermatum causing rhizome rot. Arch Phytopathol Plant Protect 45:199-219. Kriuchkova LO (2017) Biological control of leaf disease of
barley with Bacillus strain. Biologija 63(3):289-295. Manjula K, Podile A (2001) Chitin supplemented formulations improve biocontrol and plant growth promoting efficiency of Bacillus subtilis AF 1. Can J Microbiol 47(7):618-625. Muzzarelli RA (1977) Chitin. Oxford: Pergamon Press. 309 p. Ongena M, Adam A, Jordan E, Paqiot M, Brans A et al (2007) Surfactin and fengycin lipopeptides of Basillus subtilis as elicitors of induced systemic resistance in plants. Environ Microbiol 9:1084-1090. https://doi. org/10.1111/j.1462-2920.2006.01202.x Ongena M, Henry G, Thonart P (2010) The role of cyclic lipopeptides in the biocontrol activity of Bacillus subtilis. Recent Developments in Management of Plant Diseases (Plant Pathology in the 21st century). V 1 / Eds. Gisi U., Chet L., Guillino M.L., Dordrecht, Heidelberg, London New York: Springer Science+Business Media B.V 1:59-69. https://doi.org/10.1007/978-1-4020-8804-9_5 Park K, Diby P, Kim YK et al (2007) Induced systemic resistance by Bacillus vallismortis EXTN-1 suppressed bacterial wilt in tomato caused by Ralstonia solanacearum. Plant Pathol J 23(1):2225. https://doi.org/10.5423/PPJ.2007.23.L022 Pieterse CM, Zamioudis C, Berendsen RL, Weller DM,van Wees SC et al (2014) Induced Systemic Resistance by Beneficial Microbes. Annu Rev Phytopathol 52:347-375. https://doi.org/10.1146/annurev-phyto-082712-102340 Rajendran L, Samiyappan R (2008) Endophytic Bacillus species confer increased resistance in cotton against damping off disease caused by Rhizoctonia solani. Plant Pathol J 7(1):1-12. https://doi.org/10.3923/ppj.2008.L12
Rasul F, Afroz A, Rashid U Mehmood S, Sughra K et al (2015) Screening and characterization of cellulase producing bacteria from soil and waste (molasses) of sugar industry. Int J Biosci 6(3):230-238. https://doi/org/10.12692/ ijb/6.3.230-238
Rezuanul I, Yong T, Yong S, Chi H (2012) Isolation and identification of antifungal compounds from Bacillus subtilis C9 inhibiting the growth of plant pathogenic fungi. Mycobiology 40(1):59-66. https://doi.org/10.5941/ MYCO.2012.40.1.059 Roberts W K, Selitrennikoff CP (1988) Plant and bacterial chitinases differin antifungal activity. J Gen Microbiol 134:169-176. https://doi.org/10.1099/00221287-134-1-169 Romero D, de Vicente A, Rakotoaly RH, Dufour SE, Arrebola E et al (2007) The iturin and fengycin families of lipopeptides arekey factors in antagonism of Bacillus subtilis toward Podosphaera fusca. Mol Plant Microbe Interact 20(4):430-40. https://doi.org/10.1094/MPMI-20-4-0430 San-Lang W, Tzu-Yin L, Yue-Horng Y, Hui-Fen L,Yu-Jen C (2006)Bioconversion of shellfish chitin wastes for the production of Bacillus subtilis W-118 chitinase. Carbohydr Res 341(15):2507-2515. https://doi.org/10.1016/j. carres.2006.06.027 Sewelam N, Kazan K, Thomas-Hall S.R., Kidd B.N., Manners J.M et al (2013) Ethylene response factor 6 is a regulator of reactive oxygen species signaling inArabidopsis. PLoS ONE 8(8):e70289. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070289 Torres MA (2010) ROS in biotic interactions. Physiol. Plant. 138(4):414-429. https://doi. org/10.1111/j.1399-3054.2009.01326.x
Yin H, Li Y, Zhang HY, Wang WX, Lu H et al (2013) Chitosan Oligosaccharides-Triggered Innate Immunity Contributes to Oilseed Rape Resistance against Sclerotinia Sclerotiorum. Int J Plant Sci 174(4): 722-732. https://doi. org/10.1086/669721 Zalila-Kolsi I, Ben Mahmoud A, Hacina A, Sellami S et al (2016) Antagonist effects of Bacillus spp. strains against Fusarium graminearum for protection of durum wheat (Triticum turgidum L. subsp. durum). Microbiol Res 192:148-158. http://doi.org/10.1016Zj.micres.2016.06.012 Veselova SV, Nuzhnaya TV, Maksimov IV (2014) Role of jasmonic acid in interaction of plants with plant growth promoting rhizobacteria during fungal pathogenesis. In: Morrison L (ed) Jasmonic acid (Chapter: 3). New York: Nova Sci. Publ. 33-66 Van der Ent S, van Wees S, Pieterse C (2009) Jasmonate signaling in plant interactions with resistance-inducing beneficial microbes. Phytochemistry 70(13-14):1581-1588. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2009.06.009 Van Loon LC (2007) Plant responses to plant growth-promoting rhizobacteria. Eur J Plant Pathol 119:243-254. https://doi.org/10.1007/978-1-4020-6776-1_2 Wang T, Liang Y, Wu M, Chen Z et al (2015) Natural products from Bacillus subtilis with antimicrobial properties. Chinese J Chem Eng 23(4):744-754. https://doi.org/10.1016/j. cjche.2014.05.020 Wang XQ, Zhao DL, Shen LL, Jing CL et al (2018) Application and mechanisms of Bacillus subtilis in biological control of plant disease. In: Meena VS (ed) Role of rhizospheric microbes in soil. Springer, Singapore. 225-250. https://doi. org/10.1007/978-981-10-8402-7-9.
Translation of Russian References
Aktuganov GE, Melentyev AI, Kuzmina LJ, Galimzyanova NF, et al (2003) Chitinolytic activity of bacteria Bacillus Cohn, antagonists of phytopathogenic fungi. Mikrobiologiia 72(3):356-360 (In Russian) Aktuganov GE, Galimzyanova NF, Melentyev AI, Kuzmina L.Yu (2007) Extracellular hydrolases of the strain Basillus sp. 739 and their participation in the lysis of cell walls of micromycetes. Mikrobiologiia 76:471-479 (In Russian) Aktuganov GE, Galimzyanova NF, Melentyev AI, Shirokov AV (2008) Study of the mycolytic properties of aerobic spore-forming bacteria - producers of extracellular chitinases. Mikrobiologiia 77(6):788-797 (In Russian) Andreeva EI, ed (1990) Metodicheskie rekomendatsii po ispytaniyu khimicheskikh veshchestv na fungitsidnuyu aktivnost [Guidelines for testing chemicals for fungicidal activity]. Cherkassy:NIITEKHIM 67p. (In Russian) Bilay VI, ed (1982) Metody eksperimentalnoy mikologii [Methods of experimental mycology]. Kiev: Naukova Dumka. 275 p (In Russian) Zhuravleva NV, Lukyanov PA (2004) Chitinolytic enzymes: sources, characteristics and applications in biotechnology. Vestnik of FEB RAS 3(76-86) (In Russian) Maksimov IV, Abizgildina PP, Pusenkova LI (2011) Plant growth-promoting microorganisms as an alternative to chemical means of protection against pathogens. Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya 47:73-385 (In Russian) Maksimov IV, Abizgildina RR, Sorokan AV, Burhanova GF (2014) Regulyaciya peroksidaznoj aktivnosti pod vliyaniem
signalnykh molekul i Bacillus subtilis 26D inficirovannyh Phytophthora infestans rasteniyah kartofelya. Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya 50(2):197-202 (In Russian) Maksimov IV, Veselova SV, Nuzhny TV, Sarvarova EP et al (2015) Stimulating plant growth bacteria in the regulation of plant resistance to stress factors. Fiziologiya rasteniy 62(6):763-775 (In Russian) Mikhailova LA, Mironenko NV, Kovalenko NM (2012) Zheltaya pyatnistost pshenitsy. Metodicheskie ukazaniya po izucheniyu populyaciy vozbuditelya zheltoy pyatnistosti Pyrenophora tritici-repentis i ustoychivosti sortov. [Yellow spot of wheat. Guidelines for the study of populations of the yellow spotted pathogen Pyrenophora tritici-repentis and the resistance of varieties]. SPb:VIZR 56p (In Russian) Novikova II, Shenin YuD (2011) Isolation, identification and antifungal activity of metabolites of the Gamair complex, formed by the Bacillus subtilis M-22 strain, a producer of the biological agent for plant protection against mycoses and bacterioses. Biotechnology 47(98):45-58 (In Russian) Novikova II, Boykova IV, Pavlyushin VA, Zeyruk VN et al (2013) Prospects for the use of biological products based on antagonist microbes to protect potatoes from diseases during storage. Bulletin of plant protection 4:12-21 (In Russian) Novikova II, Titova YuA, Boykova I.V, Zeyruk VN et al (2017) Biological justification for the optimization of preparative forms of biological preparations based on antagonist microbes to control populations of phytopathogenic fungi
and bacteria that cause plant diseases. Bulletin of plant protection 3:16-23 (In Russian) Sidorova TM, Asaturova AM, Homyak AI (2018) Biologically active metabolites of Bacillus subtilis and their role in the control of phytopathogenic microorganisms (review). Agricultural biology 53(1):29-37. https://doi.org/10.15389/ agrobiology.2018.1.29rus (In Russian) Tyuterev SL (2014) Natural and synthetic inducers of plant disease resistance. SPb:VIZR 212 p. (In Russian)
Shanin YuD, Novikova II, Kruglikova LF, Kalko GV (1995) Harakteristika Alirina B, osnovnogo komponenta fungicidnogo preparata, produciruemogo shtammom Bacillus subtilis-10-VIZR. Antibiotiki i khimioterapiya 40(5):3-7 (In Russian) Shirokov AB (2003) Chitinolytic activity of bacteria Bacillus Cohn - antagonists of pathogenic fungi. Mikrobiologiia 72(3):356-360 (In Russian)
Plant Protection News, 2020, 103(4), p. 233-240
OECD+WoS: 4.01+AM (Agronomy) https://doi.org/10.31993/2308-6459-2020-103-4-13272
THE EFFECT OF CHITIN ON THE BIOLOGICAL ACTIVITY OF BACILLUS SUBTILIS STRAINS
I.L. Krasnobaeva, N.M. Kovalenko*, E.V. Popova
All-Russian Institute of Plant Protection, St. Petersburg, Russia
*corresponding author, e-mail: nadyakov@mail.ru
The aim of the work was to assess the effect of various forms of chitin and chitosan during submerged cultivation of Bacillus subtilis strains, which form the basis of the laboratory sample Vitaplan, CL, on the synthesis of chitinase, as well as on the antagonistic activity and inducing effect of B. subtilis strains in the pathosystems of wheat - Cochliobolus sativus and Puccinia recondita f. sp. tritici. The inclusion of chitin in the form of dry powder or chitin and chitosan in the form of a colloidal suspension into the medium for deep cultivation of bacteria showed that only colloidal chitin increased the antagonistic activity of B. subtilis strains against test cultures of Alternaria solani and Clavibacter michiganensis. The ability of B. subtilis strains to synthesize extracellular chitinase when cultivated in a medium containing colloidal chitin was established. A higher fungistatic effect of the laboratory sample Vitaplan CL + colloidal chitin against Cohliobolus sativus was revealed as compared to the original sample. It was shown that the laboratory sample Vitaplan, CL + colloidal chitin increases the resistance of wheat to dark brown spot and brown rust 1.5-2.0 times more effectively as compared to Vitaplan, CL. As a result of the research, a laboratory sample of Vitaplan, CL + colloidal chitin was obtained with increased antagonistic and inducing activity as compared to Vitaplan, CL.
Keywords: biological control, Vitaplan, fungistatic activity, antagonistic effect, chitosan, chitin, induced resistance,
Triticum aestivum, Cochliobolus sativus, Puccinia recondita
Received: 23.04.2020
Accepted: 29.11.2020
