CC BY
21
ОРИгаНАЛЬНЫЕ CTATbRT original scientific articles
сельскохозяйственная микробиология
и микология / agricultural microbiology
and mycology
https://doi.org/10.30766/2072-9081.2022.23.4.515-526 УДК 579.87
Актинобиота корней Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin как потенциальный источник микробиологических препаратов для растениеводства
О 2022. И. Г. Широких10, Я. И. Назарова1, A.B. Бакулина1, И. А. Остерман2'3, А. Р. Белик3, Ю. А. Буюклян3, Н. А. Боков1, А. А. Широких1
1ФГБНУ «Федеральный аграрный научный центр Северо-Востока имени Н. В. Рудницкого», г. Киров, Российская Федерация 2АНООВО «Сколковский институт науки и технологий»», г. Москва, Российская Федерация
3Научно-технологический университет «Сириус», Научный центр генетики и наук о жизни, Краснодарский край, г. Сочи, Российская Федерация
В работе определена численность и структура комплексов актиномицетов, ассоциированных с корнями лекарственного растения - левзеи сафлоровидной (Rhapоnticum carthamoides (Willd.) Iljin) при длительном возделыг-вании на дерново-подзолистой почве. Общая численность актиномицетов в ризосфере изменялась в пределах (4,4-13,2)*105 КОЕ/г почвы, а в ризоплане - в пределах (7,6-24,1)^103 КОЕ/г корней. Комплекс мицелиальны/х прокариот представлен родами Streptomyces, Micromonospora, Streptosporangium, Streptoverticillium и олигоспоровыши формами. Стрептомицеты доминировали как в ризосфере, так и в ризоплане левзеи сафлоровидной. Из этих микролокусов c помощью селективным приемов выделено 30 культур мицелиальным прокариот. Исследованы куль-турально-морфологические и физиолого-биохимические свойства изолятов. Высокопроизводительный скрининг, проведенный с помощью двойной репортерной системы, выявил среди 19 изолятов, ассоциированным с корнями левзеи, способность продуцировать ингибиторы синтеза белка у четырех (21 %) культур стрептомицетов. ПЦР-детекция генов поликетидсинтетаз типа II не выявила среди ассоциированным с левзеей стрептомицетов их носителей. Значительная доля (67 %) изолятов стрептомицетов из ризосферы и ризопланы левзеи обладала умеренной и высокой целлюлазной активностью. Установлено, что большинство (92 %) стрептомицетов в комплексе ризопланы продуцируют индольные соединения (ИУК) в количестве 40±16,1 мкл/мл, до 61 % изолятов способны к синтезу водорастворимых метаболитов антифунгального действия. Выявлены новые перспективные для дальнейшего изучения штаммы стрептомицетов-антагонистов фитопатогенных грибов, целлюлолитиков и продуцентов ауксинов.
Ключевые слова: левзея сафлоровидная, стрептомицеты, антибиотическая активность, ауксины, деструкция целлюлозы, утилизация сахаров
Благодарности: работа выполнена при поддержке Минобрнауки РФ в рамках Государственного задания ФГБНУ «Федеральный аграрный научный центр Северо-Востока имени Н. В. Рудницкого» (тема № FNWE-2022-0005).
Авторы благодарят рецензентов за их вклад в экспертную оценку этой работы.
Конфликт интересов: авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.
Для цитирования: Широких И. Г., Назарова Я. И., Бакулина А. В., Остерман И. А., Белик А. Р., Буюклян Ю. А., Боков Н. А., Широких А. А. Актинобиота корней Rhapоnticum carthamoides (Willd.) Iljin как потенциальный источник микробиологических препаратов для растениеводства. Аграрная наука Евро-Северо-Востока. 2022;23(4):515-526. DOI: https://doi.Org/10.30766/2072-9081.2022.23.4.515-526
Поступила: 11.05.2022 Принята к публикации: 01.08.2022 Опубликована онлайн: 25.08.2022
Actinobiota of Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin roots
as potential source of microbiological preparations for cropping
© 2022. Irina G. Shirokikh^, Yanina I. Nazarova1, Anna V. Bakulinai, Ilya A. Osterman2'3, Albina R. Belik3, Julia A. Buiuklian3, Nikita A. Bokov1, Alexander A. Shirokikh1
1Federal Agricultural Research Center of the North-East named N. V. Rudnitsky, Kirov, Russian Federation
2Skolkovo Institute of Science and Technology, Moscow, Russian Federation 3Sirius University, Scientific Center of Genetics and Life Sciences, Krasnodar region, Sochi, Russian Federation
The paper determines the number and structure of actinomycete complexes associated with the roots of the medicinal plant - leuzea safflower (Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin) during long-term cultivation on sod-podzolic soil. The total number of actinomycetes in the rhizosphere varied within (4.4-13.2)*105 CFU/g of soil, and in the rhizoplane - within (7.6-24.1) xlO3 CFU/g of roots. The complex of mycelial prokaryotes is represented by the genera Streptomyces, Micromonospora, Streptosporangium, Streptoverticillium and oligospore forms. Streptomycetes dominated both in the rhizosphere and in the rhizoplane of leuzea safflower. From these microlocuses, 30 cultures of mycelial prokaryotes were isolated using selective techniques. The cultural-morphological and physiological-biochemical properties of the isolates were studied. High-performance screening conducted using a dual reporter system revealed among 19 isolates associated with leuzea roots the ability to produce protein synthesis inhibitors in four (21 %) streptomycetes cultures. PCR detection of type II polyketide synthetase genes did not reveal their carriers among streptomycetes associated with leuzea. A significant proportion (67 %) of streptomycetes isolates from the rhizosphere and rhizoplana of leuzea had moderate and high cellulase activity. It has been established that the majority (92 %) of streptomycetes in the rhizoplana complex produce indole compounds (IUC) in the amount of 40±16.1 mcl/ml, up to 61 % of isolates produce water-soluble metabolites of antifungal action. New strains of streptomyces antagonists ofphytopath-ogenic fungi, cellulolytics and auxin producers promisingfor further study have been identified.
Keywords: leuzea safflower, streptomycetes, antibiotic activity, auxins, cellulose destruction, sugar utilization
Acknowledgements: the research was carried out under the support of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation within the state assignment of Federal Agricultural Research Center of the North-East named N. V. Rudnitsky (theme No. FNWE-2022-0005)
The authors thank the reviewers for their contribution to the peer review of this work.
Conflict of interest: the authors declare no conflict of interest.
For citation: Shirokikh I. G., Nazarova Ya. I., Bakulina A. V., Osterman I. A., Belik A. R., Buiuklian Ju. A., Bokov N. A., Shirokikh A. A. Actinobiota of Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin roots as potential source of microbiological preparations for cropping. Agrarnaya nauka Evro-Severo-Vostoka = Agricultural Science Euro-North-East. 2022;23(4):515-526. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.30766/2072-9081.2022.23A515-526
Received: 24.03.2022 Accepted for publication: 01.08.2022 Published online: 25.08.2022
Микроорганизмы, обитающие в ризосфере растений, улучшают их снабжение элементами питания, увеличивают устойчивость к абиотическим стрессам и фитопатогенам, за что получили название PGPR (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria - ризобактерии, способствующие росту растений). Среди группы PGPR широко представлены актиномицеты, в особенности - виды рода Streptomyces [1, 2]. Благодаря синтезу большого количества биоактивных соединений (поликетиды, пептиды, макролиды, аминогликозиды, индолы и терпены), стрептомицеты играют особую роль в метаболизме растения-хозяина. Подобно другим колонизующим корни ризобактериям, актиномицеты могут проникать в сосудистую систему, а затем успешно развиваться в стеблях, листьях и других органах как эндофиты.
Колонизация внутренних тканей может происходить также из других частей растения, таких как листья, цветки, почки или семена, но большинство эндофитных актиномицетов были выделены именно из корней [3]. Работами последних десятилетий было показано, что особый интерес как продуценты биологически активных соединений для медицины и сельского хозяйства представляют актиномицеты, связанные с лекарственными растениями [4, 5]. Сообщалось об увеличении всхожести семян и усилении роста Phaseolus vulgaris (L.) в результате применения двух штаммов Streptomyces sp., выделенных из распространенного в странах Юго-Восточной Азии лекарственного растения Centella asiatica (L.) Urb. [6]. Стимуляцию роста растений авторы связывают с продукцией эндофитными стреп-
томицетами индолил-3-уксусной кислоты (ИУК). В работе японских ученых в качестве стимуляторов роста растений с ауксинопо-добной активностью рассматриваются птери-диновые кислоты А и В, синтезируемые штаммом Streptomyces hygroscopicus, который был выделен из папоротника (Pteridium aquilinum (L.) Kuhn) [7]. Актиномицеты из традиционного в арабских странах лекарственного растения Achillea fragrantissima (Forssk.) Sch. Bip. продуцировали хитиназы и сидерофоры, а также проявили антифунгальную активность в отношении фитопатогенов [8]. Продукция сидеро-форов описана также у актиномицетов, выделенных из трех лекарственных растений Индии: Aloe vera (L.) BURM. F, Mentha arven-sis (L.) и Ocimum sanctum (L.) [9].
Левзея сафлоровидная (Rhaponticum carthamoides (Willd.) Ilj in) - многолетнее лекарственное растение семейства сложноцветных. Из левзеи выделены фитоэкдисте-роиды, среди которых основная массовая доля приходится на 20-гидроксиэкдизон. Это соединение оказывает тонизирующие и адапто-генное действие. В традиционной медицине народов Сибири и Монголии левзея входит в состав сборов, употребляемых при болезнях легких, почек, желтухе, лихорадке и ангине [10]. Препараты левзеи сафлоровидной занесены в Государственную Фармакопею РФ [11].
Цель исследования - характеристика комплекса актиномицетов, ассоциированных с корнями левзеи сафлоровидной, и поиск среди них новых штаммов, пригодных к использованию в растениеводстве и земледелии.
Научная новизна. Ассоциативные симбиозы лекарственных растений на территории России изучены в настоящее время недостаточно. Ризосферная и эндофитная актинобиота левзеи сафлоровидной ранее не рассматривалась. Поиск новых ценных штаммов для разработки микробиологических препаратов фитостимулирующего и защитного действия, адаптированных к местным региональным условиям, проведен впервые.
Материал и методы. В работе использовали растения левзеи сафлоровидной при её длительном (в течение 12 лет) возделывании на дерново-подзолистой почве в условиях Предуралья. Численность и таксономическую структуру комплекса актиномицетов определяли в ризосфере и ризоплане растений, используя
ранее описанные подходы и приемы [12]. Анализировали пять индивидуальных образцов, каждый из которых был представлен двумя смешанными навесками, массой 2,0 г. Общую численность мицелиальных прокариотов и видовую структуру рода Streptomyces характеризовали на казеин-глицериновом агаре (КГА), родовую структуру комплекса актиномицетов - на среде с пропионатом натрия [13]. Из стрептомицетных колоний разных мор-фотипов, вырастающих на КГА при посеве из разведений почвенных суспензий и корневых гомогенатов, выделяли чистые культуры.
Для характеристики функциональной структуры комплекса у изолятов рода Strep-tomyces определяли спектр утилизации различных источников углерода на среде ISP 9 [14], антибиотическую активность - методом диффузии в агар. Параллельно в НИИ физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского МГУ (г. Москва) проводили высокопроизводительный скрининг штаммов, способных ингибировать синтез белка и вызывать SOS-ответ, с помощью двойной репортерной системы на основе штамма Escherichia coli dtolC BW25113, содержащего репортерную конструкцию, закодированную на плазмиде pDualrep2 (PMID 27736765). Принцип работы репортера заключается в том, что соединения, ингибирующие трансляцию, опосредованно приводят к экспрессии дальне-красного флуоресцентного белка Katushka2S, что сопровождается красным свечением. Соединения, повреждающие ДНК, индуцируют SOS-ответ в клетке, что запускает экспрессию красного флуоресцентного белка (RFP) и вызывает свечение зеленого цвета [15].
Для выявления антибиотически активных штаммов стрептомицеты выращивали в течение 10 сут при 20±2 0С на качалке (120 об/мин) в жидкой среде следующего состава (г/л): глюкоза - 10,0; пептон - 6,2; дрожжевой экстракт - 2,0; гидролизат казеина - 2,0; NaCl - 2,75; KNO3 - 0,06; Na2CO3 - 0,7; Na2S2O3 - 0,2. Исходное значение рН устанавливали равным 8,0. Культуральную жидкость (КЖ) освобождали от клеток центрифугированием при 13000 об./мин в течение 12 мин.
Ночную культуру E. coli dtolC BW2511 разбавляли в десять раз свежей средой LB и выливали в чашки с агаризованной средой LB и канамицином (50 мкг/мл). После высыхания
жидкости на поверхности агара в среде проделывали лунки диаметром 8 мм, в которые вносили по 100 мкл исследуемого образца - КЖ каждого из изолятов. После культивирования в течение 18 часов при температуре 37 °С чашки сканировали с помощью системы гель-документирования ChemiDoc (Bio-Rad) в каналах Cy3 (для детекции RFP) и Cy5 (для детекции Katushka2S).
Для ПЦР-детекции генов поликетидсин-тетаз типа II (PKS II) у стрептомицетных изолятов выделение ДНК проводили из мицелия (100 мг) культур, выращенных на овсяном агаре, с помощью набора «ПРОБА-ЦТАБ» («НПО ДНК-Технология», Россия). Концентрацию ДНК в полученных препаратах оценивали, измеряя поглощение света при длине волны 260 нм на спектрофотометре UNICO 2802(S) (США).
Для выявления генов, кодирующих PKS типа II, использовали пару праймеров: f GC(C\G)TGCTTCGA(C\T)GC(C\G)ATC, г CAT (C\G)GA(C\T)TTGAT(G\C)GAGCTGA (длина ампликона 414 п.н.), синтезированные компанией «Синтол» (Россия). Реакцию проводили на программируемом термоциклере «Терцик» («НПО ДНК-Технология», Россия). Реакционная смесь (25 мкл) содержала 1 нг ДНК, 0,1 мМ dNTPs, 0,2 мкМ каждого праймера, 1*PCR-буфер и 1 ед. Taq-полимеразы (СибЭнзим, Россия). ПЦР проводили в следующем режиме: 1 цикл 94 °С - 5 мин; 30 циклов -94 °С -1 мин, 56 °С - 1 мин, 72 °С - 1 мин; конечная элонгация 72 °С - 5 мин. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Для определения длины полученных ампликонов использовали маркер DNA Ladder (СибЭнзим, Россия). Визуализацию результатов электрофореза проводили с помощью трансиллюминатора «Квант-312» (Helicon, Россия).
Способность изолятов продуцировать ауксины определяли в культуральной жидкости с реактивом Сальковского [16]. Бактерии выращивали в жидкой среде, содержащей (г/л): глюкоза - 2; сахароза - 2; пептон - 1; дрожжевой экстракт - 1; К2НРО4 - 0,5; NaCl -0,1; MgSO4 - 0,2; КШ3 - 0,75; CaCh - 0,02; FeCl3 - 0,01; N2M0O4 - 0,002; pH 6,8-7,2. В качестве предшественника индольных соединений в среду добавляли DL-триптофан
(«ДИАЭМ», США) в количестве 0,2 и 2,0 г/л. Инкубировали на качалке (180 об/мин) в течение 4 сут. Культуральную жидкость от клеток освобождали центрифугированием при 6000 g в течение 10 мин. Количество ИУК определяли на фотоэлектроколориметре (ФЭК 56М, Россия) при длине волны 540 нм. Для построения калибровочного графика использовали разведения стандартного раствора ИУК (Fluca, Швейцария). Контролем служила неинокулированная среда с добавлением реактива.
Целлюлазную активность оценивали на среде Гетчинсона с карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ) согласно [17]. Учитывая, что продукты деструкции целлюлозы не окрашиваются красителем, о целлюлазной активности судили по величине светлой зоны около тестируемого микроорганизма.
Статистическую обработку данных проводили стандартными методами с использованием программы Excel 5.
Результаты и их обсуждение. Общая численность актиномицетов в ризосфере левзеи сафлоровидной изменялась в пределах (4,4-13,2)*105 колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г почвы, а в ризоплане - в пределах (7,6-24,1)х103 КОЕ/г корней. Комплекс ассоциированных с левзеей мицелиальных прокариот представлен родами Streptomyces, Micromonospora, Streptosporangium, Streptoverti-cillium и олигоспоровыми формами. Между ризосферой и ризопланой в таксономической структуре комплекса выявлены незначительные различия в долевом соотношении представителей родов Streptosporangium и Strep-toverticillium (рис. 1). Стрептомицеты доминировали как в ризосфере (46 %), так и в ризоплане (44 %) растений, на основании чего были выделены в чистые культуры для дальнейшего изучения.
Исследование культуральных и морфологических свойств изолятов показало, что на корнях наблюдается более высокое разнообразие стрептомицетов, чем в почве (табл.). Так, все выделенные из ризосферы штаммы были отнесены к четырем цветовым сериям одной секции Cinereus, тогда как изоляты из корней левзеи распределились между семью сериями трех секций (Cinereus, Albus и Helvolo-Flavus) рода Streptomyces [14].
4 1%
5
3% А
5 0%
1
46%
1
44%
□ 2
Ш3 4
Рис. 1. Долевое соотношение в актиномицетном комплексе левзеи сафлоровидной представителей родов: Streptomyces - 1, Micromonospora - 2, олигоспоровых форм - 3; Streptosporangium - 4, Streptoverticillium -5. А - ризосфера, В - ризоплана /
Fig. 1. The proportion in the actinomycete complex of leuzea safflower representatives of genera: Streptomyces - 1, Micromonospora - 2, oligosporous forms - 3; Streptosporangium - 4, Streptoverticillium - 5. A - rhizosphere, B - rhizoplana
Таблица - Культуральные и морфологические свойства бактерий рода Streptomyces, ассоциированных с корнями левзеи сафлоровидной /
Table - Cultural and morphological properties of bacteria of the genus Streptomyces associated with the roots of leuzea safflower
Штамм / Цвет / Colour Цепочка спор / Spore Секция, серия /
Strain Section, series
BM / AM CM / SM РП / RP chain
1 2 3 4 5 6
Ризосферная почва / Rhizospheric soil
2Ls1 Серый / Gray Серо-зеленый / Gray-green RF Cinereus Chrysomallus
2Ls4 Серый / Gray Бесцветный / Colorless Нет / S
2Ls6 Серый / Gray Бесцветный до зеленовато-серого / Colorless to greenish-gray No RF Cinereus Achromogenes
2Ls7 Светло-серый / Light gray Бурый до черного / Brown to black Желтовато-бурый / S Cinereus
2 Ls8 Темно-серый / Dark gray Буро-зеленый до черного / Brown-green to black Yellowish-brown RF/RA Chromogenes
2 Ls9 Темно-серый / Dark gray Бледно-желтый / Pale yellow RF Cinereus Aureus
2 Ls10 Светло-серый, мучнистый / Light gray, powdery Бесцветный / Colorless RF
2 Ls11 Серый до темно-серого, порошистый / Gray to dark gray, powdery Нет / No RF Cinereus
2 Ls12 Буровато-серый / Brownish gray Бесцветный до сероватого / Colorless to grayish RF/RA Achromogenes
2 Ls13 Серый, мучнистый / Gray, powdery Бесцветный / Colorless RF
2 Ls14 Темно-серый / Dark gray RF
4Ls1 Темно-серый / Dark gray Желто-зеленый / Yellow-green RF Cinereus
4Ls2 Светло-серый / Light gray Желтый / Yellow RF Aureus
Продолжение табл.
1 2 3 4 5 6
4Ls3 Светло-серый / Light gray Буровато-розовый / Brownish pink Розово-фиолетовый / Pink-purple RF Cinereus Violaceus
4Ls5 От белого до светло-серого / From white to light gray Желтый / Yellow Нет / No RF Cinereus Aureus
4Ls7 Серый / Gray Бесцветный / Colorless RF Cinereus Achromogenes
4Ls8 Светло-серый мучинистый / Light gray, powdery Буровато-розовый / Brownish pink Фиолетово- бурый / Purple-brown RF Cinereus Violaceus
4Ls10 Серый с белыми пятнами / Gray with white spots Бесцветный / Colorless Нет / No RF Cinereus Achromogenes
4Ls11 Серый / Gray Зеленовато-серый / Greenish-gray RF Cinereus Chrysomallus
4Ls12 Кремовый, скудноватый / Creamy, sparse Фиолетово-бурый / Purple-brown Розово-фиолетовый / Pink-purple RF Albus Albocoloratus
4Ls13 Палево-желтый, скудный / Pale yellow, sparse Буровато-розовый / Brownish pink Нет / No RF Helvolo-Flavus Helvolus
4Ls14 Серый / Gray Бесцветный до зелено-желтого / Colorless to green-yellow RF Cinereus Aureus
4Ls15 Темно-серый с беловатыми пятнами / Dark gray with whitish spots Бесцветный / Colorless Желтовато-бурый / Yellowish-brown RF Cinereus Chromogenes
4Ls16 Серый, скудный / Gray, sparse Желто-зеленый / Yellow-green Нет / No RF Cinereus Aureus
4Ls17 Розовато-серый / Pinkish gray Светло-серый до бурого / Light gray to brown S Cinereus Chromogenes
4Ls18 Серый со светло-серыми пятнами / Gray with light gray spots Бесцветный до серо-желтого / Colorless to gray-yellow RF Cinereus Aureus
4Ls19 Серый / Gray Бесцветный до желтоватого / Colorless to yellowish RF Cinereus Achromogenes
4Ls20 Серый, скудный / Gray, sparse Зеленовато-желтый / Greenish-yellow RF Cinereus Aureus
4Ls21 Кремовый, мучнистый / Creamy, powdery Бесцветный до зеленовато-серого / Colorless to greenish-gray RF Helvolo-Flavus Helvolus
4Ls22 Кремовый, мучнистый / Creamy, powdery Бесцветный до зеленовато-серого / Colorless to greenish-gray RF Helvolo-Flavus Helvolus
Примечания: ВМ - воздушный мицелий; СМ - субстратный мицелий; РП - растворимый пигмент.
Цепочки спор: RF - прямые, RA - извитые, S - спиральные / Notes: VM - air mycelium; SM - substrate mycelium; RP - soluble pigment. Spore chains: RF - straight, RA - twisted, S - spiral
Проверка изолятов на способность к утилизации различных источников углерода показала, что ассоциированные с корнями левзеи сафлоровидной стрептомицеты могут метаболизировать широкий спектр сахаров, целлюлозу и маннит (рис. 2).
В микролокусах ризосферы и ризопланы частота встречаемости культур, способных утилизировать тот или иной источник, различалась. Так, все изоляты из ризосферы левзеи
усваивали глюкозу, маннит и рамнозу (частота встречаемости 100 %), а в ризоплане изоляты, усваивающие маннит и рамнозу, встречались с частотой 85 %, но все культуры, наряду с глюкозой, утилизировали ксилозу (100 %). Значительные различия между комплексами ризосферы и ризопланы наблюдали в отношении потребления стрептомицетами фруктозы и целлюлозы. Среди ризосферных изолятов чаще встречались утилизирующие фруктозу
(75 %) и реже - целлюлозу (25 %), чем среди изолятов, выделенных из ризопланы (69 и 53,8 % соответственно). Разница в спектрах утилизации углеродных субстратов свидетельствует
о специфичности физиологической структуры комплексов стрептомицетов в зависимости от микролокуса.
100 -90 -
50 ФО
30 -20 ■
Рис. 2. Частота встречаемости штаммов, утилизирующих различные источники углерода: 1 - ксилозу;
2 - арабинозу; 3 - рамнозу; 4 - маннит; 5 - глюкозу; 6 - целлюлозу; 7 - лактозу; 8 - фруктозу. А - ризосфера, В - ризоплана /
Fig. 2. Frequency of occurrence of strains utilizing various carbon sources: 1 - xylose; 2 - arabinose;
3 - rhamnose; 4 - mannitol; 5 - glucose; 6 - cellulose; 7 - lactose; 8 - fructose. A - rhizosphere, B - rhizoplane
Определение антибиотической активности методом диффузии в агар выявило в стреп-томицетных комплексах ризосферы и ризопланы соответственно 2 и 4 культуры, ингибирующие рост грамположительных тест-бактерий Clavi-bacter michiganensis и Bacillus aryabhattai. К грамотрицательным тест-бактериям Curto-bacterium flaccumfaciens, Erwinia rhapontici, Pseudomonas cepacea и Pedobacter agri ни один из протестированных штаммов не проявил ингибирующего действия.
Антифунгальной активностью, в той или иной степени, обладали все ассоциированные с левзеей культуры стрептомицетов. В зависи-
мости от величины зон ингибирования роста тест-культур, штаммы разделили на группы с низкой, средней и высокой активностью. Суммарная частота встречаемости изолятов со средней и высокой активностью в комплексах ризосферы и ризопланы левзеи зависела от тест-культуры микромицета (рис. 3). Так, в ризосферном комплексе чаще, чем в ризо-плане, отмечены стрептомицеты, подавляющие рост фузариозных грибов Е Avenaceum и Е. oxysporum, а антагонисты меланизиро-ванных грибов Акетапа 8р. и В. Богоктапа с большей частотой встречались в стрепто-мицетном комплексе ризопланы.
Bipolaris sorokiniana
Alternaria sp.
Fusarium avenaceum 80
Fusarium oxysporum
Fusarium culmorum
—А--В
Рис. 3. Суммарная частота встречаемости стрептомицетов со средней и высокой активностью подавления фито-патогенных грибов в ризосфере (А) и ризоплане (В) левзеи сафлоровидной /
Fig. 3. The total frequency of strep-tomycetes with medium and high activity of suppression of phytopathogenic fungi in the rhizosphere (A) and rhizoplane (B) of leuzea safflower
Fusarium proliferatum
Наиболее высокой антифунгальной активностью отличался выделенный из ризоп-ланы штамм Streptomyces sp. 4Ls13, который с высокой активностью подавлял рост микро-мицетов Fusarium avenaceum, F. oxysporum, F. proliferatum, Alternaria sp., Bipolaris sorokin-iana, в средней степени - F. culmorum. Проведение скрининга с помощью двойной репор-терной системы выявило у этого штамма способность к индукции белка Katushka2s, что указывает на повреждение синтеза белка. Штамм Streptomyces sp. 4Ls13 относится к серии Helvolo-Flavus Helvolus, отдельные представители которой продуцируют антибиотики преимущественно пептидной природы [14].
Синтез стрептомицетами антибиотиков обычно происходит с участием больших мульти-ферментных комплексов, включающих поли-кетидсинтазы (PKS), нерибосомные пептид-синтазы (NRPS) или их комбинации. Благодаря их активности, осуществляются различные химические модификации, что обеспечивает представителям рода Streptomyces производство широкого спектра антибиотиков [18, 19]. Секвенирование генома модельного штамма-продуцента (Streptomyces coelicolor A3(2)) показало, что в его геноме закодирован потенциал для синтеза на порядок большего количества антибиотиков, чем производит данный штамм в лабораторных условиях [20]. Это означает, что у микроорганизмов, наряду с функционирующими генами, существуют и другие генные кластеры, которые не всегда экспрессируются и потому известны как «кластеры молчащих биосинтетических генов» [21]. О биосинтетическом потенциале штамма можно узнать посредством обнаружения
этих генов с использованием специфических праймеров [22].
Биосинтетический потенциал стрепто-мицетов, ассоциированных с корнями левзеи сафлоровидной, оценивали с помощью ПЦР-детекции генов поликетидсинтетаз типа II (PKS II), которые ответственны за продукцию ароматических поликетидов. К ним относятся широко используемые в медицинской практике тетрациклины, антрациклины, ангуциклины, антибиотики группы ауреоловой кислоты, тетра-ценомицины и другие группы соединений, имеющие в составе полифенольные и бензохиноновые структуры [23]. В результате ПЦР со специфичными к генам PKS II прай-мерами в образцах ДНК не выявлено целевых ампликонов длиной 414 п.н. и соответственно положительных по этому признаку культур стрептомицетов (рис. 4). Вместе с тем у ряда ассоциированных с левзеей штаммов Streptomyces sp. 4Ls5, 2Ls9, 2Ls3, 4Ls7, 4Ls10, 4Ls3 и 2Ls1 отмечено наличие неспецифических продуктов реакции, что указывает на необходимость их дальнейшего изучения. Доля таких культур в исследованной выборке из 19 штаммов составила 36,8 %. Отсутствие положительных изолятов, имеющих гены PKS II, не противоречит обнаружению среди стрептоми-цетов, ассоциированных с левзеей, штаммов с биоцидными свойствами, поскольку синтез антибиотиков может быть связан с другими генетическими системами: PKS типа I и PKS типа III и/или NRPS. Кроме того, в ряде работ отмечено отсутствие прямой корреляции между противомикробной активностью и обнаружением у стрептомицетов функциональных генов [24, 25].
М К 2Ls4 4Ls5 2Ls11 2Ls9 4Ls6 М М К 2Ls13 4Ls7 4Ls2 2Ls9 4Ls3 М М К 4Ls1 4Ls8 2Ls1 2Ls7 4Ls21 М
Рис. 4. Электрофореграммы образцов ДНК стрептомицетов после амплификации с праймерами к генам PKS II. Дорожки: М - маркеры молекулярной массы; К - отрицательный контроль; далее -образцы /
Fig. 4. Electrophoregrams of streptomyces DNA samples after amplification with primers to PKS II genes. Tracks: M - markers of molecular weight; K - negative control; then - samples
Важным условием ассоциативного взаимодействия РОРЯ с растениями является синтез ауксинов, которые играют жизненно важную роль в стимуляции роста и развития растений, регулируют деление клеток, их дифференциацию, влияют на фотосинтез, устойчивость к стрессам [26]. При культивировании в среде с добавлением 2 г/л триптофана практически все исследуемые изоляты продуцировали индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) - наиболее распространенный и активный в группе ауксинов фитогормон, широко применяемый в практике растениеводства.
Изоляты из ризопланы левзеи в среднем продуцировали ИУК в больших количествах (40,20±16,18 мкг/мл), чем изоляты из ризосферы (16,90±5,75 мкг/мл). Высокой продукцией ИУК (48,0-83,6 мкл/мл) в комплексе ризопланы характеризовалась почти треть (31 %) штаммов, тогда как в стрептомицетном комплексе ризосферы абсолютное большинство изолятов (87,5 %) имело низкую способность к биосинтезу ауксинов, продуцентов ИУК с высокой активностью не выявлено, а умеренную активность проявили лишь 12,5 % изолятов (рис. 5).
Рис. 5. Долевое соотношение штаммов-ассоциантов левзеи сафлоровидной с различной способностью к продукции ауксинов: 1 - низкая (до 20 мкг/мл); 2 - умеренная (от 21 до 45 мкг/мл); 3 - высокая (более 45 мкг/мл). А - ризосфера, В - ризоплана /
Fig. 5. The proportion of associated strains of leuzea safflower with different ability to produce auxins: 1 - low (up to 20 mcg/ml); 2 - moderate (from 21 to 45 mcg/ml); 3 - high (more than 45 mcg/ml). A - rhizosphere, B - rhizoplana
В среде с пониженным до 0,2 г/л содержанием триптофана наиболее активные штаммы Streptomyces 8р. 4Ь813, 4Ь816, 4Ь87 и 4Ь85 обеспечили биосинтез ИУК на уровне 19,60±0,40, 21,50±2,49, 20,40±2,61 и 17,60±2,30 мкг/мл соответственно.
Экологические функции актиномицетов в природе связаны с разложением трудногид-ролизуемых биополимеров, значительная доля которых представлена целлюлозой. Целлю-лолитическую активность ассоциированных
с левзеей стрептомицетов определяли в тесте с конго красным. В зависимости от величины зоны деструкции КМЦ, изоляты объединяли в группы со слабой (тест-зона не более 20 мм), умеренной (тест-зона изменяется от 21 до 34 мм) и сильной (тест-зона не менее 35 мм) активностью. Стрептомицетные комплексы ризосферы и ризопланы по долевому участию представителей каждой из групп различались незначительно (рис. 6).
0 20 40 60 80 100 %
Рис. 6. Долевое соотношение в ризосфере (А) и ризоплане (В) левзеи сафлоровидной стрептомицетов со слабой - 1, умеренной - 2, сильной целлюлолитической активностью - 3 и неактивных - 4 /
Fig. 6. The proportion in the rhizosphere (A) and rhizoplane (B) of the leuzea safflower streptomyces with weak - 1, moderate - 2, strong cellulolytic activity - 3 and inactive - 4
Аграрная наука Евро-Северо-Востока / Agricultural Science Euro-North-East. 2022;23(4):515-526
Абсолютное большинство изолятов из обоих микролокусов (по 76 %) проявили умеренную и сильную активность в деструкции КМЦ. Слабой целлюлолитической способностью характеризовались 25 % штаммов, выделенных из ризосферы, и 15,3 % изолятов из ризопланы. Лишь один изолят Streptomyces sp. 4Ls13, выделившийся при скрининге продуцентов антифунгальных соединений и ауксинов, дал отрицательный результат в тесте с конго красным.
Заключение. Таким образом, комплекс стрептомицетов, связанных с левзеей сафлоро-видной, представляет собой ценный ресурс для получения новых микробных источников биоактивных природных веществ: ауксинов, антифунгальных соединений, ферментов цел-люлазного комплекса. Показано, что среди изолятов из ризопланы левзеи чаще, чем среди ризосферных изолятов, встречаются активные продуценты ИУК и антагонисты меланизиро-ванных грибов Alternaria sp. и Bipolaris soro-kiniana. Актинобиота корней левзеи сафло-ровидной отличается высокой представлен-
ностью целлюлолитически активных стрептомицетов. Выявлены перспективные для химического изучения образуемых антибиотиков штаммы Streptomyces sp. 4Ls13, 4Ls1, 2Ls9, 2Ls13, ферментов целлюлазного комплекса -Streptomyces sp. 2Ls1, 2Ls4, 2Ls14, 4Ls11, 4Ls19, индольных соединений - Streptomyces sp. 4Ls13, 4Ls16, 4Ls7 и 4Ls5, которые могут найти практическое применение в связи с созданием биопрепаратов для стимуляции роста и защиты растений. Очевидно, процесс разработки и внедрения биопрепаратов в сельскохозяйственное производство потребует проведения широкого спектра дополнительных исследований, направленных на решение генно-молекулярных, физиолого-биохимических и технологических задач. Вместе с тем полученные результаты стимулируют интерес к дальнейшему изучению микробиоты, ассоциированной с лекарственными растениями, для лучшего понимания тех возможностей, которые открывает углубленный анализ микробиома в этой специфической экологической нише.
References
1. Hamedi J., Mohammadipanah F. Biotechnological application and taxonomical distribution of plant growth promoting actinobacteria. Journal of industrial microbiology & biotechnology. 2015;42(2);157-171. DOI: https://doi.org/10.1007/s10295-014-1537-x
2. Schmidt T. M. Encyclopedia of Microbiology. Academic Press, 2019. pp. 334-345. URL: https://books.google.ru/books?hl=ru&lr=&id=7fvDDwAAQBAJ&oi
3. Miliute O., Buzaite D., Baniulis V. Stanys Bacterial endophytes in agricultural crops and their role in stress tolerance: a review. Zemdirbyste-Agriculture. 2015;102(4):465-478. DOI: https://doi.org/10.13080/z-a.2015.102.060
4. Wardecki T., Brotz E., De Ford C., von Loewenich F. D., Rebets Y., Tokovenko B., Merfort I. Endophytic Streptomyces in the traditional medicinal plant Arnica montana L.: secondary metabolites and biological activity. Antonie van Leeuwenhoek. 2015;108(2);391-402. DOI: https://doi.org/10.1007/s10482-015-0492-5
5. Nalini M. S., Prakash H. S. Diversity and bioprospecting of actinomycete endophytes from the medicinal plants. Letters in applied microbiology. 2017;64(4):261-270. DOI: https://doi.org/10.1111/lam. 12718
6. Dochhil H., Dkhar M. S., Barman D. Seed germination enhancing activity of endophytic Streptomyces isolated from indigenous ethno-medicinal plant Centella asiatica. Int J Pharm Biol Sci. 2013;4(1):256-262.
7. Igarashi Y. Screening of novel bioactive compounds from plant-associated actinomycetes. Actinomyce-tolog. 2004;18:63-66. DOI: https://doi.org/10.3209/sai.18 63
8. El-Shatoury S., El-Kraly O., El-Kazzaz W., Dewedar A. Antimicrobial activities of Actinomycetes inhabiting Achillea fragrantissima (Family: Compositae). Egypt J Nat Toxins. 2009;6(2):1-15. URL: https://www.academia.edu/894923/ANTIMICROBIAL ACTIVITIES OF ACTINOMYCETES INHABITING ACHILL EA FRAGRANTISSIMA FAMILY COMPOSITAE
9. Gangwar M., Dogra S., Gupta U. P., Kharwar R. N. Diversity and biopotential of endophytic actinomycetes from three medicinal plants in India. African J Microbiol Res. 2014;8(2):184-191.
DOI: https://doi.org/10.5897/AJMR2012.2452
10. Тимофеев Н. П. Левзея сафлоровидная: проблемы интродукции и перспективы использования в качестве биологически активных добавок. Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты. М.: РАЕН, 2001. С. 108-134. Режим доступа: https://www.elibrary.ru/item.asp?id=30640821&pff=1
Timofeev N. P. Leuzea carthamoides: introduction questions and application prospects as biologically active components. Netraditsionnye prirodnye resursy, innovatsionnye tekhnologii i produkty. Moscow: RAEN, 2001. pp. 108-134. URL: https://www.elibrary.ru/item.asp?id=30640821&pff=1
11. Белодубровская Г. А. Большой энциклопедический словарь лекарственных растений. Санкт-Петербург: СпецЛит, 2015. 759 с.
Belodubrovskaya G. A. Big encyclopedic dictionary of medicinal plants. Saint-Petersburg: SpetsLit, 2015. 759 p.
12. Широких И. Г., Назарова Я. И., Огородникова С. Ю., Баранова Е. Н. Изменение структуры комплексов актиномицетов в ризосфере трансгенных по гену Fe-СОД 1 линий томата (Solanum lycopersicum L., SOLANACEAE, SOLANALES). Поволжский экологический журнал. 2016;(3):341-351.
DOI: https://doi.org/10.18500/1684-7318-2016-3-341-351
Shirokikh I.G., Nazarova Y.I., Ogorodnikova S.Yu., Baranova E.N. Changes in the structure of the rhizosphere complexes of actinomycetes of transgenic tomato (Solanum lycopersicum L., SOLANACEAE, SOLANALES) with the gene Fe-SOD 1. Povolzhskiy ekologicheskiy zhurnal = Povolzhskiy Journal of Ecology. 2016;(3):341-351. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.18500/1684-7318-2016-3-341-351
13. Зенова Г. М. Почвенные актиномицеты. М.: МГУ, 1992. 78 с. Режим доступа: https://bookree.org/reader?file= 1222199
Zenova G. M. Soil actinomycetes. Moscow: MGU, 1992. 78 p. URL: https ://bookree.org/reader?file=1222199
14. Гаузе Г. Ф. Определитель актиномицетов. Роды Sreptomyces, Streptoverticillium, Chainia. М.: Наука, 1983. 248 с. Режим доступа: https://www.bookvoed.ru/files/3515/10/97/91.pdf
Gauze G. F. Determinant of actinomycetes. Genera Sreptomyces, Streptoverticillium, Chainia. Moscow: Nauka, 1983. 248 p. URL: https://www.bookvoed.ru/files/3515/10/97/91.pdf
15. Osterman I. A., Komarova E. S., Shiryaev D. I., Korniltsev I. A., Khven I. M., Lukyanov D. A., Tash-litsky V. N., Serebryakova M. V., Efremenkova O. V., Ivanenkov Ya. A., Bogdanov A. A., Sergiev P. V., Dontso-va O. A., Sorting Out Antibiotics' Mechanisms of Action: a Double Fluorescent Protein Reporter for High-Throughput Screening of Ribosome and DNA Biosynthesis Inhibitors. Antimicrob Agents Chemother. 2016;60(12):7481-7489. DOI: https://doi.org/10.1128/AAC.02117-16
16. Libbert E., Risch H. Interactions between plants and epiphytic bacteria regarding their auxin metabolism. Physiologia Plantarum. 1969;22(1):51-58. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1969.tb07840.x
17. Teather R. M., Wood P. J. Use of congo-red polysaccharide interaction in erumeration and characterization of cellulolytic bacteria the bovine rumen. Appl. Environ Microbiol. 1982;43(4):777-780.
DOI: https://doi.org/10.1128/aem.43.4.777-780.1982
18. Felnagle E. A., Jackson E. E., Chan Y. A., Podevels A. M., Berti A. D., McMahon M. D., Thomas M. G. Nonribosomal peptide synthetases involved in the production of medically relevant natural products. Mol Pharm. 2008;5(2):191-211. DOI: https://doi.org/10.1021/mp700137g
19. Risdian C., Mozef T., Wink J. Biosynthesis of polyketides in Streptomyces. Microorganisms. 2019;7(5):124. DOI: https://doi.org/10.3390/microorganisms7050124
20. Bentley S. D., Chater K. F., Cerdeno-Tarraga A-M., Challis G. L., Thomson N. R. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 2002;417:141-147.
DOI: https://doi.org/10.1038/417141a
21. Chiang Y-M., Chang S-L., Oakley B.R., Wang CCC. Recent advances in awakening silent biosynthetic gene clusters and linking orphan clusters to natural products in microorganisms. Curr Opin Chem Biol. 2011;15:137-143. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2010.10.011
22. Ayuso-Sacido A., Genilloud O. New PCR primers for the screening of NRPS and PKS-I systems in actinomycetes: detection and distribution of these biosynthetic gene sequences in major taxonomic groups. Microb Ecol. 2005;49(1):10-24. DOI: https://doi.org/10.1007/s00248-004-0249-6
23. Hertweck C., Luzhetskyy A., Rebets Y., Bechthold A. Type II polyketide synthases: Gaining a deeperin-sight into enzymatic teamwork. Nat. Prod. Rep. 2007;24:162-190. DOI: https://doi.org/10.1039/b507395m
24. Qin S., Li J., Chen H. H., Zhao G. Z., Zhu W. Y., Jiang C. L., Li W. J. Isolation, Diversity and antimicrobial activity of rare actinobacteria from medicinal plants of tropical rain forests in Xishuangbanna. Appl. Environ. Microbiol. 2009;75(19):6176-6186. DOI: https://doi.org/10.1128/AEM.01034-09
25. Passari A. K., Mishra V. K., Saikia R., Gupta V. K., Singh B. P. Isolation, abundance and phylogenetic affiliation of endophytic actinobacteria associated with medicinal plants and screening for their in vitro antimicrobial biosynthetic potential. Front. Microbiol. 2015;6:273. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00273
26. Веселова С. В., Нужная Т. В., Бурханова Г. Ф., Румянцев С. Д., Касимова А. Р., Максимов И. В. Роль фитогормонов в регуляции взаимодействий между растениями и патогенами, насекомыми-вредителями, вирусами. Экобиотех: мат-лы VII Всеросс. конф. с международ. участием. Уфа: УИБ УФИЦ РАН, 2021. С. 124-128. Режим доступа: http://ib.anrb.ru/ebt2021/ecobiotech2021.pdf
Veselova S. V., Nuzhnaya T. V., Burkhanova G. F., Rumyantsev S. D., Kasimova A. R., Maksimov I. V. The role of phythormones in regulation of interactions between plants and pathogens, pests and viruses. Ekobiotekh: mat-ly VII Vseross. konf. s mezhdunarod. uchastiem. Ufa: UIB UFITsRAN, 2021. pp. 124-128. URL: http://ib.anrb.ru/ebt2021/ecobiotech2021.pdf
Сведения об авторах
И Широких Ирина Геннадьевна, доктор биологических наук, главный научный сотрудник, зав. лабораторией, ФГБНУ «Федеральный аграрный научный центр Северо-Востока имени Н. В. Рудницкого», д. 166а, ул. Ленина, г. Киров, Российская Федерация, 610007, e-mail: [email protected], ORCID: https://orcid.org/0000-0002-3319-2729, e-mail: [email protected],
Назарова Янина Иордановна, кандидат биологических наук, научный сотрудник, ФГБНУ «Федеральный аграрный научный центр Северо-Востока имени Н. В. Рудницкого», д. 166а, ул. Ленина, г. Киров, Российская Федерация, 610007, e-mail: [email protected], ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2945-5282 Бакулина Анна Владимировна, кандидат биол. наук, старший научный сотрудник, зав. лабораторией молекулярной биологии и селекции, ФГБНУ «Федеральный аграрный научный центр Северо-Востока имени Н. В. Рудницкого», ул. Ленина 166а, г. Киров, Российская Федерация, 610007, e-mail: [email protected], ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5171-2476
Остерман Илья Андреевич, доктор химических наук, главный научный сотрудник, АНООВО «Сколковский институт науки и технологий», д.30, стр.1, Большой бульвар, г. Москва, Российская Федерация, 121205, ведущий научный сотрудник, Научно-технологический университет «Сириус», Научный центр генетики и наук о жизни, д. 1, пр-кт Олимпийский, пгт Сириус, Краснодарский край, Российская Федерация, 354349, ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7748-980X
Белик Альбина Романовна, Научно-технологический университет «Сириус», Научный центр генетики и наук о жизни, д. 1, пр-кт Олимпийский, пгт Сириус, Краснодарский край, Российская Федерация, 354349
Буюклян Юлия Андреевна, Научно-технологический университет «Сириус», Научный центр генетики и наук о жизни, д. 1, пр-кт Олимпийский, пгт Сириус, Краснодарский край, Российская Федерация, 354349 Боков Никита Александрович, магистрант, лаборант-исследователь, ФГБНУ «Федеральный аграрный научный центр Северо-Востока имени Н. В. Рудницкого», ул. Ленина 166а, г. Киров, Российская Федерация, 610007, e-mail: [email protected], ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1000-1192
Широких Александр Анатольевич, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник, ФГБНУ «Федеральный аграрный научный центр Северо-Востока имени Н. В. Рудницкого», д. 166а, ул. Ленина, г. Киров, Российская Федерация, 610007, e-mail: [email protected], ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7808-0376
Information about the authors
^ Irina G. Shirokikh, DSc in Biological Science, chief researcher, Head of the Laboratory, Federal Agricultural Research Center of the North-East named N. V Rudnitsky, Lenin str., 166a, Kirov, Russian Federation, 610007, email: [email protected], ORCID: https://orcid.org/0000-0002-3319-2729, e-mail: [email protected]
Yanina I. Nazarova, PhD of Biological Science, researcher, Federal Agricultural Research Center of the North-East named N. V. Rudnitsky, Lenin str., 166a, Kirov, Russian Federation, 610007, e-mail: [email protected], ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2945-5282
Anna V. Bakulina, PhD in Biological Science, senior researcher, Head of the Laboratory of Molecular Biology and Breeding, Federal Agricultural Research Center of the North-East named N. V. Rudnitsky, Lenin str., 166a, Kirov, Russian Federation, 610007, e-mail: [email protected], ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5171-2476
Ilya A. Osterman, DSc in Chemistry, chief researcher, ANOVO "Skolkovo Institute of Science and Technology", 30, p.1, Bolshoy Boulevard, Moscow, Russian Federation, 121205, leading researcher, Sirius University of Science and Technology, Scientific Center of Genetics and Life Sciences, 1, Olympic Avenue, Sirius village, Krasnodar Territory, Russian Federation, 354349, ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7748-980X
Albina Romanovna Belik, Sirius University of Science and Technology, Scientific Center of Genetics and Life Sciences, 1, Olympic Avenue, Sirius village, Krasnodar Territory, Russian Federation, 354349 Buyuklyan Yulia Andreevna, Sirius University of Science and Technology, Scientific Center of Genetics and Life Sciences, 1, Olympic Avenue, Sirius village, Krasnodar Territory, Russian Federation, 354349
Nikita A. Bokov, Master's student, laboratory researcher, Federal Agricultural Research Center of the North-East named N. V. Rudnitsky, Lenin str., 166a, Kirov, Russian Federation, 610007, e-mail: [email protected], ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1000-1192
Alexander A. Shirokikh, DSc in Biological Science, Federal Agricultural Research Center of the North-East named N. V Rudnitsky, Lenin str., 166a, Kirov, Russian Federation, 610007, e-mail: priemnaya@fanc-sv. ru, ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7808-0376
- Для контактов / Corresponding author
