CC BY
51
УДК 631.41
МИЦЕЛИАЛЬНЫЕ АКТИНОБАКТЕРИИ ЗАСОЛЕННЫХ ПОЧВ АРИДНЫХ ТЕРРИТОРИЙ*
Д.А. Лубсанова, Г.М. Зенова, П.А. Кожевин, Н.А. Манучарова, А.П. Шваров
Установлена высокая численность (до сотен тысяч и миллионов КОЕ/г почвы) акти-номицетов, выделяемых из засоленных почв на территории ландшафтов бугров Бэра. Достоверно меньшее их количество выделяется из содовых и соровых солончаков, формирующихся на дне пересыхающих соленых озер в Бурятии и дельте Сырдарьи. Актиномицеты представлены в исследуемых почвах родами Streptomyces, Micromonospora, Actinomadura, No-cardiopsis.
Среди стрептомицетов доминируют виды секции Albus и серии Albus. На активность потребления субстратов культурами актиномицетов в значительной степени влияют условия предынкубирования, что, очевидно, связано с перестройкой их метаболизма как одного из механизмов адаптации к повышенной осмолярности среды. Экспериментально установлена алкалотолерантность, термотолерантность, ксеротолерантность галотолерантных акти-номицетов.
Ключевые слова: галотолерантные актиномицеты, засоленные почвы.
Введение
Засоленные почвы занимают обширные территории как в мире в целом, так и на территории России в частности. С каждым годом в связи с неправильной агротехникой, особенно при нерациональном орошении, их площадь расширяется. Становится ясным, что важно знать свойства таких почв, в том числе состав и свойства микробных сообществ, для решения проблем, связанных с засолением и эффективным использованием. Традиционно считалось, что мицелиальные актинобактерии (актиномицеты) не могут занимать природные экологические ниши, характеризующиеся экстремальными условиями, и не являются чемпионами устойчивости к воздействию факторов внешней среды [19, 20]. Такое представление не следует рассматривать как окончательное. Возможность существования ацидотолерантных и алкалофильных, псих-ротолерантных и термотолерантных, галотолерантных и галоалкалотолерантных, ксерофильных актиноми-цетов уже не вызывает сомнения у специалистов [2-4, 6, 11, 16].
Объекты и методы исследования
Образцы почв отбирали на территории ландшафтов бугров Бэра (Каспийская низменность, Астраханская обл., Волгоградский р-н), солончаков — в дельте р. Сырдарьи и с территории пересыхающих соленых озер Бурятии (таблица). Бугры Бэра представляют собой продолговатые холмы правильной формы, схожей с таковой хлебных батонов. Они располагаются в степи параллельными рядами, тянущимися с востока на запад. Расстояние между грядами колеблется
от 200 м до 1,5 км и в среднем составляет 300 м. Ширина бугров обычно не превышает 250 м, длина изменяется от 450 м до 4,5—5 км, достигая в некоторых случаях 10, 15 и даже 20 км. Высота не превышает 7—10 м, причем чем южнее, тем они выше.
Изучение внутренней структуры бугров Бэра показало, что под верхним облегающим со всех сторон лёссовидным слоем до самого основания залегают слоистые, а часто диагонально-слоистые глинистые пески. В отдельных случаях в них встречаются прослои с обломками каспийских раковин.
В районе с. Басы и г. Каспийский наблюдаются настоящие поля бугров, имеющих треугольную форму. Вершины их далеко вынесены на запад, а основания лежат на побережьях западных протоков дельты Волги. Бугры Бэра встречаются и на левом берегу Волги, и на западных дельтовых островах, где некоторые из них, например бугор Красный на р. Бахтемир, усиленно размываются текучими водами.
В прибрежной части волжских протоков, а также у берегов Каспия бэровские бугры нередко образуют ряды длинных островов и полуостровов. Весной, во время подъема волжской воды, она, разливаясь по межбугорным лощинам, превращает местность в запутанный лабиринт из узких проливов, протоков, ильменей и заливов.
Дифференцированный учет и выделение актиномицетов из исследуемых почв производили традиционным методом посева из разведений почвенных суспензий на агаризованные питательные среды [9]. Были использованы: среда Гаузе-1 [1], среда с про-пионатом натрия [5], гумусовитаминный агар [5].
Для посева брали навески воздушно-сухой почвы. В отдельных вариантах опыта проводили тепло-
* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 13-04-00269).
Характеристика исследуемых почвенных образцов
Почва Горизонт или слой, глубина взятия образца, см Характер засоления Район взятия образца
Бурая полупустынная среднесуглини-стая, слабоэродированная, на карбонатном эоловом суглинке В1—Веа,8а—Всо8,8а В1 0—38 сульфатно-хлоридный Прикаспийская низменность, Астраханская обл., Волгоградский р-н, бугор Большой Барфон, вершина бугра Бэра
Лугово-бурая, среднесуглинистая на делювиально-оползневых карбонатных суглинистых отложениях А—В8а—В8а^ А 0—16 то же там же, северный шлейф бугра Бэра
Аллювиальная луговая среднесуглинистая на делювиально-оползневых карбонатных суглинистых отложениях Asa—ACsa,g—C1—C2—G А 0—20 там же, луг среднего уровня
Бурая полупустынная, среднеэродиро-ванная, среднесуглинистая, на карбонатном суглинке Ad—Bca—Bca,sa—BCg Ad 0—3 там же, средняя часть склона бугра Бэра северной экспозиции, крутизна склона приблизительно 40°
Солончак луговой гидроморфный корочка на поверхности —"— бугор Бэра Большой Барфон-2
Содовый солончак то же содовый, сульфатный дельта р. Сырдарьи
Соровый солончак —"— сульфатно-хлоридный Бурятия, территория пересыхающих соленых озер, обр. № 1
То же —"— то же там же, обр. № 2
---- ---- ---- там же, обр. № 3
вую предобработку почвенных образцов (прогревание при 120° в течение одного часа). В среды добавляли антибиотик нистатин (50 мкг/мл среды), ограничивающий рост микроскопических грибов, и комплекс витаминов группы В (5 мкг/мл среды; в отдельных вариантах опыта их концентрацию увеличивали в 10 раз) для более полного выявления актиномицетов редко встречающихся в почве родов. Посевы инкубировали в термостате при 28° на средах Гаузе-1 и гумусо-вита-минном агаре в течение 4—6 дней, на среде с пропио-натом натрия — 2—3-х недель.
Предварительную идентификацию актиномице-тов проводили при первичном микроскопировании колоний на чашках с питательной средой с последующим выделением в чистую культуру на среде овсяный агар [5] представителей определенных доминирующих морфотипов. Для предварительной идентификации культур актиномицетов, выделенных при посеве из почвы на питательные среды, учитывали морфологические признаки: наличие/отсутствие фрагментации мицелия, образование спор на субстратном и/или воздушном мицелии, число спор в цепочках, наличие одиночных спор, спорангиев [9]. Идентификацию выделенных штаммов психротолерантных актиномицетов осуществляли по фенотипическим (культуральным, морфологическим, хемотаксономи-ческим, физиологическим) [9, 10, 12, 15, 18] имоле-кулярно-генетическим признакам (сиквенс 168 rRNA). Филогенетическое положение выделенных психро-
толерантных актиномицетов определяли на основании секвенирования гена 16S rRNA. При выделении ДНК из бактериальной биомассы использовали набор реактивов Wizard Genomic DNA Purification Kit, технологии Promega (США) согласно рекомендациям производителя с незначительными модификациями [7]. Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР-фраг-ментов гена 16S rRNA использовали универсальную праймерную систему [14, 17]. Полноразмерную копию гена получали на приборе "Mastercycler personal" (Eppendorf 11F, Германия) при помощи прайме-ров: 11F5' -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' 1492R5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3', где М = С или A, Y = С или Т.
Амплификационная смесь (объем 50 мкл) имела следующий состав: 1хбуфер ДНК полимеразы Bio-Taq (17 мМ (NH4)2SO4,67 мМ трис-HCl, рН 8,8,2 мМ MgCl2); 12,5 нмоль каждого из dNTP; 50 нг ДНК-матрицы; 5 пмоль соответствующих праймеров (11F и 1492R); 3 ед. ДНК-полимеразы BioTaq (Диалат ЛТД, Россия).
Температурно-временной профиль полимеразной цепной реакции (ПЦР) следующий: первый цикл — 94°, 9 мин.; 55°, 1 мин.; 72°, 2 мин.; последующие 30 циклов — 94°, 1 мин.; 55°, 1 мин.; 72°, 2 мин.; завершающий цикл — 72°, 7 мин.
Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S rRNA был проведен с по-
мощью программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast). Редактирование последовательностей осуществляли с помощью редактора BioEdit (http://jwbrown. mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html), а их множественное выравнивание — с использованием программы CLUSTAL W 1.75. Дендрограммы строили с помощью алгоритма "neighbor-joining" (NJ) в программе MEGA 4. Статистическую достоверность филогенетических реконструкций оценивали методом "Bootstrap" путем построения 1000 альтернативных деревьев. Нук-леотидные последовательности гена 16S rRNA выделенных штаммов депонированы в Gen Bank NCBI с присвоением культурам индивидуальных номеров доступа.
Для анализа характера потребления субстратов (функциональная активность) и интенсивности выделения углекислого газа (как одного из «парниковых газов») актиномицетами, разными по температурной и осмотической адаптациям, использовали метод муль-тиреспирометрического тестирования (МРТ), основанный на анализе показателей дыхания сообщества или популяций на разных ресурсах [13]. В нашем случае — модифицированный метод МРТ [8] .
Результаты и их обсуждение
Численность актиномицетов, выделенных из почв аридных территорий, колеблется от тысяч до миллионов КОЕ/г почвы. При добавлении в питательную среду (Гаузе-1) хлористого натрия в концентрации 5 и 7% по сравнению с традиционной средой Гау-зе-1 (0,05% NaCl) наблюдалось некоторое уменьшение количества выделяемых актиномицетов, в большинстве случаев недостоверное. Наибольшее количество актиномицетов (до миллионов КОЕ/г почвы) отмечено для следующих почв: лугово-бурой, аллювиальной луговой и солончака гидроморфного бугра Бэра Большой Барфон-2, образцы которых отобраны на территории ландшафтов бугров Бэра (рис. 1).
Рис. 1. Численность актиномицетов, выделенных на среде Гаузе-1 с разным содержанием №С1 из засоленных почв аридных территорий: 1 — бурая полупустынная слабоэродированная, 2 — лугово-бурая, 3 — аллювиальная луговая, 4 — бурая полупустынная среднеэродированная, 5 — солончак бугра Бэра Большой Барфон-2, 6 — содовый солончак дельты Сырдарьи, 7 — соровый солончак, обр. № 1, 8 — он же, обр. № 2, 9 — он же, обр. № 4; а — 0,05% №С1, б — 5% N0,
в — 7%ШС1
Выделяемые на среде Гаузе-1 актиномицеты оказались представителями р. Streptomyces. Видовая представленность стрептомицетов наиболее разнообразна в аллювиальной луговой среднесуглинистой почве на дельтовом суглинистом и супесчаном аллювии под косимым лугом среднего уровня бугра Бэра. Здесь, как и в большинстве исследованных почв, доминировали виды стрептомицетов, принадлежащих к секции Albus и серии Albus (48% от всех стрептомицетов комплекса). В комплексе аллювиальной луговой почвы отмечены виды стрептомицетов, принадлежащие к секциям и сериям Roseus Lavendulae—Ro-seus (24% от всех стрептомицетов комплекса), Cine-reus Achromogenes (12%), в небольших количествах виды секций и серий Helvolo-Flavus Helvolus, Cinereus Chromogenes, Imperfectus, Azureus Gla^escens. Наименьшее видовое разнообразие стрептомицетов характерно для солончаков: в содовом абсолютно доминировали стептомицеты видов, принадлежащих к секции и серии Cinereus Achromogenes, в соровом (обр. № 2) — представители секции Albus и серии Albus.
Из образцов бурой полупустынной почвы склона бугра Бэра выделялись стрептомицеты на среде Гаузе-1 в количестве сотен тысяч КОЕ/г почвы и были представлены в комплексе в основном неокрашенными формами, видами секции Albus и серии Albus (52% от всего комплекса стрептомицетов). При использовании тепловой предобработки бурой полупустынной почвы видовой спектр стрептомицетов, выделяемых на среде Гаузе-1, заметно расширился. Удалось выделить виды, принадлежащие секциям и сериям Roseus Lavendulae—Roseus, Imperfectus, Cinereus Aureus, Cinereus Achromogenes, в таком количестве, что они составили половину стрептомицетного комплекса.
Использование гумусовитаминного агара для выделения актиномицетов из исследуемых почв способствовало выявлению в бурой полупустынной почве
представителей р. Streptomyces, Micromonospora и Acti-nomadura (рис. 2, а). Применение тепловой предобработки почвы увеличивало количество выделяемых представителейр. Micromonospora и соответственно долю их (до 61%) в актино-мицетном комплексе этой почвы (рис. 2, б). Увеличение концентрации витаминов группы B (50 мкг/мл среды) в гумусовитамин-ном агаре значительно повышало (до 47%) долю представителей р. Actinomadura в почвенном актиномицет-ном комплексе (рис. 2, в). Наблюдалось доминирова-
Рис. 2. Доля разных родов в актиномицетном комплексе бурой полупустынной почвы при выделении актиномицетов на среде гуму-совитаминный агар (а), при предобработке прогреванием (120° в течение одного часа) (б) и при предобработке почвы прогреванием и добавлении к среде витаминов (50 мкг/мл) (в): 1 — Micromonospora, 2 — Actinomadura, 3 — Streptomyces
ние р. Micromonospora и Actinomadura, представители р. Streptomyces составили всего 6%.
Использование питательной среды с пропионатом натрия позволило выделить из образцов бурой полупустынной почвы бугра Бэра актиномицеты р. Strep-tomyces (75% от всех актиномицетов комплекса) и Micromonospora (25%). Тепловая предобработка почвы перед посевом способствовала выявлению в комплексе полного доминирования микромоноспор.
В соровом солончаке (обр. № 2, отобранный на дне пересохшего озера, расположенного в Джигин-ском р-не Республики Бурятия, недалеко от с. Бор-гой) при высеве на среду Гаузе-1 с добавлением 7% №С1 обнаружено абсолютное доминирование актиномицетов, принадлежащих р. Nocardiopsis. Два штамма идентифицированы по фенотипическим признакам и по сиквенсу 168 rRNAкак Nocardiopsis exhalans штаммы 723 и 724. Культура получила в международном генбанке NCBI номер индивидуального пользования — Nocardiopsis exhalans FR837628.
Использование метода МРТ для штаммов актиномицетов, выделенных из почв с разной осмолярностью и предынкубированных с разным содержанием хлористого натрия, показало, что на качественном уровне наблюдаются различия в активности потребления субстратов штаммами. Во всем диапазоне концентраций №С1 более активными оказались штаммы, предынкубированные при повышенном содержании соли в среде.
В результате проведения кластерного анализа четкого разделения объектов, выделенных и выращенных на средах с различной осмолярностью, не отмечено. Тем не менее у штаммов, предынкубированных на среде с 5% №С1, наблюдалась тенденция к более активному потреблению субстратов по сравнению со штаммами, культивируемыми на среде с концентрацией соли 0,05%. Очевидно, на активность потребления субстратов культурами в значительной степени влияют условия предынкубирования, что может быть связано с перестройкой метаболизма актиномицетов
как одного из механизмов адаптации к повышенной осмолярности среды.
Выводы
Установлено, что все галотолерантные штаммы (способные расти при 5% №С1), в отличие отнегало-фильных (не растущих при 5% №С1), способны расти на среде с содой с рН 10, в то время как негалофиль-ные штаммы такой способностью не обладают. Можно считать, что все отобранные галотолерантные штаммы являются и алкалотолерантными. Исследования пустынных почв свидетельствуют о широком распространении в них представителей мицелиальных актинобактерий, изоляты которых часто оказываются адаптированными к высокой температуре, высокой концентрации солей и низкой влажности [3,4]. На примере умеренного термофильного штамма Strep-tomyces fumigatiscleroticus 315 НЕ578745, выделенного из пустынной почвы, экспериментально показано, что этот штамм является ксеротолерантным [4].
Содержание в среде №С1 неоднозначно влияет на радиальную скорость роста колоний актиноми-цетов. В строгом статистическом смысле ее значения в среде с концентрациями соли 0,05 и 2% вообще не различаются с уровнем значимости 0,05. Различия между радиальной скоростью роста колоний при 2 и 5% соли в среде уже существенны — наблюдается ее резкое падение при 5%-й концентрации соли. Очевидно, радиальная скорость роста колоний акти-номицетов имеет высокую резистентность, т.е. этот показатель относительно устойчив в очень широком диапазоне концентраций солей, а признаки ее потери наблюдаются при достижении высокой, условно «критической» концентрации соли. Возможно, эта резистентность связана с тем, что почвенные актино-мицеты приспособлены к существованию в широком диапазоне колебаний влажности в естественных условиях, а значит, колебаний активности воды ^^ и концентрации почвенного раствора.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А. и др. Определитель актиномицетов. М., 1983.
2. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М. Экология актиномицетов. М., 2001.
3. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М. Актиномицеты засоленных и щелочных почв. М., 2007.
4. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М., Манучарова Н.А. Экстре-мофильные и экстремотолерантные актиномицеты в наземных экосистемах. М., 2011.
5. Зенова Г.М. Почвенные актиномицеты редких родов. М., 2000.
6. Калакуцкий Л.В., Агре Н.С. Развитие актиномице-тов. М., 1977.
7. Манучарова Н.А. Молекулярно-биологические аспекты исследований в экологии и микробиологии. М., 2010.
8. Марченко С.А., Панкратов Т.А., Горленко М.В., Ко-жевин ПА. Мультисубстратное тестирование природных микробных сообществ в почве // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 17. Почвоведение. 2005. № 2.
9. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М., 1991.
10. Определитель бактерий Берджи. М., 1997.
11. Современная микробиология. Прокариоты. Т. 2 / Отв. ред. Й. Ленглер, Г. Древс, Г. Шлегель. М., 2005.
12. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 4 / Ed. by S.T. Williams, V. Sharpe, J.A. Holt. Baltimore ets., 1989.
13. Campbell C.D., Chapman S.J., Cameron C.M. et al. Rapid microtiter plate method to measure carbon dioxide evolved from carbon substrate amendments so as to determine
the physiological profiles of soil microbial communities byusing whole soil // Appl. Environ. Microbiol. 2003. Vol. 69, N 6.
14. Edwards U, Rogall T, Bloeker H. et al. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes, characterization of gene coding for 16S ribosomal RNA // Nucl. Acids Res. 1989. Vol. 17.
15. Hasezawa M., Takida S. A rapid analysis for chemical grouping of aerobic actinomycetes // J. Gen. Appl. Microbiol. 1983. Vol. 29.
16. Jiang C, Xu L. Actinomycete diversity in unusual habitats // Actinomycetes. 1993. Vol. 4.
17. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing // Nucleic Acid Techniques in Bacterial systematic / Ed. by E. Stackebrandt, M. Goodfellow. Chichester (UK), 1991.
18. Stackebrandt E, Rainey F.A., Ward-Rainey N.L. Proposal for a new hieraric classification system, Actinobacteria classic nov. // Intern. J. Syst. Bacteriol. 1997. Vol. 47, N 2.
19. Waksman S.A. The actinomycetes. Nature, occurrence and activities. Vol.1. Baltimore, 1959.
20. Williams S.T., Vickers T.C. Actinomycetes in environment // Biology of Actinomycetes / Ed. by Y. Okami et al. Tokio, 1988.
Поступила в редакцию 11.06.2013
MYCELIAL ACTINOBACTERIA OF SALINE SOILS OF ARID TERRITORIES
D.A. Lubsanova, G.M. Zenova, P.A. Kozhevin, N.A. Manucharova, A.P. Shvarov
A high number (up to hundreds of thousands and millions CFU/g of soil) actinomycetes allocated from the saline soils on the territory of landscapes Bugrov Baer. Significantly smaller number of actinomycetes are allocated from the soda and sor salts, formed on the bottom of the drying up of the salt lakes in the republic of Buryatia and in the delta of the river Sirdari. Actinomyces are represented in the studied soils Streptomyces, Micromonospora, Actinomadura, Nocardiopsis. It is stated that activity of consumption substrates cultures actinomycetes largely influenced by pre-incubation, which is clearly associated with the restructuring of the metabolism of actinomycetes as one of the mechanisms of adaptation to the increased osmolarity environment. Experimentally installed that halotolerant actinomycetes of saline soils of arid territories are alcalotolerant, termotolerant, xero-tolerant.
Key words: halotolerant actinomycetes, saline soils.
Сведения об авторах
Лубсанова Дарья Алексеевна, аспирант каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Зенова Галина Михайловна, докт. биол. наук, профессор каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Тел.: 8(495)939-44-46; e-mail: zeno-va38@mail.ru. Кожевин Пётр Александрович, докт. биол. наук, вед. науч. сотр. каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Тел.: 8(495)939-35-98; e-mail: kozhevin-pa@mail.ru. Манучарова Наталия Александровна, докт. биол. наук, доцент каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Шваров Александр Петрович, канд. биол. наук, доцент каф. физики и мелиорации почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова.
