CC BY
4оригинальные статьи
Б. Экспериментальные исследования
©Коллектив авторов, 2019 Вопросы онкологии, 2019. том 65, № 2
УДК 616-006.44
Е.М. Трещалина, С.Ш. Каршиева, Н.Ю. Анисимова, С.М. Ситдикова, М.В. Киселевский
Анти-интегрин оуВ3 SAV-RGD в сочетании с дакарбазином при беспигментной меланоме
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина» Министерства здравоохранения российской Федерации, Москва
Введение. Интегрин avB3 (молекула клеточной адгезии) выполняет роль рецептора, в т.ч., металлопротеазы матрикса 2, задействованной в метастазировании меланомы. Нами был охарактеризован как антимела-номный оригинальный анти-интегриновый агент SAV-RGD (лио-SAV-RGD), специфически связывающийся с клетками меланомы посредством трипептида Arg-Gly-Asp. Более значимый эффект был получен на беспигментной меланоме кожи человека MeWo. Соответственно, актуальна экспериментальная оценка эффективности лио-SAV-RGD в сочетании с «золотым» стандартом антимела-номной химиотерапии дакарбазином (DTIC). Цель: сравнительное изучение сочетания DTIC+лио-SAV-RGD на модели беспигментной меланомы кожи человека MeWo. Материал и методы. Использована модель меланомы кожи человека MeWo in vitro/in vivo: чувствительная к DTIC клеточная линия MeWo и полученная проспективно устойчивая сублиния MeWo/DTIC; п/к ксенографты MeWo у мышей Balb/c nude. В опытах in vitro определено время удвоения клеток обеих моделей и определен индивидуальный диапазон концентраций агентов. Мышам DTIC+SAV-RGD агенты вводили в/б одновременно последовательно, сначала DTIC в субтерапевтической дозе 150 мг/кг, затем лио-SAV-RGD 9-кратным курсом в суммарной дозе 900 мг/кг (первая доза удвоена). Для контроля взята группа с DTIC в высокой терапевтической дозе 250 мг/кг, близкой к максимально переносимой (МПД). Все эксперименты выполнены стандартными методами с применением значимых критериев оценки и адекватной статистической обработки результатов (p<0,05). Результаты. Для клеток MeWo и MeWo/DTIC с определенным проспективно одинаковым временем удвоения на уровне 23,0±2,3 ч и 23,1±1,8 ч DTIC был практически нецитоток-сичен, IC50=410±4 мкг/мл и IC50=860±27 мкг/ мл (критерий IC50<100 мкг/мл). Однако абсолютная величина действующих концентраций
DTIC была существенно меньше известной для пигментированной меланомы мышей, 1200-1400 мкг/мл. Лио-SAV-RGD, напротив, был цитотоксичен для обеих линий мелано-мы на пограничном уровне, IC50=100±3,1 мкг/ мл, а в диапазоне от 1 до 100 мкг/кг вызывал гибель клеток в прямой зависимости от величины концентрации. на п/к ксенограф-тах MeWo DTIC в дозе 250 мг/кг был эффективен на уровне Т/С<30% (критерий Т/ С<42%) при частичной гибели мышей от токсичности. Сочетание DTIC+лио-SAV-RGD показало идентичный эффект независимо от редукции дозы на 40%, Т/С=38% (p=0,001). Заключение. Сравнительное изучение на модели беспигментной меланомы кожи человека MeWo выявило in vitro отсутствие значимой цитотоксичности DTIC и пограничную цитотоксичность анти-интегрина avB3 лио-SAV-RGD для клеток MeWo и MeWo/DTIC. на п/к ксенографтах MeWo сочетанная терапия DTIC+лио-SAV-RGD при редукцци дозы цитостатика на 40% дала возможность получить максимальный противоопухолевый эффект (Т/С=38% против 30%) при хорошей переносимости. полученные данные позволяют предположить, что введение в схему с DTIC анти-интегрина avB3 целесообразно для повышения избирательности цитотоксического действия цитостатика.
Ключевые слова: лио-SAV-RGD, дакарба-зин, меланома человека in vitro/in vivo, эффективность, толерантность
Введение
Диссеминированная меланома кожи человека отличается чрезвычайно низкой чувствительностью к терапии. «Золотым» стандартом лечения меланомы в мире является дакарбазин (DTIC), помимо которого в лекарственную терапию диссеминированной меланомы (Дм) серьезный вклад внесен таргетными препаратами, направленными на ингибирование определенных сигнальных путей цитопролиферации [0, 2]. Ан-
ти-интегрины рассматриваются как потенциальные противоопухолевые агенты, способные ин-гибировать дифференцировку и пролиферацию различных злокачественных клеток, в т.ч., ДМ. Один из рецепторов интегринов витронектин avß3 участвует во многих этапах опухолевой прогрессии, регулирует неоангиогенез, определяет миграцию и метастатический фенотип, а также выживаемость клеток меланомы [8, 17, 13]. Связывание с интегриновыми рецепторами осуществляют рекомбинантные самособирающиеся в тетрамерные структуры слитые белки SAV-RGD, содержащие меланома-узнающий три-пептид Arg-Gly-Asp (RGD) и адапторную часть (SAV, стрептавидин) для присоединения цитоток-сического агента. RGD-содержащие цитотоксиче-ские пептиды способны селективно связываться с конкретным рецептором интегрина и запускать внутриклеточные сигнальные каскады, блокируя пролиферацию. описано множество различных RGD-мотивов нужной конформации [11]. Для реализации антиметастатического действия антагонистов рецептора как возможную мишень рассматривают экстрацеллюлярный витронектин avß3, особенно значимый для агрессивной беспигментной меланомы [14, 16]. Различные антиме-ланомные анти-интегрины, в частности, CNT095, Vitaxin и др. MK-0429, обсуждаются как компоненты схем комбинированной терапии меланомы с цитостатиками [10, 15]. В нашей работе изучен оригинальный специфически узнающий клетки меланомы рекомбинантный лиофилизированный белок SAV-RGD из штамма-продуцента MG1655/ pSAV-RGD E. Coli [3], прошедший предварительные исследования и показавший значимую анти-меланомную активность на адекватных моделях [4]. В качестве моделей меланомы кожи человека выбрана наиболее агрессивная амеланотическая MeWo/mel- (ATCC® HTB-65™) из криохранили-ща НМИЦ [5].
Материал и методы
Лио-SAV-RGD. Лиофилизированный порошок лио-SAV-RGD сер. 030313Л (m=5,0 мг) получен от авторов [3]. Рабочие растворы готовили в растворе Хенкса до получения нужных концентраций: in vitro 1-100 мкг/мл c контролем результата через 24 и 72 ч, in vivo - при ранее найденной оптимальной схеме в/б ежедневно в суммарной дозе 900 мг/кг с удвоением первой дозы и 3-кратным контролем результата после моно- или сочетанной терапии.
Дакарбазин (DTIC). Использован аптечный лиофилизи-рованный дакарбазин (DTIC) («Медак ГмбХ», Германия), содержащий 100 мг действующего вещества, растворенный в физ. растворе и добавленный в культуральную среду или введенный мышам в нужных концентрациях и объемах. При оценке цитотоксичности DTIC учитывали известную величину IC50 для пигментированной меланомы 1200-1400 мкг/мл [12]. В опыте in vivo использована определенная ранее единственная эффективная близкая к максимально переносимой (МПД) доза 250 мг/кг.
Модели меланомы кожи человека. Использованы клеточная линия MeWo из хранилища ФГБУ «НМИЦ онкологии им.Н.Н.Блохина» Минздрава России и сублиния MeWo/DTIC, полученная в рамках данной работы. Клетки культивировали в соответствии с протоколом ATCC [19]. Для получения п/к ксенографтов клетки меланом иноку-лировали под кожу бока конвенциональным половозрелым иммунодефицитным 8-ми нед. Balb/c nude мышам разведения и содержания НМИЦ [6]. Мышей делили на группы (n=10-12), которые шифровали соответственно, DTIC, SAV-RGD, DTIC+SAV-RGD и КРО (контроль роста опухоли без воздействия). MeWo инокулировали по 1*107 кл. Для получения сублинии MeWo/DTIC использовали описанную методику [9].
Оценка цитотоксичности агентов. О цитотоксичности агентов судили по ингибирующей концентрации IC50, определенной с помощью стандартного МТТ-колориметрического метода. Время удвоения популяции клеток рассчитывали по формуле Td=t x ln(2)/ln(N1/N0), где N - число клеток в начале (N0) и после (N1) культивирования в течение времени (t). Величину IC50 DTIC определяли с помощью регрессионного анализа зависимости между lg концентрации и цитотоксическим индексом в Excel 2013 («MS Office XP», США).
Оценка противоопухолевой активности. Об эффективности воздействий судили с помощью стандартной методики по соотношению средних объемов опухолей в леченой и контрольной группах мышей, выраженное в процентах, T/C%, критерий эффективности Т/С<42% [7, 8]. Терапевтический выигрыш сочетанной терапии оценивали по сравнению с группой DTIC.
Оценка переносимости терапии. Выполнена по возможной гибели мышей с признаками характерной для агента токсичности.
Статистический анализ. Результаты исследований in vitro/in vivo статистически обработаны с помощью компьютерной программы Exel 2013 и Exel для Windows 2007 с использованием критерия Т-test Фишера, значимыми считали различия при p<0,05.
Результаты
Сравнительная цитотоксичность in vitro DTIC и лио-SAV-RGD
Исследование выполнено после определения времени удвоения популяции использованных моделей MeWo и MeWo/DTIC, а ингибирую-щая концентрация DTIC существенно увеличивалась на резистентной сублинии и составляла IC50=860±27 мкг/мл против IC50=410±4 мкг/мл для MeWo (табл. 1).
Таблица 1. Цитотоксичность DTIC на MeWo и MeWo/DTIC
Линия клеток IC50 DTIC, мкг/мл
MeWo* 410±40
MeWo/DTIC** 860±27
Примечание: Время удвоения клеток опухоли *23,1±1,8 ч; **23,0±2,3 ч
Лио-SAV-RGD, изученный в диапазоне концентраций 1-10-100 мкг/мл показал цитотоксичность в зависимости от величины примененной концентрации. Процент погибших клеток возрастает с увеличением концентрации лио^АУ-
RDG практически одинаково в обеих моделях. максимальный процент 31-32% гибели клеток получен при концентрации 100 мкг/мл. Следовательно, лио-SAV-RGD сохраняет цитотокси-ческую активность в отношении клеток, резистентных к DTIC (табл. 2).
Таблица 2. Цитотоксичность лио-SAV-RGD на MeWo и MeWo/ DTIC
Концентрация лио-SAV-RGD, мкг/мл % погибших клеток
Ме\Мо Ме\«о^ТЮ
1,0 -1 -2%
10,0 11 14
100,0 32 31*
Примечание: *все различия с группой МеШо недостоверны, р>0,05. Сравнительная эффективность на MeWo DTIC и DTIC+лио-SAV-RGD
В группе мышей, получившей 250 мг/кг DTIC, наблюдали достоверное ингибирова-ние роста опухолевых узлов MeWo вплоть до 21 сут опыта по сравнению с группой кро: Vcp=108±22,8 мм3 против Vcp=389±52,8 мм3 на 3 сут, Vcp=201±95,1 мм3 против Vcp=564±195 мм3 на 7 сут и Vcp=253±101 мм3 против Vcp=588±182 мм3 (р<0,05) на 10 сут после лечения (рис. 1). Соответственно, т/С=54, 28 и 30% ф<0,05).
Переносимость лечения DTIC была неудовлетворительной, т.к. 2 мыши погибли от токсичности при резком уменьшении массы селезенки (косвенный признак характерной гематологической токсичности) на 10-й, 11-й дни после лечения. Полученные данные свидетельствуют о том, что эффективная доза 250 мг/кг близка к максимально переносимой (мПД).
Рис. 1. Динамика роста подкожно трансплантированной меланомы человека Ме\Ио после однократного внутрибрюшинного введения DTIC в дозе 250 мг/кг; верхняя кривая - КРО, нижняя кривая - DTIC 250 мг/кг
рис.
2. Сравнительная динамика роста меланомы человека Ме\Ио на фоне сочетанного лечения по схеме DTIC 150 мг/кг
и лио-SAV-RGD 900 мг/кг против DTIC 250 мг/кг
Сочетанная терапия MeWo по схеме DTIC 150 мг/кг + SAV-RGD 900 мг/кг сразу после окончания показала достоверное ингиби-рование роста опухолевых узлов с нарастанием эффекта в течение следующей недели, Т/С%=44-38-36% (р<0,05). В группе сравнения, получившей один DTIC в полной дозе 250 мг/кг, эффективность была практически идентичной первому опыту, Т/С=44-42-36% (р<0,05). Кривые роста опухолей (рис. 2) иллюстрируют динамику развития описанных эффектов. Переносимость сочетанной терапии в отличие от одного DTIC в полной дозе была удовлетворительной, гибели мышей от токсичности не наблюдали.
Заключение
Сравнительное изучение анти-интегрина avß3 лио-SAV-RGD на модели беспигментной меланомы кожи человека MeWo выявило in vitro отсутствие значимой цитотоксичности DTIC и пограничную цитотоксичность анти-интегрина avß3 лио-SAV-RGD для клеток MeWo и MeWo/ DTIC. На п/к ксенографтах MeWo сочетанная терапия DTIC+лио-SAV-RGD при редукцци дозы цитостатика на 40% дала возможность получить максимальный противоопухолевый эффект (Т/ С=38% против 30%) с улучшением переносимости. Полученные данные позволяют предположить, что введение в схему антимеланомной химиотерапии с DTIC анти-интегрина avß3 целесообразно для повышения избирательности цитотоксического действия цитостатика.
ЛИТЕРАТУРА
1. Демидов Л.В., Харкевич Г.Ю. Адъювантное лечение больных меланомой кожи // Практическая онкология.
- 2001. - № 4 (8)(декабрь). - С. 42-49.
2. Демидов Л.В., Орлова К В. Индивидуализация лекарственного лечения меланомы кожи // Практическая онкология. - 2013. - Т. 14. - № 4. - C. 239-246.
3. Рубцов М.А., Сыркина М.С., Вейко В.П. и др. Способ получения рекомбинантного белка SAV-RGD. - Патент №2577138, 2016.
4. Рубцов М.А., Маслакова А.А., Поташникова Д.М., Вейко В.П., Сыркина М.С. Тетрамерный RGD вызывает кластеризацию рецепторов интегрина avß3 на поверхности клеток меланомы человека и снижает их выживаемость // Вестник Московского Университета. Химия. - 2016. - Т. 57. - № 4. - С. 235-244.
5. Трещалина Е.М. Коллекция опухолевых штаммов человека / под ред. М.И. Давыдова. - М., Практическая медицина, 2009. - С. 176.
6. Трещалина Е.М. Иммунодефицитные мыши Balb/c nude и моделирование различных вариантов опухолевого роста для доклинических исследований // РБЖ.
- 2017. - Т. 16. - № 3. - С. 6-13. - DOI: 10.17650/17269784-2017-16-3-6-13.
7. Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К. и др. Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств / В кн.: Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: изд. Гриф и К. - 2012. - гл. 39. - С. 642-657.
8. Anticancer Drug Development Guide. Preclinical screening, clinical trials, and approval. Second edt./edt. by B.A.Teicher and P.A.Andrews. 2004.
9. Berger W., Hauptmann E., Elbling L. et al. Possible role of the multidrug resistence-associated protein (MRP) in chemoresistance of human melanoma cells // Int. J. of Cancer. - 1997. - Vol. 71(1). - P. 108-115.
10. Chen Q., Manning C.D., Millar H. et al. CNTO 95, a fully human anti av integrin antibody, inhibits cell signaling, migration, invasion, and spontaneous metastasis of human breast cancer cells // Clin. Exp. Metastasis. -2008. - Vol. 25. - P. 139. - https://doi.org/10.1007/ s10585-007-9132-4.
11. Holig P., Bach М., Volkel Т., Nahde Т. et al. Novel RGD lipopeptides for the targeting of liposomes to integrin-expressing endothelial and melanoma cells // Protein Eng. Des. Sel. - 2004. - Vol. 17. - P. 433-441. - D0I:10.1093/ protein/gzh055.
12. Javad B., Elaheh A., Najme N., Farzaneh S.-A. The Cytotoxicity of Dacarbazine Potentiated by Sea Cucumber Saponin in Resistant B16F10 Melanoma Cells through Apoptosis Induction // Avicenna Journal of Medical Biotechnology. - 2016. - Vol. 8. - № 3. - P. 112-116.
13. Khan Z., Marshall J.F. The role of integrins in TGF-activation in the tumour stroma // Cell Tissue Res. -2016. - Vol. 365. - P. 657-673.
14. Lavergne M., Janus-Bell E., Schaff M. et al. Platelet Integrins in Tumor Metastasis: Do They Represent a Therapeutic Target? // Cancers. - 2017. - Vol. 9. - № 10. - P. 1-17. -doi:10.3390/cancers9100133.
15. Pickarski M., Gleason A., Bednar B., Duong L.T. orally active v3 integrin inhibitor MK-0429 reduces melanoma metastasis // Oncol Rep. - 2015. - Vol. 33. - № 6. - P. 2737-2745. - doi: 10.3892/or.2015.3910.
16. Syrkina M.S., Rubtsov M.A., Shirokov D.A., Veiko V.P. Fusion proteins capable of selective binding to melanoma cells for investigation of the mechanisms of cell malignization //FEBS Journal, Blackwell Publishing Inc. (United Kingdom). - 2013. - Т. 280. - С. 324-324.
17. Syrkina M.S., Shirokov D.A., Rubtsov M.A. et al. Preparation and funcional evaluation of RGD-modified streptavidin targeting to integrin-expressing melanoma cells//Protein Engineering, Design and Selection, oxford University Press(United Kingdom). - 2013. - Vol. 26. - № 2. - С. 143-150.
18. Rubina K.A., Surkova E.I., Semina E.V. et al. T-Cadherin Expression in Melanoma Cells Stimulates Stromal Cell Recruitment and Invasion by Regulating the Expression of Chemokines, Integrins and Adhesion Molecules // Cancers. - 2015. - Vol. 7. - P. 1349-1370. - doi: 10.3390/ cancers7030840.
19. Wright W.C., Daniels W.P., Fogh J. Distinction of seventy-one cultured human tumor cell lines by polymorphic enzyme analysis // J. Natl. Cancer Inst. - 1981. - Vol. 66. - P. 239-247.
Поступила в редакцию 30.10.2018 г.
H.M. Treshalina, S.Sh. Karshieva, N.Yu. Anisimova, S.M. Sitdikova, M.V. Kiselevsky
Anti-integrin avB3 SAV-RGD as combinant for dtic with human amelanotic skin melanoma
N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Moscow
Introduction. The avB3 integrin (cell adhesion molecule) plays the role of the receptor, including, metalloproteinase matrix 2, involved in melanoma metastasis. We have been characterized as an anti-melanoma original anti-integrin agent SAV-RGD (lyo-SAV-RGD), specifically binding to melanoma cells by means of the Arg-Gly-Asp tripeptide. More significant inhibited effect was obtained on amelanotic human skin melanoma MeWo. Accordingly, the experimental evaluation of the effectiveness of lyo-SAV-RGD in combination with the «gold» standard of anti-melanoma chemotherapy dacarbazine (DTIC) is relevant. Objective: a comparative study of the combination of DTIC+lyo-SAV-RGD on the model of pigmented melanoma of human skin MeWo. Material and methods. The model of human skin melanoma MeWo in vivo/in vitro: s.c. xenografts in Balb/c nude mice, sensitive to DTIC cell line MeWo and obtained prospectively stable subline MeWo/DTIC was used. In vitro experiments the time of cell doubling in both models was determined and the individual range of agent concentrations was studied. Therapy with DTIC+lyo-SAV-RGD were administered in simultaneously sequentially, first the single 150 mg/kg DTIC, then lyo-SAV-RGD 9-fold course in the total dose of 900 mg/kg (the first dose is doubled). To control of the group with single dose 250 mg/kg of DTIC close to the maximum tolerated dose (MTD). All experiments were performed by standard methods using significant evaluation criteria and adequate statistical processing of the results (p<0.05). Results. For MeWo and MeWo/DTIC cells with a certain prospectively identical doubling time of the doubling time of tumor cells (Tpot) at the level of 23.0±2.3 h and 23.1±1.8 h, DTIC was practically non-cytotoxic, IC50=410±4 ^g/ml and IC50=860±27 ^g/ml (IC50<100 ^g/ml). However, the absolute value of the active concentrations of DTIC was significantly less known for murine pigmented melanoma, 1200-1400 ^g/ ml. Lyo-SAV-RGD, on the contrary, was cytotoxic for both melanoma variants at the same level, IC50=100±3.1 ^g/ml, and in the range from 1,0 to 100 ^g/kg caused cell death in direct dependence on the concentration. On s.c. MeWo xe-nografts DTIC at the dose of 250 mg/kg was effective at T/ C<30% (criterion T/C<42%) with partial death of mice from toxicity. The combination of DTIC+lyo-SAV-RGD showed an identical effect regardless of dose reduction by 40%, T/C=38% (p=0.001). Conclusion. A comparative study on the model of human skin melanoma MeWo revealed in vitro the absence of significant cytotoxicity of DTIC and at the same time cy-totoxicity of anti-integrin avB3 lyo-SAV-RGD for MeWo and MeWo/DTIC cells. On xenografts MeWo combined therapy DTIC+lyo-SAV-RGD with dose reduction cytostatic 40% made it possible to obtain the maximum antitumor effect (T/C=38% vs 30%) with improved tolerability. The obtained data suggest that the introduction of anti-integrin avB3 into the scheme with DTIC is advisable to increase the selectivity of cytotoxic action of cytostatics.
Key words: lyo-SAV-RGD, dacarbazine, human melanoma in vitro/in vivo, efficacy, tolerance
