CC BY
3©Коллектив авторов, 2019 Вопросы онкологии, 2019. Том 65, № 3
УДК 616-006.81
Е.М. трещалина, н.В. Андронова, г.Б. Смирнова, Е.н. Шолохова, н.н. тупицын, Ю.А. Борисова, и.н. Михайлова, С.М. Ситдикова,
М.В. Киселевский
Противоопухолевая активность анти-интегринового белка SAV-RGD на ксенографтах меланомы кожи человека с экспрессией интегрина avß3
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина» Министерства здравоохранения российской Федерации,
Москва
Анти-интегрины рассматриваются как потенциальные противоопухолевые агенты, способные ингибировать дифференцировку и пролиферацию различных злокачественных клеток, в т.ч., диссеминированной меланомы. Обсуждается возможность включения анти-интегринов с различными RGD-мотивами в схемы комбинированной терапии. Нами изучен оригинальный рекомбинантный лиофили-зированный белок SAV-RGD (лио-SAV-RGD), специфически связывающийся с клетками меланомы посредством трипептида Arg-Gly-Asp. В качестве моделей меланомы кожи человека выбраны амеланотическая MeWo/ mel- и пигментированная mel Cher/mel+ с проспективно определенной экспрессией маркера, дающие п/к ксенографты у мышей Balb/c nude. Цель: оценка противоопухолевой активности лио-SAV-RGD in vivo на моделях меланомы кожи человека melCher и MeWo с различной способностью к меланиногенезу и экспрессией интегрина avB3. Показано, что обе меланомы in vitro экспрессируют инте-грин avP3, выявленный на клетках melCher/ mel+ с флуоресцентно-мечеными крысиными антителами Luc.Hll по экспрессии компонента интегринов avP3, Р3-цепей (CD61), а на клетках MeWo/mel- с антителами 23С6. В высокой терапевтической суммарной дозе 900 мг/кг лио-SAV-RGD при удовлетворительной переносимости ингибировал рост обеих ме-ланом in vivo. В сравнении с melCher/mel+ более чувствительной к лечению оказалась MeWo/mel-: T/Cmin=30% (p<0,05) против T/ Cmin=50% (p=0,001). Эффект на melCher/ mel+ получен только в экспоненциальной фазе роста опухоли. полученные результаты позволяют считать целесообразным углубленное доклиническое изучение анти-интегри-
на SAV-RGD, ориентированное на наиболее агрессивную диссеминированную амеланоти-ческую меланому кожи, независимо от характера блокирования экспрессии рецептора.
Ключевые слова: SAV-RGD, ксенографты, меланома человека, экспрессия аурЗ, противоопухолевый эффект
Введение
Интегрины ау играют важную роль в неоанги-огенезе при новообразовании капиллярной сети (неоангиогенез), основную часть архитектоники кровоснабжения солидных опухолей. Поэтому анти-интегрины рассматриваются как потенциальные противоопухолевые агенты, способные ингибировать дифференцировку и пролиферацию различных злокачественных клеток, в т.ч., диссеминированной меланомы. Например, один из рецепторов интегринов витронектин ауВ3 участвует во многих этапах опухолевой прогрессии, регулирует неоангиогенез, определяет миграцию и метастатический фенотип, а также выживаемость злокачественных клеток различного гистогенеза, в т.ч. меланомы [7, 11, 12].
Связывание с интегриновыми рецепторами осуществляют рекомбинантные самособирающиеся в тетрамерные структуры слитые белки SAV-RGD, содержащие меланома-узнающий трипептид Arg-Gly-Asp (RGD) и адапторную часть ^АУ, стрептавидин) для присоединения цитотоксического агента. RGD-содержащие пептиды способны оказывать цитотоксический эффект и запускать внутриклеточные сигнальные каскады, приводящие к блокированию пролиферации и гибели. Для селективного связывания с конкретным рецептором интегрина на поверхности клеток меланомы и эндотелия опухолевых сосудов человека и мыши предложено множе-
ство различных RGD-мотивов нужной конфор-мации [б]. Экстрацеллюлярный витронектин avß3 рассматривают как возможную мишень для реализации антиметастатического действия при действии антагонистов рецептора [8, 13]. Для лечения меланомы кожи или ее метастазов получены различные агенты, направленные на альфа-интегрины, в частности, CNT095, Vitaxin и др. MK-0429. Обсуждается возможность включения таких агентов в схемы комбинированной терапии меланомы с цитостатиками [5, 10]. Для нейроонкологии разработан высокоселективный ингибитор интегринов avß3 и avß5 циклический пептид Циленгитид (Cilengitide, «Merck KGaA», Германия), специфичность связывания с мишенью которого определялась фрагментом RGDfV (Arg-Gly-Asp-(D-Phe)-Val [б, 9].
В настоящем исследовании использован отечественный лиофилизированный специфически узнающий клетки меланомы рекомбинант-ный белок SAV-RGD из штамма-продуцента MG1655/pSAV-RGD E. tali [1]. Для определения экспрессии маркера использованы 2 линии клеток перевиваемой меланомы кожи человека MeWo (ATCC ® HTB-65™) и mel Cher с различной способностью к меланиногенезу и проспективно определенной экспрессией маркера. Оценка эффективности лио-SAV-RGD выполнена на полученных из этих клеток п/к ксенографтах у мышей Balb/c nude [2].
Цель и задачи: оценка антипролиферативных свойств лио-SAV-RGD in vivo на моделях мела-номы кожи человека mel Cher и MeWo с различной способностью к меланиногенезу и экспрессией интегрина avß3.
Материал и методы
Иммунофенотипирование. Иммунофенотипирование перевиваемых меланом выполнено в культуре клеток стандартным методом непрямой иммунофлуоресценции (пМФА) с коммерческими моноклональными антителами (мКА) CD61, SantaCruz и 2ЗС6 [4]. Сущность метода флюоресцирующих антител заключается в визуализации реакции антиген-антитело люминесцентными маркерами. Учет реакции проводили на проточном цитометре.
Лабораторные животные. В опытах использовали 80 особей половозрелых мышей-самцов Balb/c nude 8-не-дельных массой тела 19-22 г из разведения НИМЦ, которых содержали в конвенциональных условиях специализированного кондиционированного отсека [З]. Для введения в эксперимент мышей делили на группы по б-8 особей в каждой. После завершения опытов мышей умерщвляли передозировкой эфирного наркоза в соответствии с методами гуманного обращения в лабораторными животными, принятыми в РФ и за рубежом.
Опухолевые модели. Для определения экспрессии интегрина использованы клеточные линии и п/к ксено-графты перевиваемых меланом кожи человека амелано-тическая Me Wo/mel- и пигментированная mel Cher/mel+ из Коллекции ФГБУ «НМИЦ онкологии им.Н.Н.Блохина»
Минздрава России (НМИЦ) [2]. Трансплантацию каждой меланомы выполняли по 1x107 клеток мышам Balb/c nude п/к билатерально, соответственно, в каждой группе число опухолевых узлов составляло 12-16. Все эксперименты с опухолевым материалом in vitro/in vivo проведены и анализированы в соответствии с действующими в РФ.
Исследуемый агент. Отечественный лиофилизирован-ный специфически узнающий клетки меланомы рекомби-нантный белок SAV-RGD из штамма-продуцента MG1655/ pSAV-RGD E. Coli в форме порошка получен от авторов. Агент растворяли ex tempore в стерильном физ. растворе и вводили мышам ежедневно в/б на 3-10 сутки после трансплантации меланомы в суммарной дозе 900 мг/кг с удвоением первой дозы.
Определение эффективности лио-SAV-RGD. Оценку эффективности лио-SAV-RGD выполняли с использованием показателя Т/С<42% («treatment/control»), который вычисляли по средним объемам (Vcp, мм3) 3-кратно в процессе и после окончания курса лечения [3]. Учитывая биологические особенности модели, например, восстановление меланиногенеза и замедление роста при пассировании, проведены 2 дополнительных измерения опухолей в экспоненциальной фазе роста, т.е. на фоне лечения.
Статистическая обработка данных. Статистическая обработка данных проведена с помощью компьютерной программы Exel для Windows 2007 с использованием Ttest, значимыми считаются различия при p<0,05.
Результаты
Иммунофенотипирование культур клеток меланомы. Из иллюстраций видно (рис. 1), что ин-тегрин avP3 экспрессируется на клетках MeWo/ mel- с помощью мышиных антител 23С6 к человеческому интегрину avP3, а на клетках меланомы человека mel Cher/mel+ с использованием флуоресцентно-меченых крысиных антител Luc. H11 (Р3-цепи, CD61).
Эффективность лио-SAV-RGD на п/к ксенографтах mel Cher
Видно (табл. 1), что в группе КРО без лечения меланома mel Cher/mel+ после трансплантации растет относительно медленно. На 10, 14, 20 и 23 сутки п/к роста опухолевые узлы достигают Vcp=65±13,3 мм3; Vcp=111± 35,2 мм3; Vcp=130±31,7 мм3 и Vcp=155±22,9 мм3, соответственно. Гибель мышей от опухоли наступала на 23 сутки после трансплантации. В группе, получившей лио-SAV-RGD, опухоли были существенно меньше и достигли, соответственно на 2, 6, 10 и 13 сутки после окончания лечения Vcp=35±15 мм3; Vcp=56±23,3 мм3; Vcp=70±37,6 мм3; Vcp=92±70,1 мм3. На последнем сроке 2 мыши пали от опухоли. Рассчитанные показатели эффективности составляли, в среднем, Т/ С=50-59%, что больше критерия эффективности (Т/С<42%). Следует отметить, что до 10-го дня после окончания курса лечения опухоли были достоверно меньше контрольных (p=0,01-0,001), но затем возобновили рост. Анализ переноси-
—1 —1
1
А 4« ним!
14 и« г" 1' 1 1 ■и к
Е Л: Н
У" 1,1 1
1 г 1 3 ч ■
1 1 ■ II
»1 1 1 и
* 11
' 1 \ ■ ш
- 1 V \ и
11
IV 4 иё 4 я!
А. Б,
Рис. 1. Гистограммы интенсивности флуоресценции (проточная цитометрия) Ерк^ЕХсеМ^ клеток меланомы человека с МКА к человеческому интегрину а
А. Клетки MeWo/mel- окрашены мышиными антителами 23С6, докраска FITC-мечеными антителами к иммуноглобулинам мыши. По оси абсцисс - интенсивность флуоресцентного сигнала.По оси ординат - количество событий. Пунктирная линия - реакция антител 23С6. Сплошная линия - контрольное окрашивание. Антитела Luc.HH дают положительную реакцию с клетками опухоли.
Б. Экспрессия 33-цепей (CD61) на клетках те1 СЬюг/те1+. ИФА-окрашивание клеток антителами 23С6. По оси абсцисс - интенсивность флуоресцентного сигнала. По оси ординат - количество событий. Красный цвет - окраска антителами Luc.HH. Черный цвет - контроль
Таблица 1. Эффективность лио-SAV-RGD в оптимальной суммарной дозе 900 мг/кг на п/к ксенографтах меланомы человека mel Cher/mel+
№ опухоли Результаты измерения объема опухолей (мм3) на сутки после имплантации / сутки после окончания лечения
10/2 14/6 20/10 23/13
КРО SAV-RGD КРО SAV-RGD КРО SAV-RGD КРО SAV-RGD
65 35 111 56 130 70 155 92
Станд.отклон. 13,27 15,03 35,17 23,26 31,67 37,63 22,97 70,12
Т/С% 54 50 54 59
Ttest Р= 0,003 0,001 0,01 0,17
<0,05 >0,05
Таблица 2. Динамика роста меланомы человека MeWo/mel- под действием SAV-RGD при ежедневном внутрибрюшинном введении лио-SAV-RG в суммарной дозе 900 мг/кг
п=16 Результаты измерения опухолей на сутки после имплантации опухоли/ сутки после окончания лечения
12/1 15/4 19/8 22/11 25/14
КРО SAV- RGD КРО SAV- RGD КРО SAV- RGD КРО SAV- RGD КРО SAV- RGD
189 78 377 176 791 467 1325 794 1716 1335
Станд.отклон. 70,35 22,64 153,11 62,33 278,35 139,89 473,48 211,00 718,34 289,02
Т/С% 41% 47% 59% 60% 78%
(Ttest) 0,000016 0,00004 0,0009 0,0013 =0,1
Р <0,05
мости лечения, в т.ч. преждевременной гибели мышей показал отсутствие каких-либо побочных эффектов.
Эффективность лио-SAV-RGD на п/к ксенографтах MeWo/mel-
Эксперименты на меланоме MeWo/mel-, перевитой из культуры клеток подкожно мышам Balb/c nude, проведены при ежедневном внутри-брюшинном дискретном введении лио-SAV-RGD в суммарной дозе 900 мг/кг.
Показано (табл. 2), что в течение 3-х недель после подкожной имплантации культуры клеток мышам Balb/c nude меланома MeWo/mel- без специфического лечения (КРО) растет достаточно быстро. Начиная от 12 суток после перевивки, пальпируемые опухоли от Vcр=70,35 мм3 увеличивались в течение последующих 2-х недель в 10,2 раза, достигая Vcp=1716 мм3. В группе мышей, получившей SAV-RGD, достигнуто значимое ингибирование роста опухоли с высокой степенью достоверности различий в сравнении с группой контроля. На 1 сутки Vcp=78 мм3 против 189 мм3 (р=0,00001б), на 4 сутки Vcp=176 мм3 против 377 мм3 (p=0,00004) и на 8 сутки Vcp=467 мм3 против 791 мм3 (p=0,0009), на 11 сутки Vcp=794 мм3 против 1325 мм3 (p=0,0013). Показатели эффективности на эти сроки были на уровне или близки к пороговой величине: Т/ C=41%, 47%, 49% и 50%%, соответственно.
Переносимость лечения лио-SAV-RGD во всех изученных дозовых режимах удовлетворительная.
Заключение
Объектом исследования была лиофили-зированная субстанция рекомбинантного белка SAV-RGD, полученного на основе самособирающегося в тетрамерные структуры слитого белка, содержащего меланома-узнающий трипептид Arg-Gly-Asp (RGD) и адапторную часть стреп-тавидин (SAV) для присоединения токсического агента. В качестве моделей меланомы кожи человека выбраны амеланотическая MeWo/mel- и пигментированная mel Cher/mel+ с проспективно определенной экспрессией маркера, дающие п/к ксенографты у мышей Balb/c nude. Целью исследований была оценка антипролифератив-ных свойств лио-SAV-RGD in vivo на моделях меланомы кожи mel Cher и MeWo с различной способностью к меланиногенезу и экспрессией интегрина avB3. Для решения задач использованы стандартные методы непрямой иммуноф-луоресценции с МКА CD61, SantaCruz, 23С6 и экспериментальной химиотерапии. Терапия меланом лио-SAV-RGD выполнена длительно
внутрибрюшинно в суммарной дозе 900 мг/кг с удвоенной первой дозой. Изучение показало, что обе линии меланомы человека экспрессиру-ют интегрин avB3, но в реакции с различными антителами. Лио-SAV-RGD в высокой терапевтической суммарной дозе 900 мг/кг показал соответствующий объективному критерию (Т/ С<42%) воспроизводимый эффект только на ме-ланоме на MeWo/mel-. Полученные результаты позволяют считать целесообразным углубленное доклиническое изучение анти-интегрина SAV-RGD, ориентированное на наиболее агрессивную диссеминированную амеланотическую меланому кожи, независимо от характера блокирования экспрессии рецептора.
ЛИТЕРАТУРА
1. Патент №2577138, 2016. Способ получения рекомбинантного белка SAV-RGD/ Рубцов, М.А., Сыркина, М.С., Вейко, В.П., Окорокова, Н.А., Замятнин, А.А.
2. Трещалина Е.М. Коллекция опухолевых штаммов человека/под ред. М.И. Давыдова. - М., Практическая медицина, 2009. - С. 176.
3. Трещалина, Е.М. Иммунодефицитные мыши Balb/c nude и моделирование различных вариантов опухолевого роста для доклинических исследований // РБЖ -2017. - №3. - Т .16. - С. 6-13. - DOI: 10.17650/17269784-2017-16-3-6-13.
4. Тупицын Н.Н., Кадагидзе З.Г., Шатинина Н.Н. и др. Иммунодиагностика гемобластозов человека / Пособие для врачей. - М., 2003. - С. 47-49.
5. Chen, Q., Manning, C.D., Millar, H. et al. CNTO 95, a fully human anti v integrin antibody, inhibits cell signaling, migration, invasion, and spontaneous metastasis of human breast cancer cells//Clin Exp Metastasis. -2008. -№ 25. р. 139. https://doi.org/10.1007/s10585-007-9132-4.
6. H lig P., Bach М., Vlkel Т. et al. Novel RGD lipopeptides for the targeting of liposomes to integrin-expressing endothelial and melanoma cells // Protein Eng. Des. Sel.
- 2004. -№ 17. - P. 433-441. - D0I:10.1093/protein/ gzh055.
7. Khan, Z.; Marshall, J.F. The role of integrins in TGF-activation in the tumour stroma//Cell Tissue Res. -2016.
- Vol. 365. -р. 657-673.
8. Lavergne, M., Janus-Bell, E., Schaff, M. et al. Platelet Integrins in Tumor Metastasis: Do They Represent a Therapeutic Target? // Cancers. - 2017. - № 9(10). -issue 133. - P. 1-17. - doi:10.3390/cancers9100133.
9. Mas-Moruno С., Rechenmacher F., Kessler H. Cilengitide: the first anti-angiogenic small molecule drug candidate design, synthesis and clinical evaluation // Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. - 2010. - № 10. - P. 753-768.
10. Pickarski M., Gleason A., Bednar B., Duong L.T. Orally active v3 integrin inhibitor MK-0429 reduces melanoma metastasis // Oncol Rep. - 2015. - Vol. 33(6). - P. 27372745. - doi: 10.3892/or.2015.3910.
11. Rubina, K.A., Surkova, E.I., Semina E.V. et al. T-Cadherin Expression in Melanoma Cells Stimulates Stromal Cell Recruitment and Invasion by Regulating the Expression of Chemokines, Integrins and Adhesion Molecules//
Cancers. -2015. - Vol. 7(3). -р. 1349-1370. D0l:10.3390/ cancers7030840.
12. Syrkina M.S., Rubtsov M.A., Shirokov D.A., Veiko V.P. Fusion proteins capable of selective binding to melanoma cells for investigation of the mechanisms of cell malignization //FEBS Journal Blackwell Publishing Inc. (United Kingdom). - 2013. - Vol. 280, Special Issue: SI Supplement: 1. - P. 324-325.
13. Syrkina M.S., Shirokov D.A., Rubtsov M.A. et al. Preparation and funcional evaluation of RGD-modified streptavidin targeting to integrin-expressing melanoma cells /Protein Engineering, Design and Selection, 0xford University Press (United Kingdom). - 2013. - Vol. 26. -№ 2. - P. 143-150.
Поступила в редакцию 19.10.2018 г.
H.M. Treshalina, N.V. Andronova, G.B. Smirnova, E.N. Sholokhova, N.N. Tupicin, Ju.A. Borisova,
I.N. Mikhailova, S.M. Sitdikova, M.V. Kiselevsky
Antitumor activity of anti-integrin protein
SAV-RGD on xenografted human skin melanoma with integrin avB3 expression
FSBI «National Medical Research Center of Oncology of N.N. Blokhin», Ministry of Health of Russia, Moscow
Anti-integrins are considered as potential anticancer agents capable of inhibiting differentiation and proliferation of various malignant cells, including disseminated melanoma. The possibility of including anti-integrins with different RGD-motives in combined therapy schedules is discussed. We have studied the oridinal recombinant lyophilized protein SAV-RGD (lyo-SAV-RGD), specifically binding to melanoma cells by means of the Tripeptide Arg-Gly-Asp. As models of melanoma of the skin selected amalonaticus MeWo/mel- and pigmented melCher/mel+ with prospectively certain expression of the marker, giving subcutaneous xenograft in mice Balb/c nude. Objective: to evaluate the antitumor activity of lyo-SAV-RGD in vivo on human skin melanoma models melCher and MeWo with different melanogenesis ability and integrin avB3 expression. Both melanomas in vitro were shown to express integrin avB3 detected in melCher/mel+ cells with fluorescent-labeled rat antibodies Luc.Hll according to the expression component integrins avp3, p3-chain (CD61), and MeWo cells/mel- antibodies 23C6. In a high therapeutic total dose of 900 mg/kg, lyo-SAV-RGD inhibited growth of both melanomas in vivo with satisfactory tolerability. Compared to melCher/mel+, MeWo/mel-: T/Cmin=30% (p<0.05) versus T/ Cmin=50% (p=0.001) was more sensitive to treatment. The effect on melCher/mel+ was obtained only in the exponential phase of tumor growth. The results obtained allow us to consider it expedient to conduct an in-depth preclinical study of anti-integrin SAV-RGD, focused on the most aggressive disseminated amelanotic melanoma of the skin, regardless of the nature of blocking receptor expression.
Keywords: SAV-RGD, xenograft, melanoma human, expression avp3, antitumor effect
