CC BY
11
38
Оригинальные статьи
значение базальиой экспрессии гемоксигеназы-1 для чувствительности клеток меланомы человека к окислительному стрессу in vitro
т.А. Сидорова, Э.Ш. Соломко, Ю.А. Хоченкова, A.A. Прокофьева, д.А. Хоченков
ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России;
Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Татьяна Александровна Сидорова tatsid@yahoo.com
Введение. Молекулярная основа механизма действия радио- и фотодинамической терапии, а также ряда противоопухолевых химиопрепаратов — окислительный стресс (OS). Фермент гемоксигеназа-1 (НО-1), молекулярный маркер OS — ключевой участник системы защиты и адаптации опухолевых клеток в условиях стресса.
Цель исследования — выяснить, зависит ли чувствительность опухолевых клеток меланомы человека к OS от базального и индуцированного модуляторами уровня экспрессии гена НО-1.
Материалы и методы. В работе были использованы опухолевые клетки меланомы человека разных линий. Экспрессию мРНК НО-1 в клетках изучали методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени, содержание активных форм кислорода в клетках — методом проточной цитометрии, цитотоксичность препаратов — с применением МТТ-метода.
Результаты. По нашим данным, клетки меланомы человека имеют разные по величине базальные уровни транскрипции НО-1: высокий (3,0—3,5 о. е.) у линий MellL, MelP, средний (1,5 о. е.) у линий MeWo, MelZ, Mellbr и низкий (0,5 о. e.) у Ме1Ме, A375). Установлено, что чувствительность клеток к Н2О2, индуктору OS, не зависит от величины базальной экспрессии НО-1. Гемининдуцированное увеличение базальной экспрессии НО-1 обнаружено только в клетках меланомы со средним (MeWo) и низким (А375) уровнями этого параметра и сопровождается увеличением их устойчивости к Н2О2 (в 2 раза). Определено, что репрессия НО-1 в присутствии апигенина регистрируется в клетках меланомы с разным базальным уровнем, однако сенситизация к Н2О2 (2—4 раза) наблюдалась только для клеток со средним (MeWo) и низким (А375) уровнями базальной экспрессии НО-1. Выявлено, что снижение базальной экспрессии НО-1, индуцированное апигенином, сопровождается увеличением содержания активных форм кислорода в клетках и вносит вклад в увеличение чувствительности их к Н2О2. Заключение. Результаты нашего исследования показывают значение природного флавона апигенина в качестве модулятора экспрессии HO-1.
Ключевые слова: меланома человека, гемоксигеназа-1, гемин, апигенин
Для цитирования: Сидорова Т.А., Соломко Э.Ш., Хоченкова Ю.А. и др. Значение базальной экспрессии гемоксигеназы-1 для чувствительности клеток меланомы человека к окислительному стрессу in vitro. Российский биотерапевтический журнал 2020;19(3):38—45.
DOI: 10.17650/1726-9784-2020-19-3-38-45
the value of basal expression level of hemoxygenase-1 for sensitivity of human melanoma cells to oxidative stress in vitro
T. A. Sidorova, E.Sh. Solomko, Yu. A. Khochenkova, A .A. Prokofieva, D. A. Khochenkov
N. N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology of the Ministry of Health of the Russian Federation;
24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia
Introduction. The molecular basis of radio- and photodynamic therapy (PDT), the mechanism of action of a number of antitumor chemotherapy drugs is oxidative stress (OS). The enzyme hemoxygenase-I (HO-1), a molecular marker of OS, is a key participant in the system of protection and adaptation of tumor cells under stress.
Objective. To find out whether the sensitivity of human melanoma tumor cells to OS depends on the basal and modulator-induced levels of HO-1 expression
Material and methods. Human melanoma cell lines were used in the study. The expression of mRNA HO-1 in cells was studied by real-time RT-PCR, the reactive oxygen species content in cells — by flow cytometry and the cytotoxicity of drugs — by MTT assay.
Оригинальные статьи 39
Results. According to our data, human melanoma cells have different basal levels of HO-1 transcription: high (3.0—3.5 o. u.) in lines MellL, MelP, medium (1.5 o. u.) in lines MeWo, MelZ, Mellbr and low (0.5 o. e.) — MelMe, A375).There is no direct correlation between the level of basal cell expression of HO-1 and their sensitivity to the OS inducer — H2O^ The hemin-induced increase in HO-1 expression in cells is accompanied by doubled resistance to H2O2. It was found that HO-1 repression in the presence of apigenin was registered in melanoma cells with different basal levels, but sensitization to H2O2 (2—4 times) was observed only for cells with medium (MeWo) and low (A375) levels of basal HO-1 expression. It was found that the decrease in basal expression of HO-1 induced by apigen-in is accompanied by an increase in the reactive oxygen species content in cells. Conclusions. The results of our research allow us to recommend natural flavon apigenin, a modulator of HO-1 expression, for inclusion in the chemotherapy and PDTregimens to increase the effectiveness of human melanoma treatment. Key words: human melanoma cell lines, hemoxygenase-1, hemin, apigenin For citation: Sidorova T.A., Solomko E.Sh., Khochenkova Yu.A. et al. The value of basal expression level of hemoxygenase-1 for sensitivity of human melanoma cells to oxidative stress in vitro. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2020;19(3):38—45. (In Russ.). Введение ется повреждением гемопротеинов, и, как следствие, Меланома кожи (МК) — распространенное зло- в клетке появляется «свободный» гем. Для защиты качественное новообразование кожных покровов, от избытка «гемового» железа в клетке активируется которое обладает способностью быстро метастазиро- система гемоксигеназа-1 (НО-1)/ферритин (Ft). Уставать и слабой чувствительностью к химиотерапии новлено, что УФ является индуктором экспрессии вследствие активирующих мутаций, что определяет НО-1 (мРНК/ белка) в опухолевых клетках [7]. причину высокой смертности больных [1]. В основе Можно предположить, что в ходе адаптации низкой эффективности химиотерапии МК лежит ис- к стрессорному УФ-воздействию меланоциты, пред-ходная устойчивость опухолевых клеток к цитоста- шественники меланомы, приобретают для защиты тикам: алкилирующим препаратам (дакарбазин, темо- от OS конститутивно-активную систему HO-1/Ft золомид), препаратам платины, винкаалкалоидам [2]. с «канонической» функцией, участвующей в поддер-Полагают, что молекулярные механизмы исходной жании гомеостаза внутриклеточного пула железа. устойчивости клеток меланомы к химиотерапии при- Кроме того, нельзя исключить существование в клет-обретаются в процессе опухолевого патогенеза и мо- ках меланомы «неканонических» изоформ НО-1, гут быть связаны с воздействием внешних факторов, которые в ряде опухолевых клеток вовлечены в регу-в первую очередь ультрафиолетового (УФ) излучения. ляцию транскрипции генов (ядерная изоформа НО-1) Установлено, что молекулярно-биологические изме- [8] или в пролиферативную активность (цитоплазма-нения в меланоцитах, индуцированные УФ-излуче- тический вариант НО-1, индуцируемый ультрафио-нием, играют роль в развитии МК [3]. УФ-излучение, летом) [9]. взаимодействуя с эндогенными хромофорами, таки- Ранее нами было показано, что миеломонобласты ми как нуклеиновые кислоты, белки, порфирины, человека линии U937, имеющие базальный уровень флавины и меланин, становится триггером биологи- экспрессии HO-1, оказались в 2 раза устойчивее к воз-ческих процессов в клетках кожи: специфических действию Н2О2 по сравнению с эритробластами ли-мутаций и окислительного стресса (OS), развиваю- нии К562, в которых исходно транскрипция HO-1 за-щегося в клетке вследствие нарушения баланса окис- блокирована. В условиях активации системы НО-1 /Ft лителей-восстановителей. гемином (FePPIX), сопровождаемой увеличением Эндогенные хромофоры — источники активных экспрессии HO-1 и Ft, цитотоксичность Н2О2 для лей-форм кислорода (ROS), таких как супероксид-анион козных клеток линии U937 снижается [10]. В насто-(О^), радикал гидроксила (О№) и Н2О2. Известно, ящей работе мы попытались выяснить, существует ли что ROS при низких концентрациях становятся ме- связь между уровнем экспрессии HO-1 в опухолевых диаторами в сигнальных процессах клетки [4], но их клетках и их чувствительностью к OS. гиперпродукция может привести к активации этих Цель настоящей работы — исследовать значение путей, вызывая стимуляцию пролиферации или апоп- уровня транскрипции гена НО-1 для чувствительно-тоз [5]. Полагают, что ROS как регуляторы сигналь- сти клеток меланомы человека к OS. Нам предстояло ных путей клетки могут быть вовлечены в патогенез определить базальный уровень экспрессии НО-1 меланомы [6]. в клетках меланомы человека разных линий, сопо- В условиях длительного стресса (УФ), сопрово- ставить величину базальной экспрессии НО-1 с чув-ждаемого накоплением ROS в клетках, вырабатыва- ствительностью клеток к Н2О2, индуктором OS, вы-ются защитные механизмы, необходимые для их яснить, влияет ли модуляция базальной экспрессии адаптации и выживания. Развитие OS сопровожда- НО-1 (ир-регуляция гемином и down-регуляция
3'2020 том 19 | vol. 19 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BiOTHERAPY
40 Оригинальные статьи
апигенином (Api)) в клетках меланомы на их чувстви-
тельность к Н2О2.
Материалы и методы
В работе были использованы препараты и химические соединения: TRIzol, МТТ, H2O2, FePPIX, Api, 2,7-дихлорфлуоресцеин диацетат (DCFH-DA), Hepes, PBS (Sigma, США), дакарбазин (Vferopharm, Россия); ферменты: обратная транскриптаза M-MuLV, поли-мераза Tag, реакционные буферы (Fermentas, Литва); смесь дезоксинуклеотидов, гексамеры, праймеры для генов синтезированы в компании «Литех» (Россия).
В исследовании использованы культуры клеток меланомы человека линий MelIL, MelP, MelZ, MelIBR, MeWo, MelM, A375 и немелкоклеточного рака легкого линии А549. Для поддержания линий и проведения исследований клетки культивировали в питательной среде, содержащей RPMI 1640, 10 % ЭТС, 2 мМ глютамин и антибиотики (стрептомицин и пенициллин).
Исследование жизнеспособности опухолевых клеток in vitro МП-методом
Для изучения цитотоксической активности препаратов был использован МТТ-метод, подробно описанный в работе Т.А. Сидоровой и соавт. [11]. Величина IC50 — критерий цитотоксичности исследованных препаратов — определена с помощью метода численных решений по 3 экспериментальным точкам с максимальными значениями модуля 1-й производной экспериментальной кривой выживаемости клеток и представлена в виде М ± SD. Для оценки эффективности модулятора (М) в комбинации с препаратами использован индекс резистентности (IR), равный отношению: IC50 (препарат + М)/ГС50-препарат. Величина IR >1,0 в присутствии нецитотоксических концентраций М (выживаемость клеток не ниже 80 % по сравнению с контрольными клетками) свидетельствовала о снижении чувствительности клеток к хи-миопрепарату, а величина IR <1,0 — об увеличении чувствительности (сенситизации) клеток.
Исследование экспрессии генов НО-1 и Ft (FHC) в опухолевых клетках методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени
Выделение РНК из клеток и синтез кДНК Через 6 ч после культивирования с препаратами клетки лизировали реагентом TRIzol из расчета 1 мл на 1 х 106 клеток в соответствии со стандартной методикой. Концентрацию РНК определяли с помощью Quant-IT RNA Assay Kit по протоколу производителя (Invitrogen, США). Для синтеза кДНК брали 250 нг РНК и проводили обратную транскрипцию в конечном объеме смеси 20 мкл с использованием iScript™
Select cDNA Synthesis Kit согласно инструкции (Bio Rad, США). Реакцию проводили при 42 °С в течение 70 мин. Обратную транскриптазу (ревертазу) инак-тивировали нагреванием реакционной смеси до 85 °С в течение 5 мин. Контроль обратной транскрипции проводили при отсутствии обратной транскриптазы.
Полимеразная цепная реакция в реальном времени
Количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени проводилась на Light Cycler 96 (Roche, США) и CFX96 Real-Time System (Bio Rad, США) с использованием коммерческой смеси iTaq® Universal SYBR® Green Supermix согласно протоколу производителя (Bio Rad, США). В качестве матрицы для ПЦР была использована кДНК образцов. Уровень экспрессии мРНК НО-1 и FHC определяли путем нормализации образцов к референсным генам (ß-актином и глицеральдегидфосфатдегидрогеназой). ПЦР-реакционная смесь содержала 2 мкл (50 нг) кДНК и 5 пикомоль праймеров, последовательности которых представлены в табл. 1.
Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидов, использованных для анализа уровня экспрессии генов, и размер продукта Table 1. Oligonucleotide sequences used to analyze gene expression levels and product sizes
Название гена Последовательность прямого (F)/ обратного (R) праймеров Размер продукта
Forward (F)/Reverse (R) primer sequence
Gene name Product size
HO-1 F: 5'-CGGGCCAG CAACAAAGTG-3' R: 5'-AGTGTAAGGA CCCATCGGAGAA-3' 107 п. н. 107 n. p.
hFHC F: 5'-GTAACGCCAGT TCACCATCAGGAGTACT-3' R: 5'-TTTCCAAATGTAATGC ACACTCCATT-3' 276 п. н. 276 n. p.
GAPDH F: 5'-GGGGAGCCAAAAG GGTCATCATCT-3' R: 5'-GACGCCTGCTTCACC ACCTTCTTG-3' 212 п. н. 212n. p.
ß-actin F: 5'-GTGGGGCGCCCC AGGCACCA-3' R: 5'-CTCCTTAATGTCAC GCACGATTTC-3' 201 п. н. 201n. p.
Условия амплификации: предварительная обработка: 5 мин при 95 °С, последующие 39 циклов: 95 °С — 5 с; 60 °С — 30 с; 72 °С — 30 с. Анализ кривых плавления проводили путем детекции флуоресценции при постепенном нагревании образцов до 95 °С с шагом 0,5 °С в секунду. Все образцы анализировались в триплетах в 96-луночных низкопрофильных планшетах. Результаты количественной ПЦР с обратной транскрипцией представлены 2-й производной от среднего значения
Оригинальные статьи 41
порогового цикла в триплете для каждого образца
(дда).
Исследование внутриклеточного уровня ROS
Базальный и индуцированный препаратами (Api, Н2О2) уровни ROS в клетках определяли с помощью красителя DCFH-DA согласно методике, описанной ранее [10]. Клетки рассеивали на 6-луночные планшеты в концентрации 500 х 105/3 мл среды, после образования монослоя (12 ч) в соответствующие лунки добавляли Api (35 мкМ), Н2О2 (100, 400 мкМ) и инкубировали при 37 °С в атмосфере 5 % СО2 в течение 4 ч. После инкубации питательную среду удаляли из лунок, клетки открепляли от подложки с помощью раствора Версена и ресуспендировали в буфере (20 мМ Hepes в PBS), переносили в пробирки типа «Эппен-дорф», центрифугировали 5 мин при 1800 об/мин и 10 °С. Клетки промывали в 2 мл буфера, центрифугировали и ресуспендировали в 0,5 мл буфера.
Анализ проводили на проточном цитометре Novocyte 2000R (ACEA Biosciences 1пс., США), собирая 2 х 104 событий в анализируемый гейт. Интенсивность флуоресценции регистрировали путем установки маркера по отношению к контрольному материалу при Xex = 488 нм, Xem = 530 нм.
Результаты и обсуждение
исследование роли базальной экспрессии НО-1
в клетках меланомы человека разных линий
в защите их от oS
Чтобы выяснить, зависит ли чувствительность клеток меланомы человека к OS от уровня базальной экспрессии НО-1, мы определили ее экспрессию на 7 клеточных линиях меланомы человека: MelIL, MelP, MelZ, IBR, MeWo, MelM, A375 (см. табл. 1).
По нашим данным, клетки меланомы человека этих линий имеют разные по величине базальные уровни экспрессии НО-1 (рис. 1). По величине этого параметра можно выделить 3 типа клеток меланомы: c высоким (3—3,5 о. е.) уровнем базальной экспрессии - MelIL, MelP, средним (1,5 о. е.) - MelZ, IBR, MeWo и низким (0,5 о. е.) - MelMе, A375.
Для дальнейших исследований мы выбрали 3 линии клеток, представляющие 3 типа базального уровня экспрессии НО-1: MelIL, MeWo и A375, и определили их чувствительность к Н2О2, индуктору OS (табл. 2).
Данные получены из 5 независимых экспериментов и представлены в виде среднего (± SD).
Оказалось, что токсичность Н2О2 для клеток с низким уровнем базальной экспрессии НО-1 (А375) была в 2 раза выше (54 ± 8 мкМ) по сравнению с клетками со средним уровнем экспрессии (MeWo) IC50 (Н2О2) = 24 ± 3 мкМ. Однако дальнейшее снижение чувствительности к Н2О2 не наблюдалось в клетках с высоким уровнем экспрессии НО-1 (MelIL) IC50
(Н2О2) = 48 ± 1 мкМ. Эти данные свидетельствуют об отсутствии прямой корреляции между уровнем экспрессии НО-1 и чувствительностью к OS, индуцированному Н2О2. В то же время результаты наводят на мысль, что в клетках с высоким уровнем экспрессии НО-1, по-видимому, пул мРНК НО-1 предназначен скорее не для НО-1 белка с канонической функцией (поддержание гомеостаза железа в клетке), а для изоформ белка, участвующих в регуляции транскрипции генов [8].
исследование роли гемининдуцированной
экспрессии НО-1 в защите клеток меланомы от OS
По данным, полученным ранее, система НО-1^, чувствительная к регуляции гемом (исходно активная), играет роль в защите лейкозных клеток от OS, индуцированного Н2О2 [10]. Принимая во внимание эти сведения, мы исследовали способность FePPIX, известного индуктора НО-1, вызывать ир-регуляцию НО-1 /Ft в клетках меланомы человека с разным ба-зальным уровнем экспрессии мРНК НО-1 (рис. 2).
Согласно данным, представленным на рис. 2а, в присутствии FePPIX базальный уровень экспрессии НО-1 увеличивается в 2 раза в клетках со средним (MeWo) и низким уровнями экспрессии НО-1 (А375) и не изменяется в клетках с исходно высоким уровнем экспрессии НО-1 (Ме1^). Известно, что цитопро-текторный эффект системы НО-1 /Ft обеспечивается коэкспрессией Ft, преимущественно белка тяжелой цепи — FHC. Именно FHC благодаря ферроксидаз-ной активности контролирует прооксидантный эффект лабильного железа, освобожденного из гема. Согласно нашим данным, представленным на рис. 2б, транскрипция гена FНC снижается (в 1,5 раза) в клетках MeWo, увеличивается (в 2 раза) в клетках меланомы А375 и не изменяется в клетках Ме1Ш Таким образом, по аналогии с лейкозными клетками линии и937 (рис. 2а, б) клетки меланомы линии А375 обладают исходно активной системой НО-1/ Ft (на уровне мРНК). Down-регуляция FHC, наблюдаемая в присутствии FePPIX в клетках MeWo, может также
.0 Ü 4 ---
)сительный показ Relative Ratio i 2 3 1 1
■ ■ ■
нт О 0
MelIL MelP MelZ IBR MeWo MelMe A375 K562
рис. 1. Базальный уровень экспрессии НО-1 в клетках разных линий меланомы человека
Fig. 1. The level of НО-1 basal expression into human melanoma cell lines
5
42 Оригинальные статьи
Таблица 2. Влияние модуляторов базальной экспрессии НО-1 на чувствительность клеток меланомы человека к Н2О2 Table 2. The influence of modulator induced HO-1 basal expression on the sensitivity of human melanoma cells to H2O2
IC50 H2O2 ± M/IR (мкМ) IC50 M (мкМ)
Линия клеток IC50 H2O2 ± M/IR (^M) IC50 M (eM)
меланомы человека -м +M
Human melanoma cell line FePPIX Api
- +FePPIX +Api
A375 24 i 3 58 i 6 (2,4 i 0,5) 17 i 2 (0,6) 75 i 6 35 i 2
MeWo 54 i 8 96 i 11 (2,2 i 0,4) 50 i 0,5 (0,8) >100 >100
MelIL 48 i 1 62 i 6 (1,3 i 0,1) 47 i 2 (1) >100 >100
0,015
о
н
I-
O
Рис. 2. Fig. 2.
MelIL
MeWo
A375
U9B7
MelIL
MeWo
AB75
U9B7
2 .S 0,010 = T
i ! 1 1
É ! 0,005 ^
1 0,000!_—_e_
o 0,0
0 50
0 50 0 50 0 35 0 50
Гемин, мкМ / Hemin, jM
Влияние гемина на экспрессию НО-1 (а) и FHC (б) в клетках меланомы человека
The influence of hemin on НО-1 (а) and FHC (б) gene expression into human melanoma cell lines
0 50 0 B5 Гемин, мкМ I Hemin, jM
0 50
свидетельствовать о наличии в них исходно системы НО-1^^ чувствительной к регуляции гемом. Поскольку промотор гена Ft имеет регуляторные участки, чувствительные к железу «гемовой» природы [12, 13], по-видимому, конечный эффект будет зависеть от вида клеток и/или их внутриклеточного контекста.
Влияет ли индукция экспрессии НО-1 гемином на чувствительность клеток меланомы к Н2О2? Как показано в табл. 2, в условиях активации НО-1/Ft FePPIX (35-50 мкМ в течение 5 ч) величина 1С50 Н2О2 увеличивалась в 2 раза для клеток линий А375 и Ме-Wo и не изменилась для клеток линии Ме1Ш
Таким образом, токсичность Н2О2, индуктора OS, снижается для клеток меланомы, обладающих исходно активной системой НО-1/Ft, чувствительной к внутриклеточной концентрации гема. В клетках линии Ме1^ система НО-1/Ft не регулируется гемом, что может свидетельствовать о наличии в этих клетках изоформ НО-1, не участвующих в поддержании го-меостаза «гемового» железа.
Исследование чувствительности клеток меланомы к OS в условиях down-регуляции базальной экспрессии НО-1
По данным литературы, базальный уровень экспрессии НО-1 (мРНК/белка) влияет на чувствительность опухолевых клеток к агентам стрессорной
природы: снижение уровня базальной экспрессии НО-1 путем нокаута НО-1 с использованием siRNA приводит к увеличению токсичности препаратов [14, 15]. Кроме нокаута НО-1, снижение базальной экспрессии НО-1 (мРНК/белка) в клетках наблюдается в присутствии флавона Api [16]. В настоящей работе мы использовали Api в качестве репрессора базальной экспрессии НО-1.
По данным, представленным на рис. 3а, в условиях предварительной инкубации опухолевых клеток с Api 35—50 мкМ в течение 5 ч наблюдается резкое снижение базального уровня экспрессии НО-1 в клетках меланомы линий MelIL и MeWo в 8 и 4 раза соответственно. Аналогичный эффект (снижение экспрессии НО-1) отмечается и для клеток немел-коклеточного рака легкого человека линии А549 с исходно высоким уровнем базальной экспрессии НО-1 (в 6 раз).
Базальный уровень экспрессии НО-1 также снижается в клетках меланомы линии А375 (в 2 раза), по-видимому, высокая токсичность Api для этих клеток (см. табл. 2) не позволила увеличить эффективность данного модулятора в качестве репрессора синтеза мРНК НО-1.
Согласно результатам исследования, в этих же условиях Api не влияет на уровень экспрессии FHC (рис. 3б), что свидетельствует о специфическом
б
а
0,010
MellL
MeWo
A375
А549
^ T
5 0,008 -1-
| f °,°°б
i ^ 0,004 ^
¡ 0,002
^ 0,000]_i_=__—
1,0
0,8
cc 0,6
0,0
MellL
А549
I
£ 04 0,4
1 m_
0 50 0 50 0 35
Апигенин, мкМ / Apigenin, jM
0 50
0 50 0 50
Апигенин, мкМ / Apigenin, jM
рис. 3. Влияние апигенина на экспрессию НО-1 (а) и FHC (б) в клетках меланомы человека
Fig. 3. The influence of apigenin on НО-1 (а) and FHC (б) gene expression into human melanoma cell lines
влиянии флавона на экспрессию НО-1 и согласуется с данными литературы [16].
Чтобы выяснить, изменится ли чувствительность клеток меланомы к Н2О2 после инкубации с Api, мы исследовали их выживаемость в этих условиях. По данным, представленным в табл. 2, в условиях down-регуляции НО-1, индуцированной Api, чувствительность к Н2О2 повышалась в 2 раза для клеток линии А375 (IR = 0,6), умеренная сенситизация отмечалась для клеток меланомы линии MeWo (IR = 0,8), и инкубация с Api не повлияла на чувствительность к Н2О2 клеток линии MelIL, несмотря на резкое снижение базального уровня экспрессии НО-1 в этих клетках. Также мы не наблюдали изменения чувствительности к Н2О2 для клеток немелкоклеточного рака легкого человека линии А549 (данные не представлены).
Таким образом, в условиях down-регуляции НО-1, индуцированной Api, чувствительность к Н2О2 повышается для клеток с низким (А375) и средним (MeWia) исходными уровнями базальной экспрессии НО-1. Эти данные свидетельствуют о том, что репрессия синтеза мРНК НО-1 в присутствии Api — необходимое, но недостаточное условие для сенситизации клеток к Н2О2.
В настоящее время известно, что в клетках после воздействия Api наблюдается угнетение базальной экспрессии белков стресса: НО-1 [16], индуцибель-ной NO-синтазы, циклооксигеназы 2-го типа [17]. Однако до сих пор механизм этого эффекта флавона остается неизвестным. Мы предположили, что down-регуляция белка НО-1, входящего в систему защиты клеток от OS, может отразиться на балансе окислителей-восстановителей в них и определили содержание ROS в клетках меланомы линии А375 после инкубации их с Api.
Возрастание внутриклеточного содержания ROS в клетках меланомы А375 после воздействия Api в комбинации с Н2О2
По данным, представленным на рис. 4, краткосрочное воздействие Н2О2, индуктора ROS (400 мкМ,
30 мин), приводит к снижению концентрации последнего в клетках (см. рис. 4а, 2), о чем свидетельствует сдвиг пика кривой люминесценции влево. Вероятно, этот эффект обусловлен активацией системы детоксикации Н2О2. После воздействия Api в течение 5 ч в клетках меланомы линии А375 содержание ROS возрастает (рис. 4б, 2) по сравнению с контрольными клетками (рис. 4б, 1). В этих же условиях добавление к клеткам Н2О2 привело к резкому возрастанию содержания внутриклеточного ROS (рис. 4в, 3) по сравнению и с контрольными клетками (без препаратов), и с вариантами, обработанными Н2О2 (рис. 4а, 2).
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что после инкубации с Api в клетках меланомы линии А375 баланс окислителей-восстановителей сдвигается в сторону окислителей и обеспечивает их сенситизацию к воздействию Н2О2. Известно, что в механизме цитотоксичности дакар-базина (DTIC), применяемого для лечения меланомы человека, участвуют ROS [18, 19]. С учетом этой информации представляло интерес выяснить, изменится ли чувствительность клеток меланомы линии А375 к DTIC после предварительной инкубации с Api.
Как показано на рис. 5, в условиях репрессии НО-1, индуцированной Api (35 мкМ, 5 ч), чувствительность клеток линии А375 к DTIC увеличивается. Способность Api сенситизировать клетки меланомы к химиопрепаратам, в цитотоксичность которых вносят вклад ROS, позволяет рекомендовать этот флаво-ноид для включения его в схему лечения больных меланомой.
Заключение
Результаты нашей работы свидетельствуют о том, что в клетках меланомы человека регистрируется ба-зальный уровень транскрипции гена НО-1, величина которого варьирует для разных линий: MelIL = MelP > MeWo = MelZ = IBR > Ме1Ме = A375. Несмотря на отсутствие прямой корреляции между уровнем
б
а
44
Оригинальные статьи
а б в
Рис. 4. Содержание ROS в клетках меланомы линии А375 после воздействия Н2О2 (а), апигенина (б), апигенина и Н2О2 (в) Fig. 4. ROS content in A375 melanoma cells after exposure to H2O2(а), apigenin (б), apigenin and Н2О2 (в)
IC DTIC = 48 мкМ IIC5 DTIC = 4S jM
100
£ 8
о та
50
Ф DTIC
— «— Api (25) + DTIC
-4,5 -4,2 -3,9 -3,6 -3,3 Логарифм концентрации DTIC в М, моль/л / Logarithm of DTIC concentration in М, mol/L
Рис. 5. Токсичность дакарбазина (DTIC) для клеток меланомы линии А375в условиях апигенининдуцированнойрепрессии транскрипции НО-1 Fig. 5. Dacarbazine (DTIC) toxicity for A375melanoma cells in conditions apigenin-induced repression of HO-1 transcription
базальной экспрессии НО-1 в клетках и их чувствительностью к Н2О2, индуктору OS, отмечается, что клетки линии А375 с низким уровнем транскрипции НО-1 оказались в 2 раза чувствительнее к Н2О2 по сравнению с клетками линии MelIL, имеющими высокий уровень экспрессии этого гена. Гемининдуци-рованное увеличение экспрессии НО-1 наблюдается только в клетках со средним (MeWo) и низким (А375) уровнями транскрипции гена и коррелирует с увеличением их устойчивости к Н2О2. Установлено, что апи-генининдуцированная репрессия синтеза мРНК НО-1 регистрируется в клетках меланомы с разным базаль-ным уровнем, однако сенситизация клеток к Н2О2 характерна для вариантов, имеющих средний (MeWo) и низкий (А375) уровни экспрессии этого гена.
Установлено, что способность Api самостоятельно генерировать в клетках ROS вносит вклад в механизм увеличения чувствительности клеток меланомы к Н2О2 в условиях апигенининдуцированной репрессии синтеза мРНК НО-1.
0
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. MacKie R.M., Hauschild A., Eggermont A.M. Epidemiology
of invasive cutaneous melanoma. Ann Oncol 2009;20(Suppl 6)1-7. DOI: 10.1093/annonc/mdp252.
2. Bhatia S., Tykodi S.S., Thompson J.A. Treatment of metastatic melanoma: an overview. Oncology (Williston Park) 2009;23(6):488-96.
3. Emri G., Paragh G., Tosaki Â. et al. Ultraviolet radiation-mediated development of cutaneous melanoma: an update. J Photochem Photobiol B 2018;185:169-75. DOI: 10.1016/j.jphotobiol.2018.06.005.
4. De Yulia G.J.Jr., Cárcamo J.M., Bórquez-Ojeda O. et al. Hydrogen peroxide generated extracellularly
by receptor-ligand interaction facilitates cell signaling. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102(14):5044-9. DOI: 10.1073/pnas.0501154102.
5. Matés J.M., Sánchez-Jiménez F.M. Role of reactive oxygen species in apoptosis: implications for cancer therapy. Int
J Biochem Cell Biol 2000;32(2):157-70. DOI: 10.1016/s1357-2725(99)00088-6.
6. Wittgen H.G., van Kempen L.C. Reactive oxygen species in melanoma
and its therapeutic implications. Melanoma Res 2007;17(6):400-9. DOI: 10.1097/cmr.0b013e3282f1d312.
7. Vile G.F., Tyrrell R.M. Oxidative stress resulting from ultraviolet A irradiation of human skin fibroblasts leads
to a heme oxygenase-dependent increase in ferritin. J Biol Chem 1993;268(20):14678—81.
8. Vanella L., Barbagallo I., Tibullo D. et al. The non-canonical functions
of the heme oxygenases. Oncotarget
2016;7(42):69075-86.
DOI: 10.18632/oncotarget.11923.
9. Bian C., Zhong M., Nisar M.F. et al.
A novel heme oxygenase-1 splice variant, 14 kDa HO-1, promotes cell proliferation and increases relative telomere length. Biochem Biophys Res Commun 2018;500(2):429-34. DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.04.096.
10. Сидорова ТА, Вагида М.С., Калия О.Л., Герасимова Г.К. Роль каталазы в защите опухолевых клеток от окислительного стресса, индуцированного бинарной каталитической системой «терафтал + аскорбиновая кислота». Клиническая онкогематология 2014;7(3):282-9. [Sidorova Т.А., Vagida M.S., Kaliya O.L., Gerasimo-va G.K. Role of catalase in protection of cancer cells from oxidative stress induced by binary catalytic system "teraphtal + ascorbic acid". Kliniches-kaya onkogematologiya = Clinical Onco-hematology 2014;7(3):282-9. (In Russ.)].
11. Сидорова Т.А., Рябая О.О., Прокофьева А.А., Хоченков Д.А. Гемоксиге-наза-1/ферритин в защите лейкозных клеток от окислительного стресса, индуцированного каталитической системой «терафтал + аскорбиновая кислота». Клиническая онкогемато-
aoma 2019;12(4):416-27. [Sidorova TA., Ryabaya O.O., Prokofieva A.A. Khochenkov D.A. Heme oxygenase-1/ ferritin in protection of leukemia cells from oxidative stress induced by catalytic system "teraphtal + ascorbic acid". Klinicheskaya onkogematologiya = Clinical oncohematology 2019;12(4):416-27. (In Russ.)].
12. Sheftel A.D., Kim S.F., Ponka P. Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism. J Biol Chem 2007;282(14):10480-6. DOI: 10.1074/jbc.m700240200.
13. Torti F.M., Torti S.V. Regulation of ferritin genes and protein. Blood 2002;99(10):3505-16.
DOI: 10.1182/blood.v99.10.3505.
14. Kweon M.H., Adhami V.M., Lee J.S., Mukhtar H. Constitutive overexpression of Nrf2-dependent heme oxygenase-1 in A549 cells contributes to resistance to apoptosis induced by epigallocate-chin 3-gallate. J Biol Chem 2006;281(44):33761-72.
DOI: 10.1074/jbc.m604748200.
15. Ma J., Yu K.N., Cheng C. et al. Targeting Nrf2-mediated heme oxygenase-1 enhances non-thermal
plasma-induced cell death in non-small-cell lung cancer A549 cells. Arch Biochem Biophys 2018;658:54-65. DOI: 10.1016/j.abb.2018.09.015.
16. Abate A., Yang G., Wong R.J. et al. Apigenin decreases hemin-mediated heme oxygenase-1 induction. Free Radic Biol Med 2005;39(6):711-8.
DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2005.01.020.
17. Raso G.M., Meli R., di Carlo G. et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 expression by flavonoids in macrophage J774A.1. Life Sci 2001;68(8):921-31. DOI: 0.1016/s0024-3205(00)00999-1.
18. Pourahmad J., Amirmostofian M., Kobarfard F., Shahraki J. Biological reactive intermediates that mediate dacarbazine cytotoxicity. Cancer Chemother Pharmacol 2009;65(1):89-96. DOI: 10.1007/s00280-009-1007-8.
19. De Oliveira Júnior R.G., Bonnet A., Braconnier E. et al. Bixin, an apocaro-tenoid isolated from Bixa orellana L., sensitizes human melanoma cells
to dacarbazine-induced apoptosis through ROS-mediated cytotoxicity. Food Chem Toxicol 2019;125:549-61. DOI: 10.1016/j.fct.2019.02.013.
вклад авторов
Т.А. Сидорова: разработка концепции и дизайна статьи, сбор и обработка данных, подготовка рукописи;
Э.Ш. Соломко, А.А Прокофьева, Ю.А. Хоченкова, Д.А Хоченков: сбор и обработка данных, предоставление материалов исследования, анализ и интерпретация данных. Authors contributions
T.A. Sidorova: developing the concept and design of the article, data collection and processing, the preparation of the manuscript;
E.Sh. Solomko, A.A. Prokofieva, Yu.A. Khochenkova, D.A. Khochenkov: data collection and processing, providing research materials, data analysis
and interpretation.
oRCID авторов/oRCID of authors
Т.А. Сидорова/T.A. Sidorova: https://orcid.org/0000-0003-3498-061X Э.Ш. Соломко/E.Sh. Solomko: https://orcid.org/0000-0002-8070-4707 А.А Прокофьева/A.A. Prokofieva: https://orcid.org/0000-0002-5281-2559 Ю.А. Хоченкова/Yu.A. Khochenkova: https://orcid.org/0000-0001-8392-5495 Д.А Хоченков/D.A. Khochenkov: https://orcid.org/0000-0002-5694-3492
конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Работа выполнена в рамках НИОКТР № АААА-А20-120021490101-1 «Разработка новых комплексных подходов к изучению механизмов злокачественной трансформации клеток, прогрессии и метастазирования опухолей».
Financing. The work was performed within the framework of NIOKTR No AAAA-A20-120021490101-1 Development of new integrated approaches to the study of mechanisms of malignant cell transformation, progression and metastasis of tumors .
Статья поступила: 11.03.2020. Принята к публикации: 30.06.2020. Article submitted: 11.03.2020. Accepted for publication: 30.06.2020.
