CC BY
18
терафтал снижает чувствительность опухолевых клеток к доксорубицину in vitro, но не влияет на его противоопухолевый эффект in vivo
Т.А. Сидорова, О.О. рябая, A.A. Прокофьева, В.В. Татарский, н.А. Андронова, В.И. романенко, д.А. Хоченков
ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России;
Россия, 115478 Москва, Каширское ш., 24
Контакты: Татьяна Александровна Сидорова tatsid@yahoo.com
Введение. Антрациклиновый антибиотик доксорубицин (DOX) широко используется в клинической онкологии. Известно, что гемин, эндогенный метаболит, обладает способностью модулировать цитотоксичность DOX. По нашим данным, токсичность DOXдля опухолевых клеток млекопитающих, растущих in vitro, снижается в присутствии терафтала (ТФ, натриевая соль 4,5-октакарбоксифталоцианина кобальта), компонента бинарной каталитической системы (ТФ + аскорбиновая кислота).
Цель исследования — выяснить, влияет ли ТФ на противоопухолевый эффект DOX in vivo.
Материалы и методы. В работе были использованы опухолевые клетки меланомы мыши линии B16/F10 и перевиваемая опухоль меланомы В16. Способность ТФ защищать опухолевые клетки от гибели, индуцированной DOX, оценивали с помощью МТТ-метода, проточной цитометрии, световой микроскопии, цитохимического метода определения экспрессии ß-галак-тозидазы, радиометрического метода. Противоопухолевый эффект препаратов в режимах (DOX ± ТФ) оценивался по продолжительности жизни животных.
Результаты. По нашим данным, токсичность DOX относительно клеток меланомы мышей линии B16/F10 в присутствии ТФ (10—20 мкМ) снижается в среднем в 4—6раз. ТФ защищает опухолевые клетки линии B16/F10 от гибели путем апоп-тоза, индуцированного DOX, включая в клетке программу преждевременного старения. В защите ТФ/гемина от цитоток-сичности DOX участвует один и тот же механизм, который связан со снижением способности клеток «накапливать» ан-трациклиновые антибиотики в присутствии модуляторов. Противоопухолевая активность DOX при лечении мышей с перевиваемой опухолью меланомы В16 в комбинации с ТФ не отличается от эффективности антрациклиновых антибиотиков в режиме монотерапии.
Заключение. Способность ТФ снижать цитотоксичность DOXдля клеток меланомы мышей линии B16/F10, наблюдаемая in vitro, не влияет на противоопухолевый эффект DOXв условиях комбинированного воздействия препаратов.
Ключевые слова: доксорубицин, терафтал, меланома мышей линии B16/F10, препаратиндуцированное старение, перевиваемая опухоль мышей В16
DOI: 10.17650/1726-9784-2019-18-2-51-59
TERAPHTAL DECREASED THE SENSITIVITY TuMOR CELLS TO DOXORuBICINE IN VITRO
but does not affect its antitumor effect in vivo
T.A. Sidorova, O. O. Ryabaya, A. A. Prokofyeva, V V Tatarskiy, N. A. Andronova, V I. Romanenko, D.A. Khochenkov
N.N. Blokhin NMRCO Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Sh, Moscow 115478, Russia
Introduction. Anthracycline antibiotic doxorubicin (DOX) is widely used in clinical oncology. It is known that hemin, endogenious compound, has the ability to modulate DOX cytotoxicity. We found that DOX toxicity against mammalian cancer cells can be decreased in vitro in the presence of teraftal (TF), the component anticancer binaric catalytic system (TF + ascorbic acid). Purpose. To study the influence of TF on anticancer effect of DOX.
Materials and methods. The mouse melanoma cell line B16/F10 and mouse transplanted tumor B16 were used. The TF ability to protectfrom DOX-induced cell death were measured by MTT-assay, flow cytometry, light microscopy, cytochemical determination of fl-ga-lactosidase expression, radiometric assay and tumor growth inhibition assay in vivo.
Results. The sensitivity of mouse melanoma cell line B16/F10 to DOX decreased in the presence TF (10—20 mkM) in the mean by 4—6 fold. The same mechanism takes part into the decrease of DOX cytotoxicity at the presence of TF/hemin khown which connects with the cell ability to accumulate of drug. TF protect the mouse melanoma cells B16/F10 from apoptosis, induced by DOX throwing switching on cell premature senescence programme. The antitumor effect of DOX against mouse transplanted melanoma B16 at presence of TF was the same as DOX alone.
52 Оригинальные статьи
Conclusions. The TFpotency to decrease the sensitivity of cancer cells to DOX in vitro does not correlate with its ability to modulate аnthracycline antibiotics anticancer effect in vivo. Key words: doxorubicin, sodium salt of cobalt 4,5-carboxyphthalocyanine, drug-induced senescense, mouse melanoma cell line B16/F10, transplanted mouse tumor B16 Введение зависит от типа клеток, химической структуры, кон- Антрациклиновые антибиотики (АА) — эффек- центрации и времени воздействия препарата [11]. АА, тивные химиопрепараты с широким спектром про- взаимодействуя с различными программами опухо-тивоопухолевой активности в клинике [1]. Эффек- левых клеток, запускают разные механизмы их гибе-тивность химиотерапии АА у больных в первую ли: через апоптоз [11—13], включая клетки меланомы очередь зависит от лекарственной чувствительности мышей B16/F10 [14, 15], некроз [11, 13], преждевре-опухолевых клеток, природа которых определяет тип менное старение [16, 17]. Для большинства типов и количество внутриклеточных препарат-специфи- клеток характерен АА-специфический тип гибели ческих мишеней. С другой стороны, в зависимости клеток по механизму преждевременного (усиленно-от химической структуры АА (стандартные: доксо- го) старения. Повреждения ДНК (сшивки-разрывы), рубицин — DOX, даунорубицин и нестандартный: вызванные АА, являются сигналами для развития акларубицин) отмечается различная биологическая в клетке признаков, характерных для стареющих активность этой группы препаратов. Основной вклад клеток (SLC-фенотип). В отличие от стандартных в механизм действия АА, как полагают, вносит АА, в присутствии акларубицина, неспособного вы-их взаимодействие с макромолекулами митохондрий зывать разрывы ДНК [9], в опухолевых клетках запу-(Мтх) и ядрами клеток [2, 3]. АА имеют высокое скается только процесс апоптоза и/или некроза [18]. сродство к Мтх. «Антрахиноновый» хромофор АА, SLC-фенотип индуцируется при воздействии DOX имитируя субстрат фермента 1-го комплекса дыха- в опухолевых клетках различного гистогенеза [16, тельной цепи Мтх — оксидоредуктазы никотинамид- 19—23]. Для клеток с SLC-фенотипом характерны адениндинуклеотид-дегидрогеназы, позволяет им морфологические (увеличение размера, разбухание включаться в биоэнергетический синтез аденозин- ядер, появление микроядер) и биохимические (уве-трифосфорной кислоты [3], что в конечном итоге личение активности фермента р-галактозидазы ли-приводит к накоплению активных форм кислорода зосом) признаки и сохранение жизнеспособности и запуску программ гибели клеток по механизмам [16]. Развитие SLC-фенотипа сопровождается оста-апоптоза и некроза [4]. Ядерный компонент механиз- новкой клеток в фазе G2/M клеточного цикла и аре-ма действия АА обусловлен их способностью интер- стом пролиферации клеток [24]. Продолжительная калировать в ДНК независимо от химической струк- остановка в фазе G2/M клеток, перегруженных гене-туры препаратов [2, 5]. Встраиваясь между парами тическим материалом, в конечном итоге приводит оснований, АА способны образовывать сшивки к их гибели по типу митотической катастрофы [20]. с макромолекулой, которые препятствуют процессу При этом выживание отдельных клеток, избежавших репликации ДНК и индуцируют гибель клеток [6, 7]. терминального ареста, может явиться предпосылкой АА являются ингибиторами фермента ДНК-топо- для восстановления роста популяции [25]. изомеразы II (Торо II), вовлеченной в репликацию, Эндогенные вещества и фармакологические пре-репарацию и поддержание гомеостаза ДНК. Образо- параты различной природы могут влиять на эф-вание тройного комплекса Торо II — АА — ДНК фективность АА. Так, токсичность АА снижается и последующая блокада функции фермента Торо II в присутствии эндогенного пигмента меланина [26], приводит к разрывам ДНК [8]. Важно отметить, что витамина С [27], гемина (FePPIX) [28—30]. При этом акларубицин, в отличие от классических АА, являет- механизмы, лежащие в основе снижения цитотоксич-ся непрямым ингибитором каталитической активно- ности АА, могут быть разными: образование комплек-сти двух топоизомераз — Торо II и Торо I, но при этом са меланина с АА и улавливание активных форм не индуцирует разрывы ДНК [9]. Такой механизм кислорода, генерируемых АА [26]; активация антиок-действия обусловлен тем, что акларубицин, встраи- сидантной системы (витамин С) [27]. Снижение ток-ваясь между нитями ДНК, нарушает доступ фермен- сичности АА в присутствии FePPIX обусловлено его тов Торо II и Торо I к ДНК, что приводит, с одной прямым взаимодействием с антрациклинами [28, 31], стороны, к стабилизации ковалентного комплекса угнетением транспорта АА в клетку [28, 31], селектив-Торо I с ДНК, а с другой — к угнетению каталитиче- ным ингибированием активности СОХ, фермента ской активности Торо II [10]. дыхательной цепи Мтх [29], усилением экспрессии Данные литературы свидетельствуют о том, что гена NrF2 и опосредованно через него — активацией механизм клеточной гибели, индуцированной АА, антиоксидантной системы клетки [30].
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 2'2019 том 181 vol. 18
Оригинальные статьи 53
Ранее нами было обнаружено, что чувствитель- естественном освещении на брикетированном корме ность опухолевых клеток млекопитающих разного и постоянном доступе к воде. гистогенеза, растущих in vitro, к DOX снижается в присутствии терафтала (ТФ, натриевая соль 4,5-ок- Исследование жизнеспособности опухолевых такарбоксифталоцианина кобальта), компонента клеток in vitro мТТ-методом противоопухолевого средства — бинарной каталити- Для изучения цитотоксической активности пре-ческой системы (ТФ + аскорбиновая кислота) [32, 33]. паратов был использован МТТ-метод, подробно Известно, что в клинических протоколах фотоди- описанный в работе [35]. Для оценки эффективности намической терапии используются фотосенсибили- модулятора (М) в комбинации с препаратами ис-заторы фталоцианиновой природы, подобные ТФ, пользован индекс резистентности (IR), равный отв комбинации с химиопрепаратами, включающей АА ношению: [34]. Принимая во внимание эти данные, мы продолжили исследования в условиях in vivo. IR = IC50 (препарат + M)/IC препарат. Цель настоящего исследования — выяснить, влияет ли ТФ на противоопухолевой эффект DOX in vivo. Величина IR >1,0 в присутствии нетоксических кон-Для этого сначала в условиях in vitro на клетках мела- центраций М (выживаемость клеток не менее 80 % номы мышей линии B16/F10 были подтверждены по сравнению с контрольными клетками) свидетель-цитопротекторные свойства ТФ, затем исследовали ствовала о снижении чувствительности клеток к хи-эффективность лечения перевиваемой меланомы миопрепарату. мышей В16 комбинацией DOX с ТФ. Исследование клеточного цикла методом проточ- Материалы и методы ной флуорометрии В работе были использованы следующие хими- Для исследования влияния ТФ на способность ческие реактивы: РНКаза А, ДМСО, NP-40, йодид DOX вмешиваться в клеточный цикл линии B16/F10 пропидия (PI), K3Fe(CN)6, K4Fe(CN)6, X-Gal, МТТ (106/2 мл питательной среды в лунке) использовали фирмы Sigma. Бромистый этидий, MgCl2, дитиотре- методику, описанную в работе [33]. Анализ клеточ-итол, CH3COONa, Tween 20, глютаральдегид получены ного цикла был выполнен на клетках, меченых PI, из Serva; NaCl фирмы «Реахим». Препараты: DOX — содержание в популяции клеток в фазах Sub-Gp Gp Bristol Myers; Терафтал-Лио — совместного производ- S и G2/M было вычислено из гистограмм в програм-ства ФГУП ГНЦ «НИОПИК» и ФГБУ «НМИЦ он- ме FACS Diva и представлено в процентах. кологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. FePPIX получен из Sigma. С14-даунорубицин (удельная актив- Определение активности лизосомального фермен-ность 1,67 ГБк/ммоль) получен из Amersham (Англия). та ß-галактозидазы в клетках FePPIX растворяли в ДМСО; DOX и ТФ — в Н2О. Сто- Экспрессию ß-галактозидазы в клетках опреде-ковые растворы в аликвотах (20 мкл) хранили при ляли согласно методике [36] с модификациями [33]. —60 °С и размораживали в каждой новой серии опытов. Исследование способности клеток накапливать Экспериментальные модели АА в присутствии и без модуляторов с помощью Культура клеток меланомы мышей линии радиометрического метода B16/F10 была использована в качестве эксперимен- Для оценки способности опухолевых клеток на-тальной модели in vitro. Для поддержания линии капливать AA в присутствии и без модуляторов ис-и проведения экспериментов клетки культивирова- пользовали методику, описанную в работе [33]. ли в питательной среде, содержащей RPMI 1640, Данные выражены как количество импульсов в час 10 % FCS, 2 мМ глютамина и антибиотики (стреп- в расчете на 106 клеток и являются средними величи-томицин + пенициллин). Экспериментальной мо- нами, полученными из 2 независимых экспериментов. делью in vivo служила меланома мышей MelB16, штамм (3-й пассаж) получен из Банка заморожен- Исследование противоопухолевой активности ных биоматериалов НМИЦ онкологии им. Н.Н. Бло- DOX (режимы и дозы препаратов) хина. Опухоль прививали в икроножные мышцы Изучение противоопухолевой активности DOX правой задней лапки. Прививочная доза — 20 мг в комбинации с ТФ и без модулятора соответство-взвеси опухоли в 0,1 мл среды 199. Исследование вало рекомендациям, изложенным в Руководстве проводили на мышах-самках — гибридах Ft (BDFt) по проведению доклинических исследований лекар-[C57BL/6*DBAJ массой тела 20—22 г, полученных ственных средств под редакцией А.Н. Миронова [37]. из питомника «Столбовая», которых содержали Перед лечением мышей распределили на 4 груп-в виварии НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина при пы по 5 особей: 1-я группа (контроль роста опухоли)
2'2019 том 18 I VOL. 18 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ I RUSSIAN JOURNAL OF BiOTHERAPY
54 Оригинальные статьи
получала 0,2 мл физраствора, 2-я получала только DOX,
3-я — комбинацию ТФ + DOX (ТФ вводили первым без интервала между введениями препаратов);
4-я группа — комбинацию DOX + ТФ (DOX вводили первым и ТФ — через 2,5 ч после АА). Дозы препаратов выбраны по принципу максимальной переносимости: DOX — 8 мг/кг [37], ТФ — 25 мг/кг (собственные неопубликованные данные). Препараты растворяли 0,2 мл физраствора и вводили 1-кратно через 48 ч после трансплантации опухоли: ТФ — Терафтал-Лио (0,1 %) вводили внутривенно в хвостовую вену очень медленно, DOX (0,08 %) вводили внутрибрюшинно. Объем опухолей измеряли на 7, 10, 14 и 17-е сутки после трансплантации опухоли. Торможение роста опухоли (ТРО) рассчитывали соответственно на 5, 8, 12 и 15-е сутки после окончания лечения. Эффективность лечения оценивали по стандартному критерию ТРО (%) [37]. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием компьютерной программы STATISTICA 6.0. Различия между сравниваемыми группами считались статистически достоверными приp <0,05.
Результаты и обсуждение
исследование влияния тФ на токсичность DOX для опухолевых клеток меланомы мышей линии B16/F10 в системе in vitro
По нашим данным, в присутствии ТФ (10 мкМ) чувствительность клеток линии B16/F10 к DOX снижается в 4 раза, о чем свидетельствует величина IR: (4,1 ± 0,6). В этих же условиях в присутствии FePPIX
с
о d
—•— DOX 5,4 X Ю-7
------- DOX + ТФ10 / DOX + TF10 3,1 X 10-'
-■-Лс-- DOX + FePPIX10 1,3 X 10-6 --♦-- DOX + ТФ10 + FePPIX10/
DOX + TF10 + FePPIX10 2,5 X 106
с о а.
125 -,
100
75 -
50
25
О
-•— DOX 3,0 X10 7 1,0
- ■ DOX + ТФ20 / DOX + TF20 1,9 X 10-6 6,7
-♦— DOX+ FePPIX20 1,0 X 10-6 3,3
■-X--- DOX + ТФ5 / DOX + ТФ5 3,5 X 107 1,2
-7,4 -7,1
-5,9 -5,6
1,0 5,8
2.5
4.6
150-1 1251007550 25 0
-6,5 -6,2 -5,9 Log[DOX],M
рис. 1. Цитотоксичность DOX для клеток B16/F10 в присутствии и без модуляторов (ТФ/FePPIX). Здесь и на рис. 2, 3, 5: ТФ — тераф-тал, DOX — доксорубицин
Fig. 1. DOX cytotoxicity for B16/F10 cells with and without modulators (TF/FePPIX). Here and in fig. 2, 3, 5: TF — teraftal, DOX — doxorubicin
-6,8 -6,5 -6,2 Log [DOX], M
рис. 2. Зависимость токсичности комбинации DOX + ТФ/FePPIX для клеток B16/F10 от концентрации модулятора Fig. 2. Dependence of DOX + TF/FePPIX combination toxicity for B16/F10 cells onmodulator concentration
(10 мкМ), известного модулятора токсичности АА [28—30], величина IC50 для DOX увеличивается в среднем в 2,5 раза IR: (2,57 ± 0,4) (рис. 1).
Кривая выживаемости клеток в присутствии комбинации DOX + ТФ не отличается от таковой для DOX + (ТФ + FePPIX). Таким образом, конечный эффект комбинации DOX + (ТФ + FePPIX) не является суммой вклада обоих модуляторов. Эти данные могут свидетельствовать, что ТФ и FePPIX конкурируют за одни и те же мишени, участвующие в механизме снижения токсичности к АА.
Эффективность ТФ как протектора определена в исследовании зависимости токсичности DOX для клеток B16/F10 от концентрации модулятора. По нашим данным, защитный эффект ТФ для клеток B16/F10 отсутствует при концентрации модулятора в среде 5 мкМ, регистрируется при 10 мкМ (IR = 4,1 ± 0,6), возрастает при 20 мкМ (IR = 6,0 ± 0,4) (рис. 2). В этих же условиях эффективность FePPIX, протектора токсичности DOX, при концентрации модулятора в среде 10 мкМ не отличается от таковой при 20 мкМ (см. рис. 1 и 2). Эти данные свидетельствуют, что ТФ является более эффективным модулятором токсичности DOX для клеток меланомы линии B16/F10 по сравнению с FePPIX.
исследование влияния тФ на механизмы гибели клеток меланомы линии B16/F10 в присутствии DOX: индукцию апоптоза и преждевременного старения клеток
По данным литературы, DOX индуцирует гибель клеток меланомы мышей B16/F10 в основном по
ic50(M)/ir
ic50(M)/ir
% 100
80
60
40
20
Контроль/ Control 0,5 мкМ / 0.5 jm 1 мкМ / 1jM 2 мкМ / 2 JM Контроль ТФ Control TF 0,5 мкМ / 0.5 jm 1 мкМ /1JM 2 мкМ /2 JM
DOX DOX + ТФ (20 мкМ) / DOX + TF (20 jM)
■ Poliploid 1,8 1,4 1,4 0,1 3,9 3,3 2,3 2
Sub G1 0,5 1 12,2 88,2 0,8 0,8 0,7 2,4
G2/M 26 39,6 13,3 1 18,9 73,5 73,7 50,4
S 14,7 7,3 16,8 2,9 14,7 3,5 3,6 6,9
G0/G1 53,2 50 53,3 6,3 60 17,5 18,3 35
рис. 3. Распределение клеток B16/F10 по фазам клеточного цикла после воздействия на клетки DOX ± ТФ в течение 48 ч Fig. 3. Cell cycle phase distribution of B16/F10 cells after treatment with DOX ± TF for 48 hours
механизму апоптоза [14, 15]. Одним из маркеров начального этапа индукции апоптоза по митохон-дриальному пути является появление Sub-G1-пика при исследовании клеточного цикла методом проточной цитофлюорометрии.
По нашим данным, представленным на рис. 3, в популяции клеток меланомы линии В16^10 после воздействия DOX (0,5, 1 и 2 мкМ) в течение 48 ч фракция клеток в Sub-G1 -фазе составляет 1, 12,2 и 88 % соответственно по сравнению с 0,5 % таковой в отсутствие АА. В присутствии ТФ (20 мкМ) количество «апоптотических» клеток в ответ на DOX (2 мкМ) остается на низком уровне (2,4 %). Таким образом, ТФ способен защищать клетки меланомы линии В16^10 на ранних этапах апоптоза по митохондри-альному пути, индуцированного DOX. Известно, что DOX, будучи интеркалятором ДНК и ингибитором Торо II, способен вызывать сшивки и разрывы в ДНК, следствием чего является нарушение митоза: остановка в S-фазе, накопление клеток в фазе G2 клеточного цикла и в дальнейшем — арест пролиферации клеток [24]. По нашим данным, количество клеток в исходной популяции линии В16^10 в фазе G2/М составляет 26 %. При концентрации DOX в среде инкубации 0,5 мкМ данная фракция клеток
возрастает до 39 %, а при концентрации АА 1 и 2 мкМ снижается до 13 и 1 % соответственно. В присутствии ТФ (20 мкМ) в тех же условиях мы наблюдаем резкое возрастание фракции клеток в фазе G2/М до 73 % ^ОХ 0,5, 1 мкМ). Доля клеток в блоке G2/М при концентрации DOX 2 мкМ составляет 50 % и не возвращается к контрольным величинам. Таким образом, в присутствии ТФ механизм защиты клеток меланомы линии В16^10 от токсичности DOX (индукция апоптоза) коррелирует с остановкой клеток в фазе G2/М. Такие клетки, как известно, приобретают фенотип SLC, для которого характерны морфологические (увеличение размера, разбухание ядер, появление микроядер) и биохимические (увеличение активности фермента р-галактозидазы ли-зосом) признаки [16, 34].
По нашим данным, индукция SLC-фенотипа в клетках В16/Р10 после воздействия DOX (0,625 мкМ) сопровождается набуханием клеток и увеличением в них количества лизосом, о чем свидетельствуют «синие» клетки с высокой экспрессией фермента Р-галактозидазы, выявленные с помощью X-GAL-реагента (рис. 4б). В популяции клеток, обработанных комбинацией DOX + ТФ (20 мкМ), количество «синих» клеток возрастает. При концентрации DOX
0
56
Оригинальные статьи
рис. 4. Экспрессия fi-галактозидазы в клетках линии B16/F10 после воздействия на них DOX ± ТФ в течение 48 ч: а — при отсутствии препаратов; б — DOX 0,6 мкМ; в — DOX 0,6 мкМ + ТФ 20 мкМ; г — DOX 1,2 мкМ; д — DOX 1,2 мкМ + ТФ 20 мкМ; красная стрелка указывает на клетки, окрашенные на fi-галактозидазу
Fig. 4. fi-galactosidase expression in B16/F10 cells after treatment with DOX ± TF for 48 hours: а — without medications; б — DOX (0.6 mM); в - DOX (0.6 mM) + TF (20 mM); г - DOX (1.2 mM); д - DOX (1.2 mM) + TF (20 mM); red arrow shows cells stained forfi-galactosidase
(1,25 мкМ) наблюдается гибель клеток, о чем свидетельствует их низкая плотность в лунках, среди оставшихся клеток выявляются редкие варианты с признаками SLC-фенотипа (рис. 4в). В присутствии ТФ клеточная гибель не наблюдается, и практически все клетки имеют морфологические признаки SLC-фенотипа: увеличенные размеры и экспрессию Р-галактозидазы (рис. 4в, г). В этих же условиях единичные «синие» клетки присутствуют в контрольных образцах (рис. 4а, стрелка).
исследование влияния тФ на способность клеток
меланомы мышей линии B16/F10 накапливать АА
Согласно данным литературы механизм защиты клеток от токсичности АА в присутствии ТФ^еРРГХ может быть связан со способностью модулятора снижать накопление препаратов опухолевыми клетками [28, 31, 33]. Учитывая эти сведения, мы исследовали влияние ТФ^еРРГХ на накопление АА опухолевыми клетками линии В16^10.
По нашим данным, при кратковременной инкубации клеток с С14-даунорубицином величина накопления АА клетками В16/Р10 составляет 8765 ± 869 имп/ч, в присутствии ТФ (10 мкМ) она снижается на 32 % (5926 ± 192), а в присутствии FePPIX (10 мкМ) -
на 20 % (7111 ± 695). Таким образом, оба модулятора ТФ и FePPIX являются ингибиторами накопления АА клетками B16 / F10, но эффективность ТФ в 1,5 раза выше по сравнению с FePPIX. В условиях комбинирования двух модуляторов уровень накопления АА соответствует величине, характерной для ТФ (5539 ± 643) (рис. 5), что свидетельствует о конкурентном типе взаимодействия модуляторов с белками-мишенями АА.
Снижение способности клеток B16/F10 в присутствии ТФ накапливать АА может свидетельствовать о том, что ТФ вмешивается в механизм действия DOX уже на уровне поступления его в клетки. Таким образом, в исследованиях in vitro нами показано, что ТФ является модулятором токсичности DOX для клеток меланомы мышей линии B16/F10. Установлено, что ведущим механизмом гибели опухолевых клеток линии B16/F10 при воздействии на них DOX является апоптоз. В присутствии ТФ наблюдается защита клеток меланомы от индукции апоптоза уже на ранних этапах поступления АА в клетку путем переключения на программу преждевременного старения.
На следующем этапе исследования предстояло выяснить, сохраняется ли защитный эффект ТФ, выявленный in vitro, в условиях in vivo. Для решения этой задачи
12000
^ X10000
= t
S -с
S. Ii
8 .s 8000
m о 6000 cu V
£ ^ Q o
V g 4000
% X 2000
o. o
<u Ici ф
ол
u о 0
о
X
4
DNR DNR + ТФ DNR + FePPIX DNR +
ТФ + FePPIX
Рис. 5. Накопление С14-даунорубицина клетками линии B16/F10 в присутствии и без ТФ/FePPIX. DNR — даунорубицин, ТФ — тераф-тал, FePPIX — гемин
Fig. 5. C14-daunorubicin accumulation in B16/F10 cells with and without TF/FePPIX. DNR - daunorubicin, TF - teraftal, FePPIX - hemin
мы использовали сингенную экспериментальную модель (перевиваемую опухоль меланомы мышей Ме1В16) и исследовали влияние ТФ на эффективность лечения DOX.
(±313) мм3, 14-е - 5734 (±347) мм3, 17-е - 8934 (±486) мм3 после трансплантации опухоли. Во 2-й группе фОф объемы опухолей на 7-е сутки — 524 (±34) мм3, 10-е — 1658 (±204) мм3, 14-е — 3769 (±142) мм3, 17-е — 8323 (±471) мм3 после трансплантации опухоли. ТРО на 5, 8, 12, 15-е сутки после окончания лечения — 37, 34, 34 и 7 % соответственно. В 3-й группе (DOX + ТФ без временного интервала между введением препаратов) объемы опухолей на 7-е сутки: 501 (±39) мм3, 10-е — 1542 (±151) мм3, 14-е — 4057 (±256) мм3, 17-е — 7884 (±1144) мм3 после трансплантации опухоли. ТРО на 5, 8, 12, 15-е сутки после окончания лечения: 39, 38, 29 и 12 % соответственно. В 4-й группе (DOX + ТФ с интервалом между введением препаратов 2,5 ч) объемы опухолей на 7-е сутки — 533 (±159) мм3, 10-е — 1581 (±159) мм3, 14-е — 3856 (±293) мм3, 17-е — 8147 (±253) мм3. ТРО на 5, 8, 12, 15-е сутки после окончания лечения — 36, 37, 33 и 9 % соответственно. Результаты представлены в таблице и достоверны при р <0,05 на 7, 10, 14 и 5, 8, 12-е сутки соответственно. Таким образом, во всех группах мышей, получавших как один DOX, так и АА в комбинации с ТФ, наблюдался слабый противоопухолевый эффект (29—39 %), который практически полностью снижался к 15-м суткам.
Исследование влияния ТФ на противоопухолевую активность БОХ относительно перевиваемой опухоли мышей Ме1В16
Согласно данным, представленным в таблице, в 1-й группе (контрольной) наблюдался быстрый рост опухоли: на 7-е сутки — 827 (±69) мм3, 10-е — 2498
Заключение
Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют, что ТФ снижает токсичность DOX для клеток меланомы мышей B16/F10 в условиях in vitro и не влияет на эффективность лечения препаратом перевиваемой опухоли мышей MelB16.
Терапевтический эффект DOXотносительно меланомы мышей MelB16 в присутствии и без ТФ Therapeutic effect of DOX for MelB16 murine melanoma with and without TF
Средний объем опухоли после транспла нтации, мм3 ТРО после лечения, %
Группа Group Mean tumor volume a day after transplantation TGI % a day after treatment
сутки
7-е 10-е 14-е 17-е 5-е 8-е 12-е 15-е
Контроль 0,2 мл физраствора Control 0.2 ml of normal saline *827 i 69 *2498 i 313 *5734 i 347 8934 i 486
DOX 8 мг/кг DOX 8 mg/kg *524 i 34 *1658 i 204 *3769 i 142 8323 +471 *37 *34 *34 7
ТФ 25 мг/кг + DOX 8 мг/кг без интервала TF 25 mg/kg + DOX 8 mg/kg at the same time *501 i 39 *1542 i 151 *4057 i 256 7884 i 1144 *39 *38 *29 12
DOX 8 мг/кг + ТФ 25 мг/кг через 2,5 ч DOX 8 mg/kg + TF 25 mg/kg 2.5 hours later *533 i 159 *1581 i 159 *3856 i 293 8147 i 253 *36 *37 *33 9
*р <0,05на 7, 10, 14 и 5, 8, 12-е сутки соответственно. *p <0.05 for 7, 10, 14 and 5, 8, 12h day, respectively. Примечание. DOX — доксорубицин, ТФ — терафтал. Note. DOX — doxorubicin, TF — teraftal.
58 Оригинальные статьи
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Arcamone F.M. Fifty years of chemical research at Farmitalia. Chemistry 2009;15(32):7774-91.
DOI: 10.1002/chem.200900292.
2. Gewirtz D.A. A critical evaluation
of the mechanisms of action proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin. Biochem Pharmacol 1999;57:727-41.
DOI: 10.1016/s0006-2952(98)00307-4.
3. Doroshow J.H. Anthracycline antibiotic-stimulated superoxide, hydrogen peroxide, and hydroxyl radical production by NADH dehydrogenase. Cancer Res 1983;43(10):4543-51.
4. Kagan V.E., Bayir H.A., Belikova N.A. et al. Cytochrome c/cardiolipin relations in mitochondria: a kiss of death. Free Radic Biol Med 2009;46(11):1439-53. DOI: 10.1016/j.freeradbiomed. 2009.03.004.
5. Tarasiuk J., Frezard F., Garnier-Suillerot A., Gattegno L. Anthracycline incorporation in human lymphocytes. Kinetics of uptake and nuclear concentration. Biochim Biophys Acta 1989;1013(2):109-17.
DOI: 10.1016/0167-4889(89)90038-4.
6. Swift L.P., Rephaeli A., Nudelman A.
et al. Doxorubicin-DNA adducts induce a non-topoisomerase II-mediated form of cell death. Cancer Res 2006;66(9):4863-71. DOI: 10.1158/0008-5472.can-05-3410.
7. Skladanowski A., Konopa J. Interstrand DNA crosslinking induced by anthra-cyclines in tumour cells. Biochem Pharmacol 1994;47(12):2269-78. DOI: 10.1016/0006-2952(94)90265-8.
8. Tewey K.M., Rowe T.C., Yang L. et al. Adriamycin-induced DNA damage mediated by mammalian DNA topoisomerase II. Science 1984;226(4673):466-8.
DOI: 10.1126/science.6093249.
9. Hajji N., Mateos S., Pastor N. et al. Induction of genotoxic and cytotoxic damage by aclarubicin, a dual topoisomerase inhibitor. Mutat Res 2005;583(1):26-35. DOI: 10.1016/j. mrgentox.2005.01.012.
10. Mordente A., Meucci E., Martorana G.E. et al. Topoisomerases and Anthracycli-nes: Recent Advances and Perspectives in Anticancer Therapy and Prevention of Cardiotoxicity. Curr Med Chem 2017;24(15):1607-26. DOI: 10.2174/ 0929867323666161214120355.
11. Dartsch D.C., Schaefer A., Boldt S. et al. Comparison of anthracycline-induced death of human leukemia cells: programmed cell death versus necrosis.
Apoptosis 2002;7(6):537-48. DOI: 10.1023/a:1020647211557.
12. Bogason A., Bhuiyan H., Masquelier M. et al. Uptake of anthracyclines in vitro and in vivo in acute myeloid leukemia cells in relation to apoptosis and clinical response. Eur J Clin Pharmacol 2009;65(12):1179-86.
DOI: 10.1007/s00228-009-0734-4.
13. Koceva-Chyla A., Jedrzejczak M., Skierski J. et al. Mechanisms
of induction of apoptosis by anthra-quinone anticancer drugs aclarubicin and mitoxantrone in comparison with doxorubicin: relation to drug cytotoxicity and caspase-3 activation. Apoptosis 2005;10(6):1497-514. DOI: 10.1007/s10495-005-1540-9.
14. Olszewska-Slonina D., Drewa T., Czajkowski R., Olszewski K. Effect
of adriblastin on viability, cell cycle and apoptosis in B16 and cloudman s91 mouse melanoma cells in vitro. Acta Pol Pharm 2004;61(6):439-46.
15. Itzhaki O., Kaptzan T., Skutelsky E.
et al. Age-adjusted antitumoral therapy based on the demonstration of increased apoptosis as a mechanism underlying the reduced malignancy of tumors in the aged. Biochim Biophys Acta 2004;1688(2):145-59. DOI: 10.1016/j.bbadis.2003.11.009.
16. Chang B.D., Broude E.V., Dokmanovic M. et al. A senescence-like phenotype distinguishes tumor cells that undergo terminal proliferation arrest after exposure to anticancer agents. Cancer Res 1999;59:3761-7.
17. te Poele R.H., Okorokov A.L., Jardine L. et al. DNA damage is able to induce senescence in tumor cells in vitro and
in vivo. Cancer Res 2002;62(6):1876-83.
18. Rogalska A., Koceva-Chyla A., Jözwiak Z. Aclarubicin-induced ROS generation and collapse of mitochondrial membrane potential in human cancer cell lines. Chem Biol Interact 2008;176(1):58-70. DOI: 10.1016/j.cbi.2008.07.002.
19. Litwiniec A., Grzanka A., Helmin-Basa A. et al. Features
of senescence and cell death induced by doxorubicin in A549 cells: organization and level of selected cytoskeletal proteins. J Cancer Res Clin Oncol 2010;136(5):717-36. DOI: 10.1007/s00432-009-0711-4.
20. Eom Y.W., Kim M.A., Park S.S. et al. Two distinct modes of cell death induced by doxorubicin: apoptosis and cell death through mitotic catastrophe accompanied by senescence-like phenotype. Oncogene 2005;24(30):4765-77. DOI: 10.1038/sj.onc.1208627.
21. Joyner D.E., Bastar J.D., Randall R.L. Doxorubicin induces cell senescence preferentially over apoptosis
in the FU-SY-1 synovial sarcoma cell line. J Orthop Res 2006;24(6):1163-9. DOI: 10.1002/jor.20169.
22. Zingoni A., Cecere F., Vulpis E. et al. Genotoxic Stress Induces Senescence-Associated ADAM10-Dependent Release of NKG2D MIC Ligands
in Multiple Myeloma Cells. J Immunol
2015;195(2):736-48.
DOI: 10.4049/jimmunol.1402643.
23. Däbritz J.H., Yu Y., Milanovic M. et al. CD20-Targeting Immunotherapy Promotes Cellular Senescence in B-Cell Lymphoma. Mol Cancer Ther 2016;15(5):1074-81. DOI: 10.1158/ 1535-7163.MCT-15-0627.
24. Forrest R.A., Swift L.P., Rephaeli A. et al. Activation of DNA damage response pathways as a consequence
of anthracycline-DNA adduct formation. Biochem Pharmacol 2012;83(12):1602-12. DOI: 10.1016/j.bcp.2012.02.026.
25. Gewirtz D.A., Alotaibi M., Yakovlev V.A., Povirk L.F. Tumor Cell Recovery from Senescence Induced by Radiation with PARP Inhibition. Radiat Res 2016;186(4):327-32.
DOI: 10.1667/rr14437.1.
26. Svensson S.P., Lindgren S., Powell W., Green H. Melanin inhibits cytotoxic effects of doxorubicin and daunorubicin in MOLT 4 cells. Pigment Cell Res 2003;4:351-4.
DOI: 10.1034/j.1600-0749.2003.00030.x.
27. Heaney M.L., Gardner J.R., Karasav-vas N. et al. Vitamin C antagonizes the cytotoxic effects of antineoplastic drugs. Cancer Res 2008;68(19):8031-8. DOI: 10.1158/0008-5472.can-08-1490.
28. Tsiftsoglou A.S., Wong W., Wheeler C.
et al. Prevention of anthracycline-induced cytotoxicity in hemopoietic cells by he-min. Cancer Res 1986;46(7):3436-40.
29. Papadopoulou L.C., Tsiftsoglou A.S. Effects of hemin on apoptosis, suppression of cytochromec oxidase gene expression, and bone-marrow toxicity induced by doxorubicin (adriamycin). Biochem Pharmacol 1996;52(5):713-22.
DOI: 10.1016/0006-2952(96)00349-8.
30. Nagai T., Kikuchi S., Ohmine K.et al. Hemin reduces cellular sensitivity
to imatinib and anthracyclins via Nrf2. J Cell Biochem 2008;104(2):680-91. DOI: 10.1002/jcb.21659.
31. Böhmer R.M., Hoffmann K., Morstyn G. Hematoporphyrin derivative and anthracyclines mutually inhibit cellular uptake and toxicity. Cancer Chemother
Pharmacol 1987;20(1):16—20. DOI: 10.1007/bf00252953.
32. Сидорова Т.А., Какпакова Е.С., Вла-сенкова Н.К. и др. Различная реакция на терафтал культивируемых in vitro клеток, экспрессирующих Р-глико-протеин, и клеток, не экспрессирующих этот белок. Цитология 2001;43:889-90. [Sidorova T.A., Kakpakova E.S., Vlasenkova N.K.
et al. the different reaction in vitro the cell cultures, expressed or not P-glycoprotein, to teraphtal. Tsitologiya = Citology 2001;43:889-90. (In Russ.)].
33. Сидорова Т.А., Рябая О.О., Татарский В.В. и др. Терафтал (натриевая соль 4,5-октакарбоксифталоцианина кобальта снижает чувствительность опухолевых клеток к антрациклино-вым антибиотикам и митоксантрону in vitro. Клиническая онкогематоло-гия 2018;1:10-25. DOI: 10.21320/25002139-2018-11-1-10-25.
[Sidorova T.A., Ryabaya O.O.,
Tatarskiy V.V. et al. Teraphtal (sodium salt of 4,5-carboxyphtalocyanin-cobalt) decreased the sensitivity tumor cells to anthracyclines and mithoxantrone in vitro. Klinicheskaya onkologiya = Clinical Oncohematology 2018;1:10-25. (In Russ.)].
34. Aniogo E.C., George B.P.A., Abrahamse H. Phthalocyanine induced phototherapy coupled with Doxorubicin; a promising novel treatment for breast cancer. Expert Rev Anticancer Ther 2017;17(8):693-702.
DOI: 10.1080/14737140.2017.1347505.
35. Сидорова Т.А., Вагида М.С., Калия О.Л., Герасимова Г.К. Роль ка-талазы в защите опухолевых клеток от окислительного стресса, индуцированного бинарной каталитической системой («терафтал + аскорбиновая кислота»). Клиническая онкогемато-логия 2014;3:282-289. [Sidorova T.A., Vagida M.S., Kaliya O.L., Gerasimova G.K. The part of catalase in defence against oxydaive stress
of cancer cells induced by binaric catalytic system. Klinicheskaya onkologiya = Clinical oncohematology 2014;3:282-9 (In Russ.)].
36. Dimri G.P., Lee X., Basile G. et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 1995;92(20):9363-7. DOI: 10.1073/ pnas.92.20.9363.
37. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д., Васильев А.Н. и др. Руководство
по проведению доклинических исследований лекарственных средств. М.: Гриф и К, 2012, Ч.1. С.642-56. [Mironov A.N., Bunatyan N.D., Vasil'yev A.N. et al. Guidelines for preclinical trials of drugs . M.: 2012, v.1. P.642-56. (In Russ.)].
38. Forrest R.A., Swift L.P., Rephaeli A. et al. Activation of DNA damage response pathways as a consequence
of anthracycline-DNA adduct formation. Biochem Pharmacol 2012;83(12):1602-12. DOI: 10.1016/j.bcp.2012.02.026.
вклад авторов
Т.А. Сидорова: концепция и дизайн исследования;
Т.А. Сидорова, О.О. Рябая, А.А. Прокофьева, В.В. Татарский, Н.А. Андронова, В.И. Романенко, Д.А. Хоченков: сбор и обработка данных;
Т.А. Сидорова, О.О. Рябая, А.А. Прокофьева, В.В. Татарский, Н.А. Андронова, В.И. Романенко, Д.А. Хоченков: предоставление материалов исследования;
Т.А. Сидорова, О.О. Рябая, А.А. Прокофьева, В.В. Татарский, Н.А. Андронова, В.И. Романенко, Д.А. Хоченков: анализ и интерпретация данных;
Т.А. Сидорова: подготовка рукописи. Authors' contributions
T.A. Sidorova: study concept and design;
T.A. Sidorova, O.O. Ryabaya, A.A. Prokofieva, V.V. Tatarskiy, N.A. Andronova, V.I. Romanenko, D.A. Khochenkov: data accumulation and processing; T.A. Sidorova, O.O. Ryabaya, A.A. Prokofieva, V.V. Tatarskiy, N.A. Andronova, V.I. Romanenko, D.A. Khochenkov: provision of study materials; T.A. Sidorova, O.O. Ryabaya, A.A. Prokofieva, V.V. Tatarskiy, N.A. Andronova, V.I. Romanenko, D.A. Khochenkov: data analysis and interpretation; T.A. Sidorova: manuscript preparation.
ORCID авторов/ORCID of authors
Т.А. Сидорова/T.A. Sidorova: https://orcid.org/0000-0003-3498-061X О.О. Рябая/O.O. Ryabaya: https://orcid.org/0000-0001-6295-3497 Д.А. Хоченков/D.A. Khochenkov: https://orcid.org/0000-0002-5694-3492
конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Работа выполнена в рамках НИР 01201373454 «Идентификация новых молекулярных механизмов роста и прогрессии меланомы кожи человека».
Funding. The study was performed as part of the research project 01201373454 "Identification of new molecular mechanisms of human skin melanoma growth and progression".
Статья поступила: 10.10.2018. Принята в печать: 12.04.2019. Article reseived: 10.10.2018. Accepted for publication: 12.04.2019.
