CC BY
20
УДК 576.524+577.22
ТЕТРАМЕРНЫЙ RGD ВЫЗЫВАЕТ КЛАСТЕРИЗАЦИЮ РЕЦЕПТОРОВ ИНТЕГРИНА avp3 НА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА И СНИЖАЕТ ИХ ВЫЖИВАЕМОСТЬ
М.А. Рубцов1'2'6, А.А. Маслакова1'2'3, Д.М. Поташникова4, В.П. Вейко5, М.С. Сыркина1,2,5*
(1кафедра молекулярной биологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова; 2Международная Ассоциированная Лаборатория LIA 1066 «Laboratoire franco-russe de recherches en oncologie» биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова; кафедра физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова; кафедра клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова; ФИЦ Биотехнологии РАН; Отдел управления инновационной деятельностью, ПервыйМГМУ им. И.М. Сеченова; e-mail: krimsy@yandex.ru)
Получен рекомбинантный гибридный белок SR15, состоящий из стрептавидина, слитого на С-конце с меланома-адресующим RGD-пептидом. Продемонстрирована способность данного белка к узнаванию клеток меланомы человека (линия MeWo). Определены типы экспрессирующихся RGD-связывающих интегриновых рецепторов в клетках данной линии. Установлено, что рекомбинантный гибридный белок SR15 связывается с интегрином av03 на поверхности клеток меланомы. Связывание с белком SR15 приводит к кластеризации рецепторов av03 на поверхности клеток меланомы (MeWo), интернализации рекомбинантного белка и практически двукратному снижению выживаемости таких клеток.
Ключевые слова: RGD, стрептавидин, меланома человека, MeWo, интегрин, avP3 рецептор, кластеризация рецептора.
Метастазирование напрямую зависит от взаимодействия опухолевых клеток с белками внеклеточного матрикса, тромбоцитами, клетками эндотелия, различными орган-специфическими факторами. Одной из немаловажных характеристик ме-тастазирования является способность опухолевых клеток к прикреплению, миграции и инвазии через тканевой барьер. При инвазии происходит вовлечение механизмов клеточной адгезии, в которых принимают участие молекулы интегринов [1].
Функции интегринов разнообразны: они участвуют в клеточной адгезии, выступают в роли трансмембранных якорей для молекул цитоске-лета, активируют множество внутриклеточных сигнальных путей, приводящих к модификации поведения клетки (пролиферация, выживаемость, подвижность, изменение формы, полярности и дифференцировки), а также экспрессии ряда генов. К настоящему времени установлено, что в норме интегрины принимают участие в блокировании апоптоза (через Р13-киназу и Akt) и стимуляции прогрессии клеточного цикла (через ERK и циклин D1) [2].
Некоторые интегриновые рецепторы способны к узнаванию трипептида RGD в белках внеклеточ-
ного матрикса [3]. Было выявлено, что в клетках рака различного происхождения (меланома, глио-бластома, рак шейки матки, рак молочной, предстательной, поджелудочной железы, яичников, кишечника, немелкоклеточный рак легкого), а также в клетках эндотелия опухолевых сосудов наблюдается повышенная экспрессия ЯОЭ-узнающих интегриновых рецепторов [4-12]. В ряде случаев установлена прямая корреляция между гиперэкспрессией интегрина аурз в клетке и наличием у такой клетки высокого метастатического потенциала [9, 13, 14]. С учетом вышеупомянутой избирательности экспрессии интегрина аурз данная молекула может рассматриваться как онкомаркер. В настоящее время разрабатывается целый ряд противоопухолевых препаратов, действие которых основано на взаимодействии с данным рецептором, а в качестве адресующей группы используется ЯОЭ-пептид или имитирующая его молекула [15]. Однако ассоциация интегрина аурз с ЯОЭ-пептидами не всегда приводит к желаемому результату - уничтожению раковых клеток [16]. Более того, в ряде случаев следствием такого воздействия является увеличение пролиферации клеток опухоли [17]. В связи с вышесказанным
возникла необходимость дополнительного исследования функций интегриновых рецепторов - выявления их роли в процессах жизнедеятельности эукариотических клеток в норме, а также участия этих рецепторов в метастазировании злокачественных новообразований.
Цель данной работы - исследование влияния гибридного рекомбинантного белка, содержащего тетрамерный RGD, на жизнеспособность клеток метастатической меланомы.
Материалы и методы
Материалы, культуры клеток, штаммы бактерий
В работе использовали соли производства ком -пании «Merck» (Германия), а также отечественного производства («ос.ч.»); компоненты для получения микробиологических сред («Difco», США); агарозу, акриламид, N, N'-метиленбисакриламид, 2-иминобиотинагарозу, ДМСО («Sigma-Aldrich», США), Кумасси R-250 («Serva», Германия), мембраны и ячейки для ультрафильтрации («Amicon», США), ферменты и наборы для проведения PCR, экстракции фрагментов ДНК из агарозного геля и выделения плазмидной ДНК, а также ДНК-маркеры и белковые маркеры («Fermentas», Литва), FITC-биотин («Invitrogen», США), монокло-нальные антитела к различным цепям интегрино-вых рецепторов («Abcam», США), ПФА («Sigma-Aldrich», США), набор для определения проли-феративной активности клеток на основе ХТТ («Biological Industries», Израиль).
Для культивирования клеточных линий использовали модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM), раствор Версена, раствор трипсина («Панэко», Россия), фетальную сыворотку теленка («Hyclone», США), антибиотики пенициллин и стрептомицин («Sigma-Aldrich», США). Бактериальные штаммы получены из музея ФГУП ГосНИИ Генетика. Культура клеток меланомы человека (линия MeWo) была любез-
но предоставлена лабораторией радиоизотопных методов исследования НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.
Выделение фракции мембранных белков из клеток линии MeWo
10 млн клеток, осажденных центрифугированием (3 мин, 1600 об/мин), ресуспендирова-ли в 600 мкл лизирующего буфера (PBS, 100 мМ и-додецил^-й-мальтозид, 1 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 1 мМ ФМСФ) и инкубировали при перемешивании при +4°С в течение 1 ч. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием (30 мин при 20 000 об/мин).
Иммуноблоттинг
Мембранные белки, полученные из клеток линии MeWo, разделяли с помощью электрофореза в 10%-м ПААГ в денатурирующих условиях по Лэммли. Разделенные белки переносили на нитро-целлюлозную мембрану. Для идентификации цепей интегриновых рецепторов использовали, в соответствии с рекомендациями изготовителя, специфические моноклональные антитела («Abcam», США) и вторичные антитела осла (DARI) или овцы (SAMI), конъюгированные с пероксидазой хрена («Abcam», США). Названия антител, их разведения, а также количество лизата, использовавшееся для анализа, приведены в табл. 1. Идентификацию иммунных комплексов осуществляли с помощью набора «Clarity™ Western ECL Blotting Substrate» («Bio-Rad», США)
Получение химерного белка SR15
Получение конструкции pSR15 осуществляли аналогично получению конструкций pSdR [18] на базе вектора pUC18. Ген белка SR15 содержал фрагмент, кодирующий стрептави-дин, слитый с фрагментом, кодирующим RGD-содержащий пептид (последовательность пептида SRAGAGFPGCRGDCSQE). Полученным
Антитела, использовавшиеся для иммуноблоттинга
Антитело I Мишень Количество лизата (эквивалентное число тыс. клеток) Разведение антитела I Антитело II Разведение антитела II
EPR2417Y интегрин ß3 10 мкл (10) 1:500 DARI 1:10000
ab116570 интегрин ß5 20 мкл (20) 1:100 DARI 1:10000
ab55364 интегрин ß8 20 мкл (20) 1:200 SAMI 1:8000
EPR7854 интегрин а5 10 мкл (10) 1:1000 DARI 1:10000
EPR5583 интегрин avß6 10 мкл (10) 1:1000 DARI 1:10000
вектором трансформировали клетки штамма E. coli MG1655. Наработку и хроматографическую очистку слитого белка SR15 получали по методике, описанной в [19]. Очищенный белок лиофи-лизировали и хранили при -70°С. Концентрацию белка в растворе определяли спектрофотометри-чески при 280 нм, принимая коэффициент молярной экстинкции для стрептавидина равным 3,2 [20].
Мечение белка SR15 флуоресцеином
К раствору белка SR15 в 1 мМ Tris-HCl-буфере (pH 8,0) добавляли FITC, коньюгированный с био-тином (FITC-биотин), растворенный в ДМСО, и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте, используя молярное соотношение белокЛТС-биотин, равное 1:4.
Подготовка препаратов для флуоресцентной микроскопии
Клетки линии MeWo высевали на стекла или чашки со стеклом и растили в течение 24-48 ч до достижения 60-70% конфлюентности монослоя. Белок SR15 растворяли в РBS, фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и метили флуоресцеином по описанной выше методике. Среду удаляли, клетки промывали три раза однократным ДФСБ и 1 раз версеном. Затем в лунки вносили по 1 мл DMEM без сыворотки, содержащей 100 мкг/мл SR15, связанного с FITC-биотином (в пересчете на исходный SR15). Планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С, во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2 (или при +4°С). Для удаления несвязавшихся белков клетки промывали 3 раза однократным ДФСБ, после чего вносили в лунки по 3 мл DMEM без сыворотки. Полученные препараты незамедлительно анализировали, используя флуоресцентный микроскоп.
Иммуноокрашивание
После взаимодействия с FITC-меченым белком и удаления несвязавшегося белка клетки фиксировали на покровных стеклах 2%-м раствором пара-формальдегида в течение 10 мин при комнатной температуре. Иммуноокрашивание проводили с помощью первичных моноклональных антител мыши к интегрину avß3 (VNR-1) («Abcam», США) в разведении 1:500 и вторичных антител козы, конъюгированных с красителем Alexa-647, следуя рекомендациям производителя. После проведения иммуноокрашивания покровные стекла с препаратами клеток фиксировали на предметных стеклах в заключающей среде «DAKO Fluorescence
Mounting Medium» («Agilent Technologies», Германия) и хранили в темноте при +4° С.
Флуоресцентная микроскопия и исследование колокализации
Живые клетки и фиксированные препараты анализировали с помощью лазерного сканирующего микроскопа на базе «Nikon Eclipse» («Nikon», Япония). Полученные изображения изучали с помощью открытого сервиса для обработки и анализа изображений ImageJ (http://imagej.nih. gov/ij/), применяя плагины «Colocalization Test» и «Colocalization Threshold», позволяющие оценить достоверность, статистическую значимость (метод рандомизации Костес, коэффициент корреляции Пирсона p > 95%) и степень колокализации флуоресцентных сигналов (коэффициенты колокализации Мандерса). Для каждой из областей (кластер целиком, центральная часть кластера и область между кластерами) был проведен анализ не менее 10 изображений.
Проточная цитофлуориметрия
Клетки линии MeWo высевали на культураль-ные чашки диаметром 9 см («Greiner», Австрия) и растили в течение 13-15 ч до достижения 30% конфлюентности монослоя.
Белок SR15 растворяли в ФСБ, фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и метили флуоресцеином по описанной выше методике.
Клетки промывали с помощью ДФСБ и инкубировали в течение 5-10 мин с версеном. Версен удаляли и «снимали» клетки со дна чашки с помощью DMEM без сыворотки. Для подсчета клеток использовали камеру Горяева. Разведение проводили с помощью DMEM без сыворотки таким образом, чтобы в 1 мл суспензии содержалось 240 тыс. клеток. Суспензию делили на аликвоты по 250 мкл и добавляли к каждой аликвоте 25 мкл раствора белка SR15 в концентрации 1 мг/мл. Клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2 или при +4°С, периодически встряхивая. Для удаления несвязавшихся белков клетки промывали 3 раза однократным ДФСБ, после чего ресуспендировали в однократном ДФСБ и анализировали с помощью проточного цитофлу-ориметра «BD FACS ArialII» (США).
Определение жизнеспособности клеток
Клетки MeWo снимали 0,25%-м раствором трипсина/ЭДТА и готовили суспензию с концентрацией клеток 8000 кл/100 мкл среды. Суспензию вносил в лунки 96-луночного куль-турального планшета (по 100 мкл суспензии в
лунку) и инкубировали 24 ч при +37°С во влажной атмосфере в присутствии 5% СО2. Среду заменяли на бессывороточную (DMEM, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1* раствор заменимых аминокислот, 1 мМ пируват натрия, 300 мкг/мл БСА (не содержащего жирных кислот), 5 мкг/мл бычьего трансферрина, и инкубировали в течение ночи. В лунки вносили либо раствор моноклонального антитела мыши к интегрину avß3 (VNR-1) в разведении 1:1000, либо 1,5 мкМ раствор SR15, либо 6 мкМ раствор пептида GRGDS и инкубировали в течение 24 ч (контроль - клетки в бессывороточной среде). Выживаемость клеток детектировали с помощью коммерческого набора на основе реактива ХТТ по протоколу производителя. Оптическую плотность раствора хромогена в культуральном супернатанте определяли с помощью планшетного спектрофотометра «Zenyth 3100» («Anthos Labtec Instruments GmbH», Австрия). Результаты представлены в графическом виде: зависимость выживаемости клеток (в экспериментальных точках) в % относительно контроля 100%-й выживаемости от выживаемости ± стандартная ошибка среднего).
Результаты и обсуждения
Характеристика интегринового состава в клетках модельной линии (MeWo)
На поверхности опухолевых клеток могут одновременно присутствовать несколько типов RGD-связывающих интегринов [5, 21-23]. Более того, в ходе изменения метастатического потенциала клеток состав интегриновых рецепторов может изменяться [24]. Было показано, что уровни экспрессии отдельных субъединиц интегри-новых рецепторов отличаются в субпопуляциях клеток одной и той же линии, обладающих разным метастатическим потенциалом [25]. В связи с этим представлялось важным определить типы RGD-связывающих интегриновых рецепторов, присутствующие в клетках линии меланомы человека (MeWo), выбранной нами в качестве модели метастатического рака.
При выборе метода определения состава RGD-связывающих интегриновых рецепторов мы учитывали необходимость идентификации белкового продукта на поверхности клеток. В данной работе анализировали содержание разных типов RGD-связывающих интегринов во фракции мембранных белков с помощью метода иммуноблоттинга. Нами были использованы специфические антитела, подобранные таким образом, чтобы оценить наличие в клетках прак-
тически всех ЯОЭ-связывающих рецепторов (рис. 1, А). В результате проведенных экспериментов было установлено, что в клетках линии MeWo присутствуют интегрины аурз, аур5, а5р1, аур8, аурб, (рис. 1, Б).
Связывание белка БЯ15 с клетками Ыв№го приводит к его интернализации
Ранее было показано, что сконструированные нами белки SdR10, SdR13 и SdR15 обладают способностью к селективному узнаванию клеток меланомных линий человека (MeWo) и мыши (Б16Р10) благодаря наличию в их составе RGD-содержащего пептида [18]. Белок SR15, отличающийся от белка SdR15 только последовательностью линкера, располагающегося между молекулой стрептавидина и RGD-содержащим пептидом, обладал аналогичными свойствами [26]. Исследование флуоресценции популяций клеток, инкубированных с РГГС-меченым белком SR15, с помощью проточного цитофлуориметра показало наличие сдвига интенсивности флуоресценции по сравнению с клетками, инкубированными в отсутствие белка (рис. 2). Увеличение сдвига интенсивности флуоресценции у клеток, инкубированных с рекомбинантным белком при +37°С по сравнению с клетками, инкубированными с белком при +4°С, указывает на наличие интернализации РГТС-меченого белка SR15. Этот вывод подтверждают и данные конфокальной флуоресцентной микроскопии: у клеток, инкубированных с РГТС-меченым белком SR15 при +4°С, свечение РГТС наблюдается только на периферии (рис. 2, А1, Б1, В1), в то время как при инкубировании клеток с РГТС-меченым белком при +37°С свечение выявляется как по периферии, так и внутри клеток (рис. 2, А2, Б2, В2).
Для опухолевых клеток описан механизм перемоделирования внеклеточного матрикса, активирующийся при инвазии. Расположенные на поверхности таких клеток матриксные металлопротеазы расщепляют протяженные белковые структуры. Фрагменты матрикса, связанные с интегриновыми рецепторами, могут поглощаться клеткой, в лизо-сомах которой происходит их окончательная деградация. В частности, было продемонстрировано, что астроциты, претерпевшие злокачественную трансформацию, способны интернализовать и деградировать измененный витронектин [27]. Факт наличия интегрин-опосредованной интернализа-ции неоднократно отмечался исследователями, изучающими взаимодействие искусственно созданных RGD-содержащих молекул с опухолевыми клетками человека и животных. Так, в литературе
Рис. 1. Типы ЯвО-связывающих интегриновых рецепторов и антитела для идентификации соответствующих а- и Р-цепей (А). ЯвБ-связывающие интегрины, обнаруженные в клетках линии Ме"" с помощью данных антител
методом иммуноблоттинга (Б)
описана интернализация синтетической молекулы, содержащей тетрамерный ЯвО (ЯЛЕТ-ЯвО) [28], циклического пептида, содержащего ЯвО-мотив [29], а также конъюгата иммуноглобулин-циклоЯвО [30].
Белок 8Я15 содержит ЯвО-мотивы, наличие которых характерно для белков внеклеточного матрикса [31-34]. Таким образом, ассоциация 8Я15 с интегриновыми рецепторами на поверхности клеток меланомы может активировать те же сигнальные пути, которые активируются в опухолевых клетках во время перемоделирования внеклеточного матрикса. Следствием этого может являться наблюдаемая нами интернализа-ция ПТС-меченого 8Я15.
Кластеризация рецепторов ау$3 на поверхности клеток МвЖо
При инкубации клеток Ме"0 с белком 8Я15 на поверхности клеток происходит формирование кластеров, состоящих из интегриновых рецепторов аур3 (рис. 3, Б). В то же время в клетках, не инкубированных с белком, формирования кластеров не происходит (рис. 3, А).
Для подтверждения того, что в кластеризации участвуют рецепторы, активированные в результате связывания с белком 8Я15, был про-
веден анализ колокализации флуоресценции ИТС-меченого белка (рис. 4, А), связавшегося с клеточными рецепторами, и антител к инте-грину аур3, коньюгированных с Л1еха-647 (рис. 4, Б). На рис. 4, В представлено наложение изображений, полученных при детекции сигналов в соответствующих каналах, при этом области ко-локализации сигналов, соответствующих ИТС и Л1еха-647, выделены белым цветом. Видно, что максимальная степень колокализации сигналов наблюдается именно в кластерах, при этом в центре кластеров сигналы ИТС и Л1еха-647 колокализуются практически полностью (около 94%), Результаты статистического анализа указывают на то, что в области кластеров свыше 75% белка 8Я15 ассоциировано с интегрином аур3 и свыше 50% рецептора аур3 ассоциировано с белком 8Я15. В центральной части кластеров эти значения еще выше (более 94% рецепторов аур3 связаны с белком 8Я15, и свыше 94% белка 8Я15 связано с интегрином аур3). В областях, располагающихся между кластерами, наличие истинной колокализации рецепторов и белка статистически не подтверждается (рис. 4, В1). Таким образом, можно утверждать, что рецепторы аур3, связанные с белком 8Я15, оказываются «стянутыми» в кластеры.
Рис. 2. Флуоресценция клеток линии Ме"" в результате инкубации с 1,5 мкМ раствором белка 8Я15 в течение 1 ч при + 4°С (мембранная локализация флуоресценции РГГС) и при +37°С (мембранная и внутриклеточная локализация флуоресценции Б1ТС). А - флуоресценция Б1ТС, Б - фотографии в проходящем свете, В - объединенное изображение. Справа приведены графики распределения интенсивности флуоресценции в клеточных популяциях, подвергавшихся инкубации с раствором Б1ТС-меченого белка 8Я15 в разных температурных условиях (серый) и не подвергавшихся инкубации с каким-либо белком (черный)
Наличие в кластерах рецепторов аурз, не коло -кализованных с белком 8Я15, может объясняться простой диссоциацией белка по прошествии некоторого времени после первичного связывания с рецептором и его активацией. Вследствие этого активированный рецептор может участвовать в формировании кластера уже не будучи связанным с белком.
С другой стороны, присутствие в кластерах белков, не колокализованных с интегрином аурз, может также указывать на участие в формировании кластеров других ЯОЭ-связывающих инте-
гриновых рецепторов. Действительно, в ряде работ упоминается о взаимном влиянии интегринов аурз и а5р1 при связывании природных лигандов [27, 35].
Механизм кластеризации изучен достаточно подробно. В частности, показано, что одновременная ассоциация двух и более молекул рецепторов с близко расположенными лигандами приводит к образованию кластеров [36]. Вследствие кластеризации интегриновых рецепторов, индуцированной взаимодействием с ЯОЭ-мотивами молекул внеклеточного матрикса, происходит формирова-
SR15-
С
J Р
у . ?
Ж?'
«Г
Рис. 3. Кластеризация рецепторов аур3 на поверхности клеток линии Ме"о под влиянием белка 8Я15. А - флуоресценция Л1еха647 в клетках в отсутствие белка 8Я15, Б - флуоресценция Л1еха647 в клетках, инкубированных с 8Я15 в течение 1 ч. Кластеры отмечены стрелками
Рис. 4. Колокализация интегриновых рецепторов аур3 и белка 8Я15 в клетках линии Ме"о. А -флуоресценция Б1ТС (локализация белка 8Я15); Б - флуоресценция Л1еха647 (локализация инте-грина аур3); В - колокализованные точки; В1 - увеличенная область изображения В
ние фокальных контактов [37]. Имеются также примеры искусственно созданных молекул, содержащих несколько ЯвО-мотивов и способных связывать одновременно несколько интегрино-вых рецепторов аур3, что было подтверждено данными электронной микроскопии [28]. Кластеризацию интегриновых рецепторов аур3 вызывают также иммобилизованные на подложке близко расположенные ЯвО-содержащие ли-ганды [38-40]. В ряде работ также продемонстрировано, что мономерный ЯвО-мотив или моноклональное антитело к интегрину аур3 не способны вызвать кластеризацию данных рецепторов [41]. Предположительно, тетрамерный
белок SR15, содержащий в своем составе четыре RGD-мотива, обладает способностью к одновременному связыванию нескольких интегриновых рецепторов, индуцируя их кластеризацию на поверхности клеток.
Инкубация клеток с белком SR15 снижает их выживаемость
Блокировка интегриновых рецепторов может приводить к нарушению формирования интегрин-опосредованных функциональных контактов, обеспечивающих прикрепление клеток. Следствием этого является гибель клеток. Данный эффект описан в литературе в системах in vitro и in vivo.
Так, в одной из работ линейные ЯОЭ-миметики, связывающие интегрины аурз и аур5, индуцировали гибель клеток, адгезия которых к субстрату была опосредована данными рецепторами [42]. Аналогично, пептид ЯОЭ^ индуцировал открепление и апоптоз клеток микрососудов мозга [43]. Наконец, модификация остатка аргинина в ЯОЭ- и ОРООБЯ-мотивах коллагена IV типа, возникающая при гликемии, приводила к откреплению эн-дотелиальных клеток, результатом чего являлся аноикис и нарушение ангиогенеза [44].
В данной работе нами было продемонстрировано, что инкубация клеток линии MeWo с агентами, блокирующими ЯОЭ-связывающие инте-гриновые рецепторы, снижает выживаемость таких клеток (рис. 5). Сравнение выживаемости клеток линии MeWo, инкубированных с белком 8Я15, пептидом ОЯОЭ8 или антителом к инте-грину аурз, показало, что наибольшей эффективностью подавления роста клеток обладает белок 8Я15. Он снижает выживаемость клеток на 45%, а пептид и антитело - не более чем на 30% (рис. 5)
Вероятно, обработка клеток с помощью моно-клонального антитела, пептида ОЯОЭ8 или белка 8Я15 приводит к существенному снижению коли -чества интегринов аурз на поверхности клеток, участвующих в прикреплении клеток к субстрату. По данным литературы, клетки метастатической меланомы характеризуются повышенной экспрессией молекулы интегрина аурз [5, 13]. Присутствие большого количества интегрина аурз на поверхности клеток линии MeWo может создавать предпосылки к тому, что данная молекула играет доминирующую роль в формировании контактов с матриксом и прикреплении клеток к подложке.
Рис. 5. Выживаемость клеток линии MeWo (ХТТ-тест), инкубированных с пептидом ОЯвБ8 либо гибридным рекомбинантным белком 8Я15, либо антителом к ин-тегрину аурз. Контроль - клетки, инкубированные в бессывороточной среде БМБМ
Следовательно, блокировка интегринов avP3 может приводить к гибели клеток вследствие их открепления.
Связывание поливалентного лиганда с последующей кластеризацией интегриновых рецепторов индуцирует ассоциацию с С-концевой областью интегрина целого ряда цитоплазматических белков. В такой агрегации принимает участие ки-наза фокальных контатов (FAK) и молекулы цито-скелета, такие как F-актин, талин, a-актинин, тен-зин, винкулин, паксиллин и филамин [41]. Происходит формирование фокальных контактов, необходимых для прикрепления клеток к субстрату. С учетом вышесказанного можно предположить, что взаимодействие с белком SR15, приводящее к кластеризации рецепторов avP3, распознается клеткой как сигнал к формированию фокальных контактов. Сигнал к формированию контактов в новых местах может служить причиной значительного ослабления существующих взаимодействий клетки с подложкой. Открепление клеток, спровоцированное сигнал-опосредованной разборкой комплексов, обеспечивающих ассоциацию клетки с подложкой, может быть более интенсивным, чем открепление, вызванное блокировкой свободных интегриновых рецепторов. Это, в свою очередь, может являться причиной наблюдаемого нами более низкого уровня выживаемости клеток, инкубированных в присутствии белка SR15, по сравнению с клетками, обработанными моноклональным антителом или пептидом GRGDS. Однако для подтверждения данной гипотезы необходимо проведение дополнительных экспериментов.
Таким образом, можно отметить, что создание молекул, презентирующих несколько RGD-мотивов, представляет собой перспективное направление разработки противомеланомных препаратов и диагностических средств. Данные молекулы обладают способностью к высокоэффективному связыванию маркера метастазирующей меланомы (интегрина avP3) и интернализации. Вместе с тем следует учитывать тот факт, что токсический эффект данных молекул, наблюдаемый в системе in vitro, может быть обусловлен активацией механизмов перестройки цитоскелета, вызывающих открепление клеток от субстрата. Тем не менее in vivo опухолевые клетки, участвующие в формировании метастазов, обладают способностью к выживанию в открепленном от матрикса состоянии [45]. Более того, эта способность позволяет им перемещаться с током крови и участвовать в диссеминации опухоли [46]. В данном случае индуцированное взаимодействием с лигандом от-
крепление клеток может ускорить процесс диссе-минации и тем самым повысить агрессивность заболевания [47]. Все вышесказанное подчеркивает важность детального исследования механизмов ЯвО-опосредованной адгезии и изменения жизнеспособности опухолевых клеток в зависимости от прикрепления к субстрату.
Авторы выражают благодарность Ивану Андреевичу Воробьеву (кафедра клеточной биологии и гистологии Биологического факультета МГУ), а также Анастасии Архиповой и Михаилу Михайловичу Мойсеновичу (кафедра биоинженерии Биологического факультета МГУ) за содействие и помощь в проведении экспериментов.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 13-04-01875_А, 14-04-93105_НЦНИЛ_а, 15-54-16007_НЦНИЛ_а, 15-54-16016_ НЦНИЛ_а), 16-34-60233 мол_а_дк. Использовано оборудование, приобретенное за счет средств Программы развития МГУ: Комплекс для клеточной сортировки на базе FACS Aria SORP (Becton, Dickinson and Company, США) и Конфокальная лазерная сканирующая система, производства «НИКОН КОРПОРЕЙШН» («Nikon», Япония).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Sloan E.K., PouliotN., Stanley K.L., etal. II Breast Cancer Res. 2006. Vol. 8. N 2 P. R20.
2. HynesR.O. II Cell. 2002. Vol. 110. N 6. P. 673.
3. Saudek V., Atkinson R.A., Pelton J.T. II Biochemistry. 1991. Vol. 30. N 30. P. 7369.
4. Varner J.A., Cheresh D.A. II Curr Opin Cell Biol. 1996. Vol. 8. N 5. P. 724.
5. Albelda S.M., Mette S.A, Elder D.E. et al. II Cancer Res. 1990. Vol. 50. N 20. P. 6757.
6. Hsu M.Y., Shih DT, Meier FE, et al. II Am J Pathol. 1998. Vol. 153. N 5. P. 1435.
7. Gladson C.L., Hancock S., Arnold M.M., et al. II Am J Pathol. 1996. Vol. 148. N 5. P. 1423.
8. Vonlaufen A., Wiedle G., Borisch B., Birrer S., Luder P., Imhof B.A. II Mod Pathol. 2001. Vol. 14. N 11. P. 1126.
9. Chattopadhyay N., ChatterjeeA. II J Exp Clin Cancer Res. 2001. Vol. 20. N 2. P. 269.
10. Liapis H., Adler L.M., Wick M.R., Rader J.S. II Hum Pathol. 1997. Vol. 28. N 4. P. 443.
11. Sengupta S., Chattopadhyay N., Mitra A. et al. II J Exp Clin Cancer Res. 2001. Vol. 20. N 4. P. 585.
12. Pignatelli M., Cardillo M.R., Hanby A., Stamp G.W. II Hum Pathol. 1992. Vol. 23. N 10. P. 1159.
13. Gehlsen K.R., Davis G.E., Sriramarao P. II Clin Exp Metastasis. 1992. Vol. 10. N 2. P. 111.
14. Vogetseder A., Thies S., Ingold B. et al. II Int J Cancer. 2013. Vol. 133. N 10. P. 2362.
15. Mas-Moruno C., Rechenmacher F., Kessler H. II Anticancer Agents Med Chem. 2010. Vol. 10. N 10. P. 753.
16. Reardon D.A., Nabors L.B., Stupp R., Mikkelsen T. II Expert Opin Investig Drugs. 2008. Vol. 17. N 8. P. 1225.
17. Reynolds A.R., Hart I.R., Watson A.R. II Nat Med. 2009. Vol. 15. N 4. P. 392.
18. Syrkina M.S., Shirokov D., Rubtsov M. et al. II Protein Engineering, Design and Selection. 2012. Vol. 26. N 2. P. 143.
19. Рубцов М.А., Вейко В.П., Окорокова Н.А., Сыркина М.С., ЗамятнинА.А. Пат. РФ № 2563540. 2015.
20. Suter M., Cazin J., Jr., Butler J. E., Mock D.M. II J. Immunol. Methods. 1988. Vol. 113. N 1. P. 83.
21. Gruber G., Hess J., Stiefel C. et al. II Br. J. Cancer. 2005. Vol. 92. N 1. P. 41.
22. Bello L., FrancoliniM., Marthyn P. et al. II Neurosurgery. 2001. Vol. 49. N 2. P. 380.
23. Adachi M., Taki T., Higashiyama M. et al. // Clin. Cancer Res. 2000. Vol. 6. N 1. P. 96.
24. Plantefaber L.C., Hynes R.O. // Cell. 1989. Vol. 56. N 2 P. 281.
25. Pecheur I., Peyruchaud O., Serre C.-M. et al. // FASEB J. 2002. Vol. 16. N 9. 1266.
26. СыркинаМ.С., Широков Д.А., Вейко В.П., Попов В.О., Рубцов М.А. Пат. РФ № RU 2012150079 A. 2014.
27. Pijuan-Thompson V., Gladson C.L. // J Biol Chem. 1997. Vol. 272. N 5. P. 2736.
28. Sancey L., Garanger E., Foillard S. et al. // Mol Ther. 2009. Vol. 17. N 5. P. 837.
29. Moncelet D., Bouchaud V., Mellet P. et al. // PLoS One. 2013. Vol. 8. N 12. P. e82777.
30. SchraaA.J., KokR.J., Berendsen A.D. et al. // Journal of Controlled Release. 2002. Vol. 83. N 2. P. 241.
31. Barczyk M., Carracedo S. and D. Gullberg D. // Cell and Tissue Research. 2010. Vol. 339. N 1. P. 269.
32. Beaulieu J. F. // Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 1997. Vol. 31. N 4. P. 1.
33. Pozzi A., Zent R. // Current Opinion in Cell Biology. 2011. Vol. 23. N 5 P. 547.
34. D. Sheppard // BioEssays. 1996. Vol. 18. N 8. P. 655.
35. LyD.P., ZazzaliK.M., CorbettS.A. // J Biol Chem. 2003. Vol. 278. N 24. P. 21878.
36. Maheshwari G, Brown G, Lauffenburger DA, Wells A, Griffith LG. // J Cell Sci. 2000. Vol. 113. N 10. P. 1677.
37. Yamada K.M., Geiger B. // Curr. Opin. Cell Biol. 1997. Vol. 9. N 1. P. 76.
38. Arnold M., Hirschfeld-Warneken V.C., Lohmuller T. et al. // Nano Lett. 2008. Vol. 8.N 7. P. 2063.
39. Jiang G.Y., Giannone G., Critchley D.R. et al. // Nature. 2003. Vol. 424. N 6946. P. 334.
40. Schvartzman M., Palma M., Sable J. et al. // Nano Lett. 2011. Vol. 11. N 3. P. 1306.
41. Miyamoto S., Akiyama S.K., Yamada K.M. // Science. 1995. Vol. 267. N 5199. P. 883.
42. Maubant S., Saint-Dizier D., Boutillon M. et al. // Blood. 2006. Vol. 108. N9. P. 3035.
43. Erdreich-Epstein A., Tran L.B., Cox O.T. et al. // Blood. 2005. Vol. 105. P. 4353.
44. Dobler D., Ahmed N., Song L. et al. // Diabetes. 2006. Vol. 55. N 7. P. 1961.
45. Freedman V.H., Cellular S.S. // Cell. 1974. Vol. 3. P. 355.
46. Vasiliev J.M., Omelchenko T., Gelfand I.M., Feder
H.H., Bonder E.M. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2004. Vol. 101. 34. P. 12526. 47. Seftor R.E., Seftor E.A., Gehlsen K.R. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1992. Vol. 89. N 5. P. 1557.
Поступила в редакцию 04.07.16
TETRAMERIC RGD INDUCES CLUSTERING OF INTEGRIN av03 ON THE MELANOMA CELL SURFACE AND DECREASE OF CELL VIABILITY
M.A. Rubtsov1,2,6, A.A. Maslakova1,2,3, D.M. Potashnikova4, V.P. Veiko5, M.S. Syrkina1,2,5
(Department of Molecular Biology, Faculty of Biology M.V.Lomonosov Moscow State University; LIA 1066 French-Russian Joint Cancer Research Laboratory; Department of Human and Animal Physiology, Faculty of Biology M.V.Lomonosov Moscow State University; 4Department of Cell Biology and Histology, Faculty of Biology M.V.Lomonosov Moscow State University; Bach Institute of Biochemistry, Research Center of Biotechnology of the Russian Academy of Sciences; Innovation Management Department/ Department of Biochemistry, I.M. Sechenov First Moscow State Medical University; e-mail: krimsy@yandex.ru)
The recombinant hybrid protein SR15 composed of streptavidin fused with RGD-bearing peptide was obtained. It's selective binding to human melanoma cells (MeWo) was demonstrated. Composition of the RGD-binding integrins on the surface of MeWo cells was identified. It was established that the recombinant protein SR15 binds to integrin av03 on the surface of human melanoma cells. It was also shown that such binding induces clustering of avP3 receptors on the surface of MeWo cells with following internalization of the recombinant protein and results in twofold decrease in cell viability.
Key words: RGD, streptavidin, human melanoma, MeWo, integrin, avP3, receptor clustering.
Сведения об авторах: Рубцов Михаил Александрович - вед. науч. сотр. кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, гл. спец. отдела управления инновационной деятельностью ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, канд. биол. наук (ma_ rubtsov@mail.ru); Маслакова Айтсана Алексеевна - мл. науч. сотр. кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, мл. науч. сотр. кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (aitsana.dokrunova@ gmail.com); Поташникова Дарья Марковна - науч. сотр. кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. биол. наук (dariapotashnikova@ yandex.ru); Вейко Владимир Петрович - гл. науч. сотр. лаборатории молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, докт. биол. наук, профессор (vladveiko@yahoo.com); Сыркина Марина Сергеевна - ст. науч. сотр. кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, мл. науч. сотр. лаборатории молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, канд. биол. наук (krimsy@yandex.ru).
