АННОТАЦИЯ MALDI-МАСС-СПЕКТРОВ КЛЕТОЧНОЙ БИОМАССЫ ШТАММОВ CANDIDA ALBICANS BERKHOUT Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 543.51:582.282.232

DOI: 10.24412/1999-6780-2022-1-41-52

АННОТАЦИЯ MALDI-MACC-

СПЕКТРОВ КЛЕТОЧНОЙ БИОМАССЫ ШТАММОВ CANDIDA ALBICANS BERKHOUT

1Рябинин И.А. (н.с., ассистент кафедры) *, 2Сальникова В.А. (врач-стажер), 1 Васильева Н.В. (директор НИИ, зав. кафедрой)

1Северо-западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, кафедра медицинской микробиологии, Санкт-Петербург; 2Городская больница №1 им. Н.И. Пиро-гова, Севастополь, Россия

В работе представлены данные сравнения масс-листов, получаемых благодаря MALDI-TOF-масс-спектрометрии клеточной биомассы Candida albicans, а также результаты аннотации MALDI-масс-спектров, в которой найдены соответствия между белками и пептидами из протеома данного микромицета и отдельными пиками. Исследовали 12 штаммов С. albicans клинического происхождения. Показано, что штаммы С. albicans имеют различающиеся масс-листы и, как следствие, различающиеся по набору группы спектрообразующих белков и пептидов. Изучены особенности аминокислотного состава этих соединений, показано их своеобразие в сравнении с аминокислотной композицией целой дрожжевой клетки. Отличительные особенности представленной работы в сравнении с ранее опубликованными сообгцени-ями по данному направлению: (1) использование не только коллекг\ионных штаммов, но и первичных изолятов, (2) аннотирование масс-спектров из культур нескольких штаммов с последующим сопоставлением. В работе обоснована возможность применения MALDI-TOF-MS для внутривидового цитирования С. albicans, а также опосредованно - в исследовании различий штаммов по выраженности факторов вирулентности. Найдены белки, уникальные для С. albicans и перспективные, таким образом, как «мишени» в создании тест-систем некуль-туральной диагностики инвазивного кандидоза.

Ключевые слова', аннотация, белки и пептиды, инва-зивный кандидоз, протеомика, Candida spp., С. albicans, MALDI-TOF-масс-спектрометрия

ANNOTATION OF MASS-SPECTRA OF CELLULAR BIOMASS FROM CANDIDA ALBICANS BERKHOUT STRAINS

1Ryabinin I.A. (scientific researcher, assistant

* Контактное лицо: Рябинин Игорь Андреевич, e-mail: lgor.Ryabinin@szgmu.ru

of the department), 2Salnikova V.A. (trainee doctor), Vasilyeva N.V. (director of the Institute, head of the department)

1 North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov: Kashkin Research Institute of Medical Mycology, St. Petersburg; Department of Medical Microbiology, 2City Hospital №1 named after N.I. Pirogov, Sevastopol, Russia

The report presents data of comparison of the mass-lists obtained by MALDI-TOF mass-spectrometry of Candida albicans cell biomass, as well as the results of the annotation of MALDI-mass-spectra, in which correspondences between proteins and peptides from the proteome of this micromycete and individual peaks were found. 12 strains of C. albicans of clinical origin were studied. It was shown that C. albicans strains have different mass-lists and, as a result, different groups of specter-forming proteins and peptides. The features of the amino acid composition of these compounds have been studied, their originality has been shown in comparison with the amino acid composition of the whole yeast cells. The distinctive features of the presented work in comparison with previously published reports in this area were: (1) the use of not only collection strains, but also primary isolates, (2) annotation of mass-spectra from cultures of several strains with subsequent comparison. The report substantiates the possibility of using MALDI-TOF-MS for intraspecific typing of C. albicans, as well as indirectly — in the study of strain differences in the expression of virulence factors. Proteins unique to C. albicans and therefore promising as «targets» for the creation of test-systems for non-cultural diagnostics of invasive candidiasis have been found.

Key words: annotation, proteins and peptides, invasive candidiasis, proteomics, Candida spp., C. albicans, MALDI-TOF mass-spectrometry

ВВЕДЕНИЕ

Инвазивный кандидоз (ИК) на настоящий момент остаётся наиболее частой в практике системной инфекцией, вызванной условно-патогенными грибами. Именно для ИК, по сравнению с другими оппортунистическими микозами, характерна самая большая группа риска среди пациентов стационаров [1]. Несмотря на то, что в последние годы многие авторы все чаще сообщают о тенденции к возрастанию доли в структуре возбудителей обширной группы Candida non-albicans, С. albicans остаётся лидирующим по частоте возбудителем ИК [2]. Это положение можно объяснить двумя фактами. Во-первых, С. albicans — наиболее частый колонизатор кишечника человека среди микроскопических грибов, а именно кишечник считают основным эндогенным источником возбудителя, наряду с возможностью внедрения с наружных покровов через сосудистый катетер [3]. Кроме того, при развитии иммуносупрессии С. albicans способна воздействовать на организм хозяина наиболее широким «арсеналом» факторов вирулентности. К таким факторам и комплексам факторов относят: продукцию аспартиловой протеазы не-

скольких изоформ; наличие гемолизина — «кандида-лизина»; выделение фосфолипаз; широкий температурный оптимум — адаптация при нормальной и фебрильной температуре тела человека; комплекс адгезинов; антиоксидантную систему; способность к образованию биопленок; синтез эндогенных нитро-заминов; выделение ингибиторов тромбоцитарных антимикробных пептидов; наконец, возможность образования элементов истинного мицелия и псевдомицелия, которые облегчают развитие ангиоинва-зии [3, 4]. Ни один другой возбудитель микозов не может вызывать столь разнообразные поражения, как Candida spp., и С. albicans в частности. Именно по совокупности этих фактов С. albicans продолжает оставаться актуальным объектом исследования, хотя опыт изучения прикладных аспектов биологии этого микромицета значителен.

Современные отечественные работы по изучению Candida spp. связаны в том числе с определением чувствительности возбудителей кандидоза к противогрибковым лекарственным средствам [5-7], ультраструктурой их клеток [8-10], физико-химическими свойствами, выявляемыми с помощью времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF-масс-спектрометрии) [11, 12], комплексной характеристикой возбудителей инвазивно-го кандидоза в клинических и эпидемиологических исследованиях [13, 14].

В настоящее время MALDI-идентификация С. albicans не представляет сложностей: базы масс-спектро-профилей достаточно комплектны, культуры данного микроорганизма можно готовить к исследованию методом кислотного травления на мишени или получения клеточного экстракта. Однако отметим, что до сих пор не удаётся достаточно надёжно дифференцировать классический вид С. albicans от более редких видов комплекса С. dublinîensis и С. africana. В частности, у С. albicans и С. dublinîensis типовые MALDI-масс-спектры отличаются соотношением интенсивности доминантных пиков, но не их композицией.

Разработан оригинальный приём аннотирования MALDI-масс-спектра клеточного экстракта или клеточной биомассы микроорганизма, позволяющий установить конкретные белки и пептиды, формирующие масс-спектр [15]. С биологической точки зрения это определение позволяет понять, какие белки и пептиды доминируют в низкомолекулярной фракции протеома молодой культуры, то есть являются критичными для адаптации микромицета на инициальной стадии роста. С помощью такого подхода аннотированы типовые масс-спектры клеточных экстрактов грибов родов Aspergillus и Pénicillium [16, 17]. Среди возбудителей кандидоза такие данные нами получены для С. glabrata [18], но для С. albicans составлена только краткая сводка, опублико-

ванная в виде предварительного сообщения [19].

Цель работы: составить подробную аннотацию MALDI-масс-спектра биомассы клеток молодых культур С. albicans.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы С. albicans. В исследование включили штаммы из Российской коллекции патогенных грибов РКПГ Y-463 (в двух независимо исследованных субкультурах), РКПГ Y-1059 и РКПГ Y-1274, а также штаммы 159ser, 228, 325, 329, 1112, 1118, 1140, 1442, 162, выделенные из биоматериалов человека в отделении лабораторной диагностики микологической клиники СЗГМУ.

Съемка масс-спектров и видовая идентификация штаммов. Штаммы из РКПГ Y-463, Y-1059 и Y-1274 перед исследованием культивировали на плотной среде Сабуро в модификации Эммонса при 35 °С 24 ч, затем из полученной биомассы получали экстракт по стандартной процедуре, как описано ранее [11, 12]. Экстракт наносили в объеме по 2 мкл на позиции масс-спектрометрической мишени МТР 384 target plate polished steel ВС и высушивали под тягой. Остальные штаммы исследовали как первичные изо-ляты из клинического материала, полученные на различных плотных средах (агар Сабуро, кровяной агар, среде «UriSelect4»), Их биомассы обрабатывали на мишени ранее успешно использованным методом «двойного кислотного травления», который был нами применен для Cryptococcus neoformans [20]. Подготовленные экстракты и клетки на мишени покрывали насыщенным при комнатной температуре раствором MALDI-матрицы «НССА» (4-гидроксикоричной кислоты) в растворителе «OS» (Bruker Daltonik GmbH, Германия) по 2 мкл на позицию и сушили под тягой. Далее выполняли масс-спектрометрическую съемку на инструменте Аи-toflex speed TOF/TOF с пакетами программного обеспечения flex и MALDI Biotypcr (Bruker Daltonik) в режиме «МВТ».

Видовую идентификацию полученных масс-спектров провели в MALDI Biotypcr ОС путем сравнения с «библиотекой» типовых масс-спектро-профилей Bruker Taxonomy. В дальнейшее исследование включали только масс-спектры, идентифицированные с установленными производителем показателями достоверности Score Yalue>2,0 и категорией идентификации «А».

Сравнительный анализ масс-листов. Масс-листы сгенерированы во flexAnalysis и переведены в LibreOffice Cale, где для групп пиков по величинам m/z введены «точки сравнения» — условные значения на шкале m/z, представленные для более наглядного сравнения масс-листов различных штаммов между собой. Сопоставление «точек сравнения» проведено графическим путем с помощью редактора Paint.

Аннотирование МА1Л)1-масс-спектров выполнено по ранее разработанному и описанному алгоритму [15-18], который в кратком изложении включает следующие этапы: получение масс-листа во ПсхАпаН^, поиск соответствий по параметрам пиков в TagIdent с применением биоинформационных баз Ь'шРго! и ТгЕМВЬ, выкопировку данных о конкретном белке или пептиде в ЬтРго! и связанных ресурсах.

Определение особенностей аминокислотного состава белков и пептидов, образующих МАЬБ1-масс-спектр, выполнено согласно ранее использованному подходу [21] по формуле:

уДЛ®

^тах

Уп

где г^ - количество аминокислотных остатков в конкретном полипептиде, Хак — общее количество конкретных аминокислотных остатков во всех спек-трообразующих полипептидах, У - среднее содержание (в %) конкретного аминокислотного остатка в последовательности одного типичного спектрообра-зующего полипептида. Вывод формулы для краткости не приводим. Допустимость такого расчета и репрезентативность показателя У определяется тем, что при N1А Ь ОI - и о н из а ц и и в заданном режиме и с использованием выбранной матрицы образуются ионы не любых белков и пептидов с Мг в интервале

2-20 kDa, а только тех веществ данной группы, которые наиболее эффективно экстрагируются при кислотном травлении клеточной биомассы и лидируют при взаимодействии с возбужденными молекулами матрицы. Косвенно данное явление подкрепляется тем фактом, что матрица «НССА» ионизирует белки и пептиды различных масс в интервале детекции неравномерно, то есть максимальной интенсивности пики MALDI-масс-спектра достигают на определенном интервале, как это часто бывает видно при работе с материалом колоний микромицетов [22]. Для подтверждения этого явления в случае с выбранным объектом изучения строили диаграмму распределения выявленных спектрообразующих полипептидов по предполагаемым величинам Mr.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Основные результаты исследования в кратком виде показаны в таблице I и на рисунке I. Из MAL-DI-масс-спектров биомассы клеток С. albicans с использованием стандартного критерия включения (отношение интенсивности ионного тока «сигнал : шум» S : N > 3) получаются масс-листы, включающие в среднем 55±3 пика (в формате М±щ). Для сравнения масс-листов всех изученных штаммов выбрали следующие условные точки: 2; 2,1; 3; 3,3; 3,4; 5,1; 6; 6,1; 6,2; 6,4; 6,6; 6,9; 7; 7,1; 7,2; 8,7; 9,5; 10; 10,3; 10,4 kDa (всего 20).

Таблица 1

Сводная аннотация MALDI-масс-спектра клеточной биомассы штаммов С. albicans

Наличие пика в масс-

M/Z пиков Параметры белков и пептидов спектрах штаммов С. albicans

Условное

маркерное M/Z пика Mr белка Na/к Название или номер последовательности 159 ser 228 325 329

значение

2400 2407.931 2242 23 АОАОАЗО№9 — — — +

3000 3029.455 3086 32 А0А0АЗСй31 + + + +

3098.693 3169 31 А0А0А4ЕЖ91 + + + +

3200 3235.663 3243 31 А0А0А4А4А5 — + + —

3300 3379.144 3382 32 Нуклеокапсид-подобный пептид, несущий домен типа «цинкового пальца», вероятный фактор вирулентности + + + —

3400 3443.915 3443 34 А0А0А4АЕА2 + — — +

3453.374 3465 31 А0А0А4АНК6 + + + +

3472.576 3483 35 Металлотионеин, способный к захвату ионов меди + — + —

3490.230 3491 31 А0А0А6М6М5 + + + +

3500 3512.288 3512 33 АОАОАЗЕЗБО — + + +

3100 3519.857 3538 33 АОАОАЗ1Ш5 — — — +

4800 4821.382 4963 45 А0А0АЗСХ92 — — + —

5100 5191.507 5193 49 АОАОАЗСРРО + + + —

5400 5472.240 5473 52 А0А0АЗВК04 — — + —

5900 5998.960 6009 54 Фосфопантотеноилцистеин-декарбоксилаза — + + +

6000 6020.836 6028 53 А0А0А61К05 + — + —

6034.897 6036 53 АОАОАЗВОР2 — + — —

6064.456 6067 55 А0А0А4СЕ13 + + + +

6084.579 6086 54 А0А0А6Юг7 + — + —

6090.784 6090 55 Трансмембранный белок + — —

6100 6105.876 6107 58 А0А0АЗС9г1 — — + +

6119.274 6122 58 Трансмембранный белок + + + —

6127.253 6128 58 Сериновая/треониновая протеинкиназа (предположительно). Участвует в эндоцитозе сфинголипидов + + — —

6147.614 6149 56 Трансмембранный белок — — + —

6146.193 6146 53 А0А0А6МЕ05 — + + —

6158.639 6160 57 АОАОАЗСЕУб + — — —

6162.525 6163 56 «Фактор инвазивного роста филаментов и гомеостаза клеточной стенки» — + + —

6189.999 6189 56 А0А0АЗй850 — — + +

6190.122 6190 57 А0А0АЗС8А7 — + — —

6200 6201.554 6204 65 А0А0АЗС7Р2 + + + +

6222.561 6222 56 АОАОАЗВКиЗ + — — —

6225.310 6228 56 АОАОАЗйКВО — + + +

6241.279 6246 52 С4УОР5 + — — —

6263.895 6264 56 Трансмембранный белок + — — —

6266.649 6274 52 АОАОАЗСйНЗ — + + —

6300 6360.364 6366 57 АОАОАЗО!г1 — — — +

6400 6443.670 6447 58 АОАОАЗОСР1 — — + —

6472.218 6481 61 А0А0А6ШУ1 + + + +

6496.663 6498 60 Белок, индуцируемый биопленкой. Трансмембранный белок + + + —

6500 6511.738 6537 61 Трансмембранный белок — + + +

6558.030 6558 60 А0А0А6КЬЮ1 — + — —

6571.332 6576 61 Гликофосфатидилинозитол-заякоренный белок (предположительно) — + — —

6600 6620.114 6628 63 Долихил-дифосфоолигосахарид-протеин-гликозилтрансфераза + + + —

6622.945 6628 57 А0А0А4ВРА1 — — — +

6664.578 6668 60 АОАОАЗОгШ — + + +

6700 6788.699 6788 64 А0А0А6ША9 — — — +

6 800 6810.870 6810 67 А0А0АЗВН1_8 — — + —

6814.214 6815 64 А0А0А6К4Т7 — + — —

6843.334 6845 62 А0А0АЗССУ7 — — + —

6847.951 6851 67 АОАОАЗг070 + — — —

6900 6910.129 6913 64 Субъединица 7а цитохром С-оксидазы + + + +

6936.028 6936 62 Трансмембранный белок + — — —

6940.191 6952 67 АОАОАЗССБО — + + +

6983.537 6991 63 А0А0АЗСКО2 + + + +

7000 7007.267 7013 64 Фактор сборки цитохром С-оксидазы. Обладает функцией шаперона, способен к захвату ионов меди + — — —

7014.922 7020 65 АОАОАЗСгиЗ — — + —

7025.437 7032 66 А0А0А6Ю14 + + + +

7046.074 7053 65 А0А0АЗХ901 + + + +

7064.220 7065 65 А0А0АЗС9Н1 — — + —

7068.034 7110 66 Рибосомальный белок БЗО (малая 40Э субъединица) — + — —

7083.852 7112 66 Рибосомальный белок 1.29 (большая 60Б субъединица) — + — —

7084.741 7105 65 А0А0А61360 + — + —

7100 7109.338 7109 62 Белок, репрессируемый фактором транскрипции Нар43р + — + —

7121.451 7122 67 А0А0АЗХЭ84 — — + —

7126.252 7140 63 А0А0А6ММ18 + + + +

7150.150 7165 67 А0А0А6МС99 + + + +

7200 7281.270 7284 63 А0А0АЗСй42 — + — +

7500 7571.625 7574 74 А0А0АЗС0В0 — + — +

7600 7601.841 7614 73 АОАОАЗОИС2 — + — —

7620.820 7623 73 АОАОАЗСШ — + — —

8000 8764.108 8777 76 Трансмембранный белок + + — —

9500 9578.964 9583 86 Ингибитор АТФаз — + + +

9900 9949.096 9968 91 А0А0АЗВ1.59 — — + —

10300 10328.972 10337 103 А0А0А4В8Р0 — — + —

10379.787 10379 87 А0А0А6Х1_3 + — — —

10383.855 10383 278 А0А0АЗСНР9 — — — +

10384.233 10387 87 АОАОАЗВОбО — + + —

10400 10404.246 10404 94 Трансмембранный белок — — + —

10412.060 10412 95 Трансмембранный белок + — — —

10424.935 10429 92 Фактор сплайсинга пре-мРНК — — + —

15100 15135.580 15136 257 Трансмембранный белок — + — —

которые белки с близко расположенными пиками на схеме не разнесены.

Как оказалось в результате анализа масс-спектров по позициям групп пиков, соответствующих конкретным «точкам сравнения», часто имеются различающиеся положения в масс-листах (для краткости таблица сравнения не показана). Это связано с тем, что у одних штаммов определённые пики присутствуют в композиции масс-спектра, у других — отсутствуют. Так, пики, соответствующие «точкам сравнения» 2; 3,4; 6,1; 6,6; 6,9; 7; 7,1 kDa, имеются у всех изученных штаммов, а «точки сравнения» 2,1; 3; 3,3; 5,1; 6; 6,2; 6,4; 7,2; 8,7; 9,5; 10; 10,3; 10,4 kDa -только у масс-спектров отдельных штаммов. Так, например, точка 10,4 kDa прослеживается в масс-листах (масс-спектрах) штаммов С. albicans 325, РКПГ Y-463, Y-1059, 1112, 162 и 1103, а точка 7,2 kDa — только в масс-спектрах штаммов С. albicans РКПГ Y-463 и 1112. Данный феномен может быть обусловлен двумя обстоятельствами: (1) особенностями клеточной стенки культуры в конкретных условиях её получения, что влияет на результат про-боподготовки; (2) концентрациями конкретных метаболитов, образующих вариабельные пики. Оба этих обстоятельства могут иметь в основе как фено-типические, так и генотипические механизмы изменчивости. В аспекте практического применения обнаруженного феномена можно предположить, что при культивировании серии штаммов С. albicans в идентичных условиях и использовании данных MALDI-масс-спектров станет доступным внутривидовое типирование этого микромицета.

Для аннотирования MALDI-масс-спектров выбраны результаты съемки, проведенные с материалами штаммов С. albicans 159ser, 228, 325 и 329. Неидентичность масс-листов приводит к получению несколько различающихся аннотаций MALDI-масс-спектров, как это видно в таблице 1, правая часть. Большая часть пиков масс-спектра у С. albicans поддается аннотации, однако спектрообразующие пептиды и белки в значительном количестве еще не снабжены подробными описаниями. Следующие компоненты, образующие MALDI-масс-спектр, удалось идентифицировать.

Нуклеокапсидноподобный пептид, несущий домен типа «цинкового пальца», — пептид из 30 аминокислотных остатков; гомологичные ему последовательности имеются в структуре значительно более крупных белков микромицета Piromyces finnis и некоторых бактерий (Lacipirellula parvula, Lim-noglobus roseus, Fimbriiglobus ruber и других представителей семейства Planctomycetaceae). Эти белки являются ДНК-гликозилазами, связанными с репарацией ошибочно спаренных нуклеотидов.

Примечательно, что аналогичные высокоинтенсивные пики пептида, имеющего конфигурацию типа «цинкового пальца», обнаружены нами и при аннотировании MALDI-масс-спектра Aspergillus spp.

Металлотионеин Cuplp, связывающий ионы

Си 2 у С. albicans, гомологичен фрагменту металло-тионеина С. m al tos а.

Сериновая/треониновая протеинкиназа в

протеомах других микромицетов сходна немногим более 40% с белками неизвестной функции Scleroderma citrinum и Colletotrichum tanaceti.

Фрагмент белка, индуцируемого биопленкой, имеет отдаленные гомологи у так называемого беловатого трюфеля (Tuber borchii) и представителей рода Podospora. У P. comata более крупный гомолог обладает гликозид-гидролазной активностью. У С. albicans, исходя из функциональных особенностей, данный пептид образуется при деградации предшественника из 132 аминокислот, который, вероятно, участвует в ремоделировании клеточной стенки у делящихся и растущих клеток, а также при образовании истинных гиф и псевдогиф. Последний из указанных процессов необходим для образования биопленок у Candida spp. Интересно, что белок-предшественник имеет трансмембранный домен, теоретически он может быть таким образом связан с мигрирующими пузырьками — хитосомами, доставляющими на апекс растущей гифы или филамента мономеры для построения клеточной стенки, а также синтетические и гидролитические ферменты.

Субъединица долихил-дифосфоолигосахарид-протеин-гликозилтрансферазы. Данный фермент у С. albicans изучен, он участвует в посттрансляционной модификации некоторых белков. Фермент локализован в шероховатом (гранулярном) эндо-плазматическом ретикулюме. Процесс модификации путем N-гликозилирования здесь происходит одновременно с трансляцией: свободная новообразованная цепь белка по соответствующему положению гликозилируется, а часть последовательности еще только синтезируется на рибосоме. По данным Uni-Prot (для последовательности Q9P838 (OST4_CANAX)), фермент непосредственно катализирует перенос олигосахарида Glc3-Man9-GlNAc2 с липида долихол-пирофосфата (он служит временным носителем) на остаток аспарагина в белке, который расположен в «мотиве» Asn-X-Ser/Thr. Эта реакция происходит в каналообразующем трансло-коновом комплексе. Ранее подобный белок (их для краткости обозначают OST4) обнаружен нами среди спектрообразующих молекул у Pénicillium chryso-genum. Гомологи данного фермента имеются в протеомах многих дрожжей-аскомицетов рода Candida (С. tropicalis, С. viswanathii, С. maltosa, С. parapsilo-.v/.v-comlcx и других), Saccharomyces (S. eubayanus, S. cerevisiae) и Lachancea (f.. quebecensis, L. meyersii).

Субъединица 7a цитохром-С-оксидазы и фактор сборки цитохром-С-оксидазы - высоко консервативные белки, необходимые для осуществления клеточного дыхания, ранее были выявлены нами также в составе спектрообразующих молекул у Aspergillus spp.

Рибосомальные белки S30 (малой 40S субъединицы) и L29 (большой 60S субъединицы) — необходимые структурные элементы для процесса биосинтеза белка, также довольно консервативные. Они относятся к наиболее рано известным компонентам, образующим MALDI-масс-спектр у микроскопических грибов и бактерий.

Пептид, репрессируемый фактором транскрипции Нар43р. Функция его у С. albicans не определена. Среди грибов единственный известный гомолог найден у представителя семейства киксел-ловых Linderina pennispora, он имеет 2 трансмембранных домена.

Фрагмент фосфопантотеноилцистеин-

декарбоксилазы — один из ферментов системы биосинтеза коэнзима А, катализирует промежуточную реакцию, которая имеет следующий вид: (R)-4'-фосфопантотениол-Ь-цистеии <-» патентин-4'-фосфат +С02. У С. albicans детектируемый пептидный фрагмент этого фермента уникален (целая молекула имеет протяжённость более 700 аминокислот), не имеет гомологов у других микромицетов.

Фактор инвазивного роста филаментов и го-меостаза клеточной стенки — уникальный белок С. albicans. У других микромицетов (Byssothecium circinans, Cytospora leucostoma и Antrodiella citrinelld) имеются отдаленно гомологичные последовательности в составе более крупных белков. Примечательно, что один из гомологов у A. citrinella несет довольно крупный домен РН (домен гомологов плекстрина, англ. «Pleckstrin Homology»), специфичный для внутриклеточных белков, участвующих в «каскадах» передачи сигнала и регулирующих работу цитоскелета. В группу белков с РН-доменом относят очень разнообразных в функциональном отношении представителей, которые при функционировании могут взаимодействовать с самыми разнообразными субстратами: фосфорилированными остатками некоторых аминокислот в структуре белков (серином, треонином), фосфорилированными липидами, гетеродимерными G-белками, цитоплаз-матической мембраной. У В. circinans крупный белок-гомолог также обладает сигнальной функцией — несет характерный домен ГТФазы («Dynamin-type G»).

Гликофосфатидилинозитол-заякоренный белок — элемент, который участвует в прикреплении клеточной стенки к цитоплазматической мембране. Помимо структурной функции у Aspergillus fumiga-tus, белок такого типа считают фактором вирулентности. В данном случае обнаруженная у С. albicans последовательность специфична только для этого микромицета. У других микромицетов имеются лишь отдаленные гомологи, притом они в 10 и более раз крупнее по протяженности последовательности, чем обнаруженный белок С. albicans. Такие гомологи имеют иную функцию — они опосредуют слияние

мембранных органоидов — вакуолей, цистерн Голь-джи, различных транспортных пузырьков и др.; встречаются также среди гомологов ацетилтрансфе-разы аминокислот.

Митохондриальный ингибитор распада АТФ С. albicans присутствует в протеомах многих дрожжей-аскомицетов, например, представителей родов Candida, Scheffersomyces, Spathaspora, Diutina, Debaryomyces, Suhomyces и других). Этот белок из С. albicans имеет наибольшее сходство с такими же белками из С. dubliniensis, С. maltosa и С. viswanathü. Представители белков этой группы препятствуют распаду АТФ в митохондриях при нарушении протонного градиента, как это бывает, например, в условиях возникшей гипоксии. Большинство этих белков у Candida spp. не идентифицированы, но можно предположить, что они необходимы при существовании в условиях микроаэрофиль-ной атмосферы. Некоторые аминокислотные мотивы у найденного белка также близки к белкам митохон-дриальных рибосом типа S18 у Candida spp.

Таким образом, в результате прямого аннотирования MALDl-масс-спектров у штаммов С. albicans удается найти соответствие 75% - 96% пиков, что является довольно высоким показателем среди микромицетов. Аннотированию не поддаются в основном пики очень легких пептидов. Это связано с тем обстоятельством, что подобные продукты возникают в ходе ферментативной деградации белков и, используя данные референс-протеомов, их образование очень сложно спрогнозировать. При сопоставлении реального положения идентифицированных пептидов и белков с соответствующими им пиками, как это сделано на рисунке 1, оказалось, что проведенный анализ позволил определить состав большинства наиболее высокоинтенсивных комплексов пиков MALDI-масс-спектра, по которым, собственно, проводится видовая идентификация, а неиденти-фицированные полипептиды связаны преимущественно со множеством пиков более второстепенного значения.

Среди идентифицированных белков и пептидов имеются участники базовых метаболических путей, связанных с пластическими, энергетическими процессами, жизненно необходимыми для существования микромицета, поэтому их высокие концентрации и участие в формировании MALDI-масс-спектра не вызывают вопросов. С другой стороны, среди спектрообразующих молекул существуют и факторы вирулентности — фрагмент белка, индуцируемого биопленкой; фактор инвазивного роста филаментов и гомеостаза клеточной стенки; гликофосфатидили-нозитол-заякоренный белок. Возможность детекции таких метаболитов открывает нетривиальные диагностические возможности для MALDI-TOF-MS не только в аспекте быстрой идентификации, но и в плане определения вирулентности выделенного

штамма.

Особенности аминокислотного состава спектрообразующих полипептидов по расчетным данным представлены на рисунке 2. В соответствии с исходным предположением, распределение спектрообразующих полипептидов по массам в диапазоне детекции представляет собой не линейную зависимость, а описывается полиномиальным уравнением 15-ой степени (коэффициент детерминации R2=0,99; для краткости оно не приводится), при этом большинство выявленных полипептидов имеют Mr в диапазоне 6-8 kDa. График длин аминокислотных последовательностей спектрообразующих полипептидов и их частот напоминает нормальное распределение, средняя протяженность полипептидной цепи составляет 64,77±35,87 остатков (в формате M±s). Таким образом, правомерны суждения о «усредненном типичном спектрообразующем полипептиде».

Как видно из диаграммы на рисунке 2, наибольшего содержания в белках и пептидах, образующих N1А Ь ОI - м а с с - с п с к т р, достигают лейцин, изолейцин, лизин и серии. 40% состава спектрообразующих белков занято аминокислотами с неполярными (гидрофобными) радикалами, близка по содержанию к ним группа аминокислот с полярными незаряженными радикалами — 36,7%; сравнительно малой долей в структуре отличаются аминокислоты с ионо-генными радикалами — 15,8% (положительно заряженные) и 7,5% (отрицательно заряженные). Если ранжировать аминокислоты в составе спектрообразующих полипептидов по путям их синтеза, то оказывается, что семейство аспартата (оксалоацетата) занимает 29,3%, семейство пирувата — 25,9%, семейство глутамата (а-кетоглутарата) - 16,3%, семейство серина (3-фосфоглицерата) - 16,1%, условное семейство ароматических аминокислот — 12,4%.

Рис. 2 -ным.

Необычным является наличие в структуре ряда спектрообразующих полипептидов аминокислотных повторов. Так, например, в пептиде с Мг=4963 Da из 42 аминокислот имеется мотив Phe-Phe-Phe-Ile-Phe-Phe-Phe, а также повтор из 5-ти остатков ва-лина. Сериновая/треониновая протеинкиназа С. albicans также содержит «пентавалиновый» повтор, кроме того — фрагмент с тремя идущими подряд остатками лейцина. Тирозиновые повторы присут-

ствуют в структуре фактор сплайсинга пре-мРНК и неидентифицированного белка массой 7574 Е)а; в первом случае имеет место мотив |Тге|-Пс-|Тгс|4, а во втором — повтор из 12 остатков треонина. Последний из указанных легких белков также примечателен мотивом Ьеи-УаГЬеи-УаГЬеи-УаГЬеи-Уа1.

Лейциновые повторы из двух, трех и четырех остатков имеются в белке 6558 Оа, как и повтор из трех остатков серина. Тетрасериновые повторы при-

«Усредненный» аминокислотный состав типичного спектрообразующего полипептида С. albicans по расчетным дан-

Аргинин

Лизин

Гистидин Глутамат

Аспартат

Цистеин

Глутамин

Аспарагин

Тирозин

Лейцин

Изолейцин

Пролин

Метионин

Фенилаланин

Триптофан

Глицин

Алании

Треонин

Серин

сутствуют у белков массами 6190 и 6788 Da. Доли-хил-дифосфоолигосахарид-протеии-гликозилтрансфераза имеет необычный мотив Ile-Ile-Leu-lle-lle-lle и повтор из 3-х остатков серина.

Белок 7614 Da несет несколько коротких повторов из остатков тирозина, глутамина, пролина, глицина, серина и цистеина. Гексализиновый фрагмент, наряду с короткими повторами из апарагина и аргинина, входит в состав белка массой 7140 Da. Трансмембранный белок массой 8777 Da обладает повторами из двух и четырех остатков фенилаланина.

Наиболее примечательным по структуре оказался легкий белок массой 6146 Da: 84% его последовательности образовано остатками метионина, аспара-гина и лизина, только в N- и С-концах молекулы встречаются остатки изолейцина, тирозина, валина и треонина.

Своеобразие состава спектрообразующих белков и пептидов можно оценить, сравнивая условные рейтинги аминокислот в них с удельным содержанием аминокислот в белковой фракции целой дрожжевой клетки. Хотя протеом С. albicans изучен, нам не удалось обнаружить в литературе аминокислотный состав вегетативных клеток С. albicans. Однако доступными оказались данные об аминокислотном составе клеток (бластоспор) Saccharomyces cerevisiae [23] и хламидоспор С. albicans [Jansons V.K., Nicker-son W.J. Chemical composition of chlamydospores of Candida albicans. J. of Bacteriology. 1970; 104 (2): 922-932]. Как оказалось, лидирующей по содержанию аминокислотой в хламидоспорах С. albicans и бластоспорах S. cerevisiae оказался аспартат, тогда как в спектрообразующих белках и пептидах бластоспор С. albicans аспартат по встречаемости был только на седьмом месте, а лидирующие позиции заняли серин и лизин. В то же время лизин занимает 3-ю позицию в составе белков хламидоспор С. albicans, а серин — только 5-ю, в то же время у S. cerevisiae данные аминокислоты находятся, соответственно, на 5-ом и 8-ом месте. Сходные аминокислоты с гидрофобными радикалами — изолейцин и лейцин в нашем исследовании вошли в группу доминирующих типов остатков (8,6% и 7,9%), а в белках хламидоспор С. albicans и бластоспор S. cerevisiae это оказалось не так. Более того, у двух последних объектов эти аминокислоты в рейтинге рассредоточились на разные позиции, несмотря на то, что относятся по происхождению к одной метаболической ветви, а в данном исследовании в рейтинге они следуют одна за другой. В трех сравниваемых исследованиях цистеину соответствовала малая величина содержания. Примечательно, что наиболее редкой аминокислотой в белках S. cerevisiae явился треонин, в то же время в спектрообразующих полипептидах С. albicans он занимает 5-ое место.

Таким образом, белки и пептиды С. albicans, участвующие в образовании MALDI-масс-спектра,

отличаются своеобразным аминокислотным составом, выделяющим их фракцию среди протеома дрожжевой клетки, что подтверждает ранее выдвинутое положение об избирательности MALD1-ионизации кислотно-травленной биомассы клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное аннотирование MALDI-масс-спектров по ряду параметров осуществлено в более совершенном дизайне по сравнению с ранее выполненными работами. Во-первых, для аннотирования на предварительном этапе сделан сравнительный анализ композиции масс-листов нескольких штаммов, во-вторых, сами аннотации MALDI-масс-спектров получены также для нескольких штаммов, что дает более широкие возможности для суждения об индивидуальных штаммовых особенностях и изменчивости грибов этого вида. Третье принципиальное обстоятельство — включение в работу не только типовых коллекционных штаммов, но и материала первичных изолятов, полученных в первой генерации (высеве) непосредственно из биоматериала человека. Клетки в таких культурах потенциально могут сохранять процессы, ранее включенные непосредственно в организме больного и частично сохраненные за счет механизмов эпигенетического наследования. Полученные данные открывают определенные возможности для разработки новых подходов в лабораторной диагностике иивазивиого кан-дидоза и изучении практических важных свойств С. albicans.

Интенсивность пиков найденных спектрообразующих пептидов и белков является величиной, пропорциональной их концентрации в исследуемых клетках. Таким образом, становится доступным опосредованный сравнительный анализ штаммов С. albicans по экспрессии некоторых факторов, связанных с патогенезом ИК. В дальнейшем развитии данного направления открывается перспектива ориентировочной оценки вирулентности возбудителя ИК данного вида, полученного в культуре от больного, а также и штаммов, циркулирующих в стационаре. Отметим, что экзогенное инфицирование в случаях ИК в стационаре чаще наблюдают с С. parapsilosis и С. auris, однако вспышки, обусловленные С. albicans, также известны [24].

Кроме того, ряд обнаруженных спектрообразующих белков и пептидов высоко специфичны для С. albicans, поэтому на их основе принципиально возможно получать меченные антитела для разработки диагностических экспресс-тест-систем. К таким соединениям относятся: пептид, репрессируемый фактором транскрипции Нар43р; фактор пнвазивного роста филаментов и гомеостаза клеточной стенки; гликофосфатидилинозитол-заякоренный белок; фрагмент фосфопантотеноилцистеин-

декарбоксилазы. На этапе получения моноклональ-

ных антител против указанных соединений, следует заметить, что их аминокислотная последовательность невелика, поэтому для создания антигенного препарата с целью иммунизации лабораторного животного необходимо соединить данные полипептиды с высокомолекулярным носителем. На современном этапе в этой сфере применяют технологию множественных разветвленных пептидов (англ. MAPs, Multiple Antigenic Peptides) или используют дендри-мерное «ядро» [25, 26].

В дальнейшем представляет интерес определение функциональных свойств тех спектрообразую-щих белков и пептидов, которые еще не снабжены подробными характеристиками. Подобные данные необходимо дополнять полученными сведениями о низкомолекулярной фракции протеома С. albicans, участвующей в формировании MALDI-масс-спектра

культуры.

Благодарности. Коллектив авторов благодарит за предоставление штаммов С. albicans заведующую НИЛ Российская коллекция патогенных грибов Г.А. Чилину, а также сотрудников отделения лабораторной диагностики микологической клиники СЗГМУ O.A. Шурпицкую, Н.П. Ремневу, Г.В. Цветкову, В.М. Кашубу. Авторы глубоко признательны Дем-киной A.A. за помощь в получении предварительной аннотации масс-спектра С. albicans.

Работа выполнена в рамках Государственного задания Минздрава России «Разработка средств быстрой диагностики тяжелых грибковых инфек-ций и индикации генетических маркеров устойчивости возбудителей к противогрибковым лекарственным средствам» (2021- 2023 гг.).

ЛИТЕРАТУРА

1. Блинов Н.П., Васильева Н.В., Степанова A.A., Чилина Г.А. Candida. Кандидозы. Лабораторная диагностика. СПб: «Коста», 2010. 224 с. [Elinov N.P., Vasilyeva N.V., Stepanova A.A., Chilina G.A. Candida. Candidiasis. Laboratory diagnostics. SPb: «Kosta», 2010. 224 p. (In Russ)].

2. Vasilyeva N. V, Raush E.R., Rudneva M. V, et al. Etiology of invasive candidosis agents in Russia: a multicenter epidemiological survey. Frontiers of Medicine. 2018; 12 (1): 84-91. doi: 10.1007/sl 1684-017-0612-х.

3. Anaissie E.J., McGinnis M.R., Pfaller M.A. Clinical Mycology E-Book. Elsevier Inc., 2009: 700 pp.

4. Лунина C.C. Quinta essentia о кандидозной лейкоплакии. Методы науки. 2017; 5: 58-90. [Lunina S.S. Quinta essentia about candidal leukoplakia. Methods of Science. 2017; 5: 58-90 (In Russ)].

5. Оганесян Э.Г., Выборнова И.В., Ковыршин С.В. и др. Характеристика штаммов Candida auris, выделенных от пациентов с COVID-19, по чувствительности к противогрибковым лекарственным средствам. Проблемы медицинской микологии. 2021; 23 (2): 120. [Oganesyan E.G., Vybornova I.V., Kovyrchyn S.V., et al. Characterization of antifungal drug susceptibility of Candida auris isolates from COVID-19 patients. Problems in Medical Mycology. 2021; 23 (2): 120 (In Russ)].

6. Васильева H.В., Тараскина A.E., Богомолова Т.С. и др. Формирование резистентности к азолам клинического изолята Candida auris — возбудителя кандидемии. Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2020; 9 (2(33)): 70-76. [Vasilyeva N.V., Taraskina А.Е., Bogomolova T.S., et al. The development of resistance to azoles of the clinical isolates Candida auris - the causative agent of candidaemia. Infectious diseases: news, opinions, education. 2020; 9(2(33)): 70-76 (In Russ)].

7. Васильева H.B., Выборнова И.В., Payui Е.Р. и др. Определение чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза к флуконазолу с использованием дисков различных производителей. Проблемы медицинской микологии. 2016; 18 (2): 8-11. [Vasilyeva N.V. Vybornova I.V., Raush E.R., et al. Determination of susceptibility of invasive candidiasis causative agents to fluconazole with using of discs from different manufacturers. Problems in Medical Mycology. 2016; 18 (2): 8-11 (In Russ)].

8. Васильева H.B., Круглое A.H., Степанова A.A. и др. Цитологические особенности дрожжевых клеток мульти-резистентного патогена Candida auris. Проблемы медицинской микологии. 2018; 20 (3): 3-7. [Vasilyeva N.V, Kruglov A.N., Stepanova A.A., et al. Cytological features of yeast cells of multy-drug-resistant pathogen Candida auris. Problems in Medical Mycology. 2018; 20 (3): 3-7. (In Russ)].

9. Блинов Н.П., Васильева H.B., Степанова A.A., и др. Краткий атлас медицински значимых микромицетов рода Candida. СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2013. 76 с. [Elinov N.Р., Vasilyeva N.V, Stepanova N.V., et al. The brief atlas of medical important micromycetes from the genus Candida. SPb.: Publishing house of NWSMU n.a. I.I. Mechnikov, 2013. 76 p. (In Russ)].

10. Степанова A.A., Васильева H.B., Выборнова И.В. и др. Ультраструктура клеток штаммов Candida albicans и Candida parapsilosis, чувствительных и устойчивых к азолам. Проблемы медицинской микологии. 2018; 20 (3): 44-48. [Stepanova A.A., Vasilyeva N.V, Vybornova I.V., et al. Ultrastructure of cells of Candida albicans and Candida parapsilosis strains resistant and susceptible to azoles. Problems in Medical Mycology. 2018; 20 (3): 44-48 (In Russ)].

11. Payui E.P., Васильева H.B., Богомолова Т.С. Видовая идентификация Candida spp.: ДНК-секвенирование и MALDI-TOF масс-спектрометрия. Успехи медицинской микологии. 2015; 14: 276-278. [Raush E.R., Vasilyeva N. V, Bogomolova T.S. Species identification of Candida spp.: DNA-sequencing and MALDI-TOF-mass-spectrometry. Suc-

cesses in Medical Mycology. 2015; 14: 276-278 (In Russ)].

12. Payiu E.P., Васильева H.B., Шагдилеева E.B. Идентификация Candida spp. с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии. Проблемы медицинской микологии. 2013; 15 (2): 115. \ Raus h /LR., Vasilyeva N.V., Shagdileeva E.V. Identification of Candida spp. with using MALDI-TOF mass-spectrometry. Problems in Medical Mycology. 2013; 15 (2): 115 (In Russ)].

13. Шагдилеева E.B., Файзуллина P.P., Белова O.A., и др. Инвазивный кандндоз, обусловленный Candida albicans и Candida YIE-albicans, у новорожденных в Санкт-Петербурге. Проблемы медицинской микологии. 2020; 22 (3): 146. [Shagdileeva Е. V, Fayzullina R.R., Belova O.A., et al. Invasive candidiasis caused by Candida albicans and Candida non-albicans in neonates in Saint-Petersburg. Problems in Medical Mycology. 2020; 22 (3): 146 (In Russ)].

14. Диникина Ю.В., Шадривова О.В., Белогурова М.Б., и др. Инвазивный кандидоз на фоне антифунгальной профилактики у ребенка с саркомой Юинга: описание клинического случая и обзор литературы. Онкогематология. 2019; 14 (4): 59-66. \Dinikina Yu.V., Shadrivova O.V., Belogurova М.В., et al. Breakthrough invasive candidiasis in pediatric patient with Ewing's sarcoma: clinical case report and literature review. Oncohematology. 2019; 14 (4): 59-66 (In Russ)]. doi.org/10.17650/1818-8346-2019-14-4-59-66

15. Рябинин И.А., Чернец E.H., Ремнева Н.П. Аннотация MALDI-масс-спектра Salmonella sp. серогруппы 0:7 (Cl). Трансляционная медицина: от теории к практике: сборник научных трудов 8-й Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов. 16 апреля 2020 года. Под ред. A.B. Силина. СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2020. С. 180-185. [Ryabinin I.A., Chernets E.N., Remnyeva N.P. Annotation of MALDI-mass-specter of serogroup 0:7 (CI) Salmonella sp. Translational medicine: from theory to practice: the collection of scientific papers of the 8th Ail-Russian Scientific and Practical Conference of Young Scientists and Specialists. April 16, 2020. Ed. by A.V. Silin. St. Petersburg: Publishing house ofNWSMUn.a. I.I. Mechnikov, 2020. pp. 180-185 (In Russ)].

16. Riabinin I.A. Polypeptides from Aspergillus spp. forming mass-spectra during MALDI-TOF-mass-spectrometry. Wu Lien-Teh Forum. The 3rd China-Russian International Conference on Microbiology, Immunology and Related Diseases (CRICMID, 2016). September 1-6, 2016. Harbin, Beijing, 2016. pp. 36-38.

17. Рябинин И.А., Васильева H.В., Богданова T.B. Белки Pénicillium chrysogenum, выявляемые при MALDI-TOF-масс-спектрометрии клеточного экстракта. Микология и фитопатология. 2020; 54 (6): 436-445. [Ryabinin I.A., Vasilyeva N. V, Bogdanova T. V. Proteins of Pénicillium chrysogenum revealing under MALDI-TOF-mass-spectrometry of cellular extract. Mycology and phytopathology. 2020; 54 (6): 436-445 (In Russ)].

18. Лунина С.С., Рябинин И.А. Спектрообразующие полипептиды Candida glabrata. «Трансляционная медицина: от теории к практике»: Материалы 6-й научно-практической конференции молодых ученых специалистов. Под ред. д.м.н. A.B. Силина. СПб.: Изво-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2018. С. 27-28. [Lunina S.S., Ryabinin I.A. Spectra-forming polypeptides of Candida glabrata. «Translational medicine: from theory to practice»: Proceedings of the 6th scientific and practical conference of young scientists. Ed. by A.V. Silin, dr. med. sei. Saint-Petersburg: Publishing house of NWSMU n.a. I.I. Mechnikov, 2018. pp. 27-28 (In Russ)].

19. Дё.мкина A.A., Сальникова В.А., Рябинин И.А. Аннотация масс-спектра низкомолекулярной фракции протеома Candida albicans Berkhout. Проблемы медицинской микробиологии. 2017; 19 (2): 53. [Dyemkina A.A., Salnikova VA., Ryabinin I.A. Annotation of mass-specter of the low-molecular proteome fraction of Candida albicans Berkhout. Problems in Medical Mycology. 2017; 19 (2): 53 (In Russ)].

20. Vasilyeva N. V, Atsapkina A.A., Riabinin I.A., et al. Evaluation of modified MALDI-TOF-based approach to identification and typing of Cryptococcus neoformans clinical isolates. Mycoses. 2014: 57 (1): 70.

21.Рябинин И.А., Лобачева C.B. Обобщенная характеристика полипептидов Aspergillus spp., формирующих масс-спектр протеома при MALDI-TOF-масс-спектрометрии. Проблемы медицинской микологии. 2016; 18 (2): 110-111. [Ryabinin I.A., Lobacheva S.V. Generalized characterization of Aspergillus spp. polypeptides forming the proteome mass-spectrum in MALDI-TOF-mass-spectrometry. Problems in Medical Mycology. 2016; 18 (2): 110-111 (In Russ)].

22. Рябинин И.А. Масс-спектрометрия в видовой идентификации возбудителей бактериальных и грибковых инфекций. Электронный образовательный модуль. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2016. Режим доступа: http://www.rosmedlib.ru/book/lMECH-0006.html [Ryabinin I.A. Mass-spectrometry in species identification of causative agents of bacterial and fungal infections. Electronic educational module. Moscow: GEOTAR-Media, 2016. Mode of access: http://www.rosmedlib.ru/book/lMECH-0006.html (In Russ)].

23. Onofre S.B., Bertoldo I.C., Abatti I)., Refosco D. Chemical composition of the biomass of Saccharomyces cerevisiae - (Meyen ex E.C. Hansen, 1883) yeast obtained from the beer manufacturing process. International Journal of Environment, Agriculture and Biotechnology (IJEAB). 2017; 2 (2): 558-562. doi: 10.22161/ijeab/2.2.2

24. Ben Abdeljelil J., Saghrouni F., Khammari I., et al. Investigation of a cluster of Candida albicans invasive Candidiasis in a neonatal intensive care unit by pulsed-field gel electrophoresis. Scientific World Journal. 2012; 2012: 138989. https://www.hindawi.com/joumals/tswj/2012/138989/

25. Joshi V.G., Dighe V.D., Thakuria D., et al. Multiple antigenic peptide (MAP): a synthetic peptide dendrimer for diagnostic, antiviral and vaccine strategies for emerging and re-emerging viral diseases. Indian. J. Virol. 2013; 24 (3): 312-

320. doi: 10.1007/sl 3337-013-0162-z

26. Yu-Ji P., Hui Y., Ming Y., et al. Synthesis of peptide dendrimers with polyhedral oligomeric silsesquioxane cores via click chemistry. Chinese Chemical Letters. 2013; 24 (10): 917-920. doi.org/10.1016/j.cclet.2013.06.015

Поступила в редакцию журнала 22.03.2022 Рецензент: Т. С. Богомолова