CC BY
20УДК 582.282.123.4:544.173
выявление родственных связей у клинических изолятов aspergillus fumigatus fres. и
a. niger v. tiegh.
посредством анализа масс-спектров их протеомов
Рябинин И.А. (аспирант)*, Васильева Н.В. (директор института, зав. кафедрой), Богомолова Т.С. (зав. лаб.), Чилина Г.А. (зав. лаб.), Михайлова Ю.В. (н.с.)
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина и кафедра медицинской микробиологии, СевероЗападный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2014
В работе представлены результаты применения различных средств обработки масс-спектров протеомов у 21 штамма A. fumigatus и 19 штаммов A. niger, полученных путем MALDI-TOF-масс-спектрометрии. Благодаря их использованию удалось уточнить результаты идентификации изолятов и разделить их на внутривидовые группы. Для 4-х штаммов A. fumigatus, выделенных от одного пациента, но отличающихся по чувствительности к амфотерицину В, установлены возможные родственные связи.
Ключевые слова: Aspergillus, внутривидовое типирование, MALDI-TOF-масс-спектрометрия, протеом
detection of relationship among clinical isolates of aspergillus fumigatus fres. and a. niger v. tiegh. by analysis of mass-spectra of their proteomes
Ryabinin I.A. (postgraduate student), Vasilyeva N.V. (director of the Institute, head of the chair), Bogomolova T.S. (head of the laboratory), Chilina G.A. (head of the laboratory), Y.V. Mikhaylova (scientific collaborator)
Тут обычно пишут контактные данные
Kashkin Research Institute of Medical Mycology and Chair of Medical Microbiology, North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2014
This article presents the results of application of different tools for processing of proteomic mass-spectra produced by MALDI-TOF-mass-spectrometry among 21 strains of A. fumigatus and 19 strains of A. niger. Using these instruments, results of identification were refined and separation of isolates into intraspecific groups was made. Probable kinship was clarified for 4 strains of A. fumigatus that were isolated from a single patient, but differed in susceptibility to amphoterecin B.
Key words: Aspergillus, intraspecific typing, MALDI-TOF-mass-spectrometry, proteome
ВВЕДЕНИЕ
Изучение микромицетов - возбудителей госпитальных микозов требует внедрения не только быстрых и точных методов видовой идентификации, но и приемов внутривидового типирования штаммов. Несмотря на обилие у грибов доступных для изучения фенотипических характеристик, по ним сложно сопоставлять штаммы между собой, особенно в больших выборках. Не существует каких-либо унифицированных шкал для группировки изолятов по характеристикам колоний и микроморфологии. По этим параметрам возможно только установление вариантов, если они описаны для данного вида. Если сопоставление изолятов бактерий по профилю резистентности (к антибиотикам) доступно практически для любой лаборатории, то у грибов удается построить очень короткие профили (для 3-4 анти-микотиков). Кроме того, процедура определения чувствительности у грибов стандартизирована для сравнительно небольшого круга видов.
По этим причинам в медицинской микологии ведущее значение во внутривидовой дифференцировке приобретают генетические методы.
Возможности и опыт применения различных технологий генотипирования микромицетов отражены в обзоре Vanhee L.M.E., Nelis H.J., Coenye T. [1]. Авторы указывают, что генотипирование необходимо не только для эпидемиологических исследований, но и для отличия персистирующих штаммов и штаммов-контаминантов того же вида, выделенных от пациентов с хронической колонизацией их микромицетами.
Для генотипирования микромицетов описано много технологий. «Золотым стандартом» для типирования Aspergillus fumigatus считают анализ гипервариабельных минисателлитов (VNTR, variable number of short tandem repeat), для A. flavus Link и A. terreus Thom - случайную амплификацию полиморфной ДНК (RAPD, random amplified polymorphic DNA), для Cryptococcus spp. - MLST (мультилокусное сиквенс-типирование) [1]. Для возбудителей аспер-гиллеза также хорошие результаты дает анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (AFLP, amplified fragment length polymorphism) [2]. Многие авторы успешно применяли для генотипи-
■
рования изолятов Candida albicans Berkhout анализ полиморфизма микросателлитного локуса гена-фактора элонгации 3 [3]. Из этого краткого списка видно, что для организации работ по генотипированию необходимо создать межлабораторную кооперацию или использовать метод с «широким видовым покрытием», но в последнем случае результаты типи-рования для отдельных групп грибов будут не оптимальны.
В последнее десятилетие интенсивное развитие получила идентификация микромицетов с помощью матрично-активированной лазерной десорб-ционно-ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (англ. MALDI-TOF-MS) [4]. Сущность данного метода сводится к следующему: образец - материал чистой культуры микроорганизма или белковый экстракт из нее на твердой подложке (мишени) смешивают с раствором вещества (матрицы), чувствительного к лазерному излучению определенной длины волны. При высыхании смеси происходит образование кристаллов матрицы вокруг белковых масс. В масс-спектрометре под действием ультрафиолетового лазера в вакууме происходит ионизация молекул матрицы, а они опосредованно ионизируют молекулы белка. Такая непрямая ионизация защищает молекулы биополимеров от фрагментации. Ионы белков и матрицы разгоняются в сильном электромагнитном поле до детектора. Перед детектором ионы проходят так называемый «бесполевой промежуток», в котором происходит естественное замедление ионов в соответствии с их молекулярной массой. Благодаря интерпретации сигнала формируется масс-спектр комплекса белков, который сопоставляется с референтными спектрами из базы данных. По результатам этого сравнения проводят видовую идентификацию. Более подробно вопросы применения MALDI-TOF-MS в медицинской микологии рассмотрены в обзоре А.Г. Полищук
[5].
Помимо видовой идентификации, возможна математическая обработка полученных спектров с целью анализа их сходства. В частности, возможно построение дендрограмм масс-спектров (MSP-dendrogram), матриц коэффициента корреляции (CCI-matrix), проведение анализа главных компонент масс-спектра (PCA, principal component analysis) в форме построения кластера (PCA-clustering) и дендрограмм (PCA-dendrogram) [6]. Данные инструменты анализа MALDI-масс-спектров неоднократно применяли для сравнения штаммов в медицинской бактериологии. Построение иерархического PCA-кластера в комбинации с технологией «MALDI-imaging» также было применено некоторыми исследователями для отличия материала злокачественных новообразований от здоровых тканей по особенностям протеома [7]. В 2012 г. два коллектива исследователей сообщили о возможности применения MALDI-TOF-масс-спектрометрии протеома с построением MSP-дендрограммы для разделения изо-
лятов Cryptococcus neoformans Vuill. и C. gattii Kwong-Chung & Boekhout различных молекулярных типов, первоначально определенных генетическими методами [8, 9]. de Carolis E. с соавторами применили построение иерархического PCA-кластера для оценки вариабельности масс-спектра протеома среди референтных штаммов Aspergillus spp. и ряда других ми-целиальных грибов, но не для типирования штаммов [10]. Не анализировали также возможность самостоятельного применения MALDI-TOF-MS протеома как метода типирования грибов без генетического сопровождения.
Цель данной работы - изучить возможность применения различных форм анализа масс-спектров протеома гиф A. fumigatus и A. niger для выявления филогенетических связей штаммов и их группировки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы. В работе использовали штаммы A. fumigatus (21 штамм) и A. niger (19 штаммов) из Российской коллекции патогенных грибов, а также клинические изоляты, выделенные в НИЛ микологического мониторинга и биологии грибов в 2012-2013 гг. Большинство штаммов выделено из респираторных субстратов (мокрота, бронхоальвеолярный лаваж). Далее на рисунках и в тексте для обозначения оригинальных штаммов использовали буквенные обозначения: первая буква - от фамилии пациента, через дефис - наименование биосубстрата (М - мокрота, БАЛ - бронхоальвеолярный лаваж, ПЖБ - промывная жидкость бронхов, УХО - из наружного слухового прохода). В качестве контроля идентификации применяли штаммы из РКПГ (Российской коллекции патогенных грибов), предварительно идентифицированные с помощью ДНК-сиквенирования (Genetic Analyzer 3500, Applied Biosystems, США; в скобках указан локус): A. fumigatus РКПГ F-1327 (ß-тубулин), F-1248 (ITS - internal transcribed spacer), F-1437 (ITS, ß-тубулин), F-1384 (ITS, ß-тубулин), F-1279 (iTS, ß-тубулин); A. niger РКПГ F-1329 (ß-тубулин), F-1345 (ITS, ß-тубулин), F-1448 (ß-тубулин), F-1249 (D1/D2 - домены гена рибосомальной 26S РНК, ß-тубулин).
Пробоподготовка. Штаммы рекультивировали на картофельно-глюкозном агаре 10 суток при 28 °С. Споровую массу из верхней спороносящей части колонии в объеме бактериологической петли № 2 пересевали в 0,5 мл жидкой среды Сабуро с 2% глюкозы, разлитой в пробирки Эппендорф, и культивировали 1 сутки при 37 °С. Образовавшиеся микроколонии отмывали от питательной среды, затем проводили экстракцию щелочных белков этанолом, муравьиной кислотой и ацетонитрилом по стандартному протоколу [6]. Белковый экстракт наносили по 1 мкл на 2 точки мишени для MALDI-TOF-масс-спектрометрии и после высыхания покрывали 1 мкл стандартного раствора матрицы (насыщенный при комнатной температуре раствор а-циано-3-гидроксициннамовой кислоты в смеси деионизованной воды, ацетонитри-
ла и трифторуксусной кислоты).
MALDI-TOF-масс-спектрометрию проводили на масс-спектрометре Autoflex speed TOF/TOF (Bruker Daltonics, Германия) в линейном режиме с детекцией положительно заряженных ионов массой от 2000 до 20000 дальтон и отсечением сигнала от ионов матрицы. Сбор масс-спектра с образца выполняли в автоматическом и ручном режимах.
Обработка масс-спектров. Идентификацию полученных спектров путем сравнения с референтной базой провели с использованием пакета программ MALDI Biotyper 3.1 (Bruker Daltonics). В идентификации в качестве референтной базы видоспецифичных масс-спектров использовали обновление для MALDI Biotyper по мицелиальным грибам «Fungi Library», выпущенное в 2012 г. Для дальнейшего анализа выбирали из двух тот масс-спектр, коэффициент достоверности идентификации для которого был наибольшим. Построение диаграмм сравнения спектров (MSP-dendrogram, CCI-matrix, PCA-clustering, PCA-dendrogram, псевдогели) осуществляли с помощью MALDI Biotyper OC [6]. MSP-дендрограммы строили по объединенным выборкам масс-спектров, полученных из авторских штаммов и референтных коллекционных штаммов, на основе которых была создана база для идентификации. В построении кластеров анализа главных компонентов масс-спектров нами применен иерархический метод 5-ой степени [11]. Дополнительную обработку диаграмм для подготовки к печати выполняли в XnView 2.04 и GIMP 2.8.6.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Видовая идентификация штаммов Aspergillus spp. c помощью MALDI-TOF-MS. Изоляты A. fumigatus идентифицировали с коэффициентом достоверности 1,833-2,234 в автоматическом режиме, а изоляты A. niger таким способом не удалось надежно идентифицировать, поскольку были получены низкие коэффициенты достоверности. При сборе масс-спектров в ручном режиме изоляты этого вида идентифицировали с коэффициентами в диапазоне 1,726-2,071 (кроме одного штамма - 1,684). Согласно критериям производителя оборудования (Bruker Daltonics), из 21 штамма A. fumigatus 4 определены по полученным значениям только до уровня рода (идентификация до уровня вида - 81%), у A. niger -8 из 19 (идентификация до уровня вида -58%). Для штаммов, идентифицированных методом ДНК-сиквенирования, коэффициент достоверности составил для A. fumigatus РКПГ F-1248 - 2,257; F-1327 - 2,257; F-1437 - 2,105; F-1384 - 2,304; F-1279 - 2,048 (во всех случаях уверенная видовая идентификация); для A. niger РКПГ F-1345 - 1,726; F-1329 - 1,830; F-1448 - 1,807; F-1249 - 2,002 (у первых трех штаммов достоверно только до уровня рода, у F-1249 - до уровня вида). Отметим, что коэффициент достоверности отображает схожесть масс-спектра идентифицируемого штамма со спектром одного из штаммов
референтной базы, он зависит от объема базы и вариабельности протеома у данного вида.
Сравнительный анализ белковых масс-спектров штаммов Aspergillus spp. Различные способы сравнения масс-спектров протеома изолятов Aspergillus spp. приведены на рисунках 1 и 2. Простейшим видом отображения масс-спектров для сравнения является построение «псевдогелей» (см. Рис. 1 D, для удобства размещения штаммы обозначены цифрами). «Псевдогель» - это перевод двумерного спектра в одномерную полосу, где высота пика (количество ионов с данным значением m/z) соответствует интенсивности окраски, а положение пиков по горизонтали (m/z) остается неизменным. Получающаяся картина напоминает результат одномерного электрофореза белков в полиакриламидном геле, отчего это тип диаграмм получил свое название. При рассмотрении псевдогелей легко определить границу выборок штаммов A. niger и A. fumigatus, но анализировать особенности отдельных спектров при этом неудобно.
MSP-дендрограмма (MSP от англ. mass-specter) - это представление полученных масс-спектров в виде иерархической структуры, в которой положение отдельного спектра определяют величиной отклонения характеристик его пиков от средних значений этих характеристик в группе спектров, стоящих выше в иерархическом положении. На рисунке 1A представлена общая MSP-дендрограмма грибов рода Aspergillus, полученная из спектров 113 штаммов аспергиллов, из которых 40 - штаммы авторов.
Увеличенные участки MSP-дендрограммы с масс-спектрами штаммов A. niger и A. fumigatus показаны на рисунках 1В и 1С соответственно. Изоляты авторов подписаны жирным шрифтом, штаммы Российской коллекции патогенных грибов имеют обозначение «РКПГ», другие штаммы - кодовую аббревиатуру источника выделения; сиквенированные штаммы помечены знаком *. Выборки авторов и штаммы, лежащие в основе референтной базы, представлены по каждому виду двумя отдельными родственными группами. Отсутствие «перемешивания» этих двух категорий штаммов, по нашему мнению, связано с применением в данной работе модифицированной методики субкультивирования аспергиллов перед экстракцией белка (в классической методике мице-лиальные грибы подращивают в бульоне Сабуро на специальном ротаторе для получения дисперсной культуры). Судя по значению показателя различия, эти особенности культивирования сильнее сказываются для изолятов A. niger: разветвление групп происходит при значении показателя около 500 (у A. fumigatus «150). Вследствие этого феномена MSP-дендрограмма не может быть использована в данной работе для разработки внутривидового типирова-ния, но при этом удалось увидеть, что штаммы из наших выборок, идентифицированные с разным коэффициентам достоверности, принадлежат к одним и тем же видам.
Рис. 1. MSP-дендрограмма масс-спектров штаммов Aspergillus spp., заимствованных из расширенной базы данных для MALDI Biotyper и полученных авторами. A - общий вид, В - увеличенный фрагмент для штаммов A. niger; С - увеличенный фрагмент для штаммов A. fumigatus. Знаком * отмечены штаммы, идентифицированные методом ДНК-сиквенирования. Для удобства размещения масштаб оси показателя сходства искажен. D - масс-спектры штаммов Aspergillus spp., использованных в работе авторов, в виде «псевдогелей»
Рис. 2. Различные формы сопоставления масс-спектров протеома штаммов A. fumigatus и A. niger, группировка штаммов по масс-спектрам. 1 - PCA-дендрограмма штаммов A. fumigatus; 2 - PCA-дендрограмма штаммов A. niger; 3 - PCA-кластер штаммов A. niger; 4 - РСА-кластер штаммов A. fumigatus; 5 - CCI-матрица штаммов A. fumigatus; 6 - CCI-матрица штаммов A. niger
Матрица коэффициента корреляции (matrix of compose correlation index, CCI-matrix, см. Рис. 2.5 и 2.6) - диаграмма, отражающая попарное сравнение масс-спектров протеома через расчет коэффициента корреляции (Пирсона). Полученные значения коэффициента корреляции отображены в цветовой гамме шкалы тепловизора. Ячейка матрицы, отражающая пару близких по масс-спектру протеома штаммов, окрашивается в «теплой», желто-оранжево-красной гамме. Диагональ матрицы окрашивается в ярко-красный цвет, поскольку там каждый масс-спектр сравнивается с самим собой. Соответственно, пары неродственных штаммов окрашиваются в «холодной» зелено-синей гамме. Так, например, на матрице для штаммов A. fumigatus (Рис. 2.5) видно, что штамм «М» не родственен всем прочим штаммам выборки, как и штамм A. niger П-ПЖБ среди других штаммов этого вида, а штамм A. fumigatus Ш-AmB-R (Амфоте-рицин В-резистентный) по спектру протеома близок штамму Н-БАЛ.
В качестве метода создания классификаций масс-спектров важнейшим инструментом является анализ главных компонентов (англ. principal component analysis, PCA). Данный метод анализа выборок универсален, его чаще применяют для введения классификаций в выборках, где каждую единицу наблюдения описывают большим перечнем параметров. Принцип данного метода анализа заключается в том, что из перечня характеристик единицы наблюдения (в данном случае - масс-спектра протеома, представленного в числовом формате [масс-лист]) выбирают наиболее вариабельные величины (в иных случаях -наиболее значимые с точки зрения исследователя), значения которых откладывают по осям трехмерной системы координат и на пересечении перпендикуляров из этих осей ставят точку. Таким образом, выборка представляется в виде совокупности точек в пространстве (PCA-кластер). С помощью программного обеспечения можно рассматривать трехмерный PCA-кластер, поворачивая его. Близкое расположение точек в кластере соответствует сходству свойств протеома изолятов в выборке; это обстоятельство лежит в основе их группировки (при построении кластера в Biotyper OC точки маркируются цветом автоматически). Для удобства работы трехмерный PCA-кластер может быть трансформирован в двумерную РСА-дендрограмму (см. Рис. 2.1; 2.2; 2.3 и 2.4).
На РСА-дендрограмме в качестве критерия разделения выборки на группы нами выбрано значение показателя различия около 0,8; что согласуется с результатами цветового маркирования изолятов в РСА-кластере.
При совместном анализе РСА-кластеров и РСА-дендрограмм выборки штаммов A. fumigatus и A. niger были разделены на 5 групп каждая, соответственно, А1, А2, В1, В2, С и А, В, С1, С2, В. Группам присваивали численные символы в том случае, если на РСА кластере они маркировались одним цветом,
но на РСА-дендрограмме срабатывал критерий разделения. Результаты группировки штаммов по MSP-дендрограмме и РСА-кластеру не совпадают, но в последнем случае разделение штаммов происходит более четко.
Среди авторской выборки штаммов A. fumigatus следует обратить внимание на 4 изолята, обозначенные на рисунках как A. fumigatus Ш4-БАЛ, Ш-II-БАЛ, Ш-Ш-БАЛ и Ш-AmB-R. Данные изоляты были выделены в течение 2012 г. из бронхоальвеолярного лаважа от одного пациента с инвазивным аспергил-лезом легких. Штаммы Ш4-БАЛ и Ш-AmB-R выделены при первом микологическом исследовании одного образца БАЛ. Штамм Ш-AmB-R отличался от 3-х остальных резистентностью к амфотерицину В (МИК100=4 мкг/мл [R] по протоколу CLSI M38-A2
[12], для других штаммов - 1 мкг/мл [S, чувствительные]). Он также обладал контрастно отличающимися от остальных штаммов характеристиками колоний: на среде Сабуро с 2% глюкозы колонии белые со спо-роношением только в центральной части; на сусло-агаре спороношение обильное, но рост довольно медленный. В попытке отличить изолят Ш-AmB-R от «криптических видов» аспергиллов секции Fumigati была проведена рекультивация штаммов Ш-AmB-R и Ш4-БАЛ на сусло-агаре при 10° и 50 °С, но заметных отличий в росте за 5 суток выявить не удалось
[13]. Все штаммы данной группы обладали МИК80 к итраконазолу 0,125 мкг/мл (CLSI M38-A2) и образовывали водорастворимый чернильный пигмент при хранении на картофельно-морковный агаре. Штамм A. fumigatus Ш-AmB-R был идентифицирован путем ДНК-сиквенирования по локусу р-тубулина как A. fumigatus.
По MSP-дендрограмме видно, что чувствительные к амфотерицину В штаммы Ш4-БАЛ, Ш-П-БАЛ, Ш-Ш-БАЛ - близкородственные, а штамм Ш-AmB-R принадлежит к другой группе изолятов. Напротив, анализом главных компонентов масс-спектров показано, что изоляты A. fumigatus Ш-AmB-R и Ш-I-БАЛ близки (принадлежат к группе В1), а родство со штаммами Ш-П-БАЛ и Ш-Ш-БАЛ более дальнее (два последних входят в группу В2). Эти же выводы можно сделать при рассмотрении СО-матрицы штаммов A. fumigatus. Мы предполагаем, что штаммы A. fumigatus Ш4-БАЛ и Ш-AmB-R происходят от общего предкового штамма, тогда как штаммы Ш-П-БАЛ и Ш-Ш-БАЛ являются более поздними потомками штамма A. fumigatus Ш-ЬБАЛ.
выводы
1. Методы сравнительного анализа масс-спектров протеома являются не только возможным подходом для внутривидового типирования Aspergillus spp., но и уточнением видовой принадлежности штаммов, идентифицированных методом MALDI-TOF-MS c низким коэффициентом достоверности.
2. Совокупности масс-спектров в виде «псевдогелей» отображают выборки штаммов различных
видов; матрица коэффициента корреляции (СС1-matrix) удобна для сравнения отдельных пар или групп штаммов, выделенных из одного источника (от одного пациента).
3. MSP-дендрограмма отражает реальные родственные связи изолятов не только на уровне видов, но и на уровне секций рода Aspergillus. Группировать штаммы внутри вида с помощью этого метода, особенно в небольших выборках, не вполне удобно.
4. Различия в масс-спектрах протеома среди штаммов одного вида могут быть обусловлены не только их индивидуальными характеристиками, но и адаптивными изменениями при различных условиях культивирования.
5. Наиболее удобным для обработки методом группировки штаммов является иерархический анализ главных компонентов масс-спектра с построением РСА-кластера и РСА-дендрограммы.
В дальнейшем представляет интерес определение связи фенотипических признаков с группиров-
кой штаммов на MSP-дендрограмме, РСА-кластере, РСА-дендрограмме.
При разработке методов внутривидового типиро-вания грибов рода Aspergillus необходимо выяснить связь между протеомными группами, определяемыми по MALDI-TOF-масс-спектрометрии, и результатами генетических методов типирования (VNTR, RAPD, AFPL).
В дальнейшем данный подход к исследованию родственных связей штаммов с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии можно будет применить в эпидемиологических исследованиях, связанных, прежде всего, с изучением вспышек госпитальных микозов.
Авторы работы благодарят ведущего научного сотрудника НИЛ молекулярно-генетической микробиологии С.М. Игнатьеву за помощь в проведении исследования.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Vanhee L.M.E., Nelis H.J., Coenye T. What can be learned from genotyping of fungi? // Medical Mycology. - 2010. - № 48, Suppl.1. - P. 60-69.
2. Montiel D., et al. Genetic differentiation of the Aspergillus section Flavi complex using AFLP fingerprints // Mycol. Res. -2003. - № 107, Pt. 12. - Р. 1427-1434.
3. Dalle F., et al. Comparative genotyping of Candida albicans bloodstream and nonbloodstream isolates at a polymorphic microsatellite locus // J. Clin. Microbiol. - 2000. - Vol. 32, №12. - P. 4554-4559.
4. Блинов Н.П. Основные итоги Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микологии (XIV Кашкинские чтения) в июне 2011 г. // Проблемы медицинской микологии. - 2011. - Т. 13, №3. - С. 57-61.
5. Полищук А.Г. MALDI-TOF масс-спектрометрическая идентификация медицински значимых микромицетов (обзор) // Проблемы медицинской микологии. - 2011. - Т. 13, №4. - С. 8-11.
6. MALDIBiotyper 3.1 User Manual. Revision 1. - Germany, Bruker Daltonics, 2012. - 212 p.
7. Deninger S.O., et al. MALDI imaging combined with hierarchical clustering as a new tool for the interpretation of complex human cancers // J. Proteome Res. - 2008. - Vol. 7, №12. - P. 5230-5236.
8. Posteraro B., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization - time of flight mass spectrometry - based method for discrimination between molecular types of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii // J. Clin. Microbiol. - 2012.
- Vol. 50, №7. - P. 2472-2476.
9. Fircative C., Trilles L., Meyer W. MALDI-TOF MS enables the rapid identification of the major molecular types within the Cryptococcus neoformans/C. gatii species complex // PloS ONE. - 2012. - №7(5): e37566. doi:10.1371/journal. pone.0037566.
10. De Carolis E., et al. Species identification of Aspergillus, Fusarium and Mucorales with direct surface analysis by matrixassisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry //Clin. Microbiol. and Infect. - 2012. - Vol. 18, №5.
- P. 475-484.
11. Hierarchical clusterimg basics. - Bruker Daltonics, Germany: http://research.med.helsinki.fi/
12. corefacilities/proteinchem/hierarchical_clustering_basics.pdf
13. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi. M38-A1. — CLSI, USA, 2008.
14. Samson R.A., Hong S., Peterson S.W., et al. Polyphasic taxonomy of Aspergillus section Fumigati and its teleomorph Neosartorya// Studies in Mycology. - 2007. - № 59. - P. 147-203.
Поступила в редакцию журнала 24.02.2014 Рецензент: Н.П. Блинов
