CC BY
12
WW
УДК 617.55-007.43
Л.В. Максяткина, Н.Т. Абатов, Л.Л. Ахмалтдинова, Р. М. Бадыров, А.Ш. Ирисметов, Е.Б. Болекбаев
Некоммерческое акционерное общество «Медицинский Университет Караганды»
АНАЛИЗ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ У КРЫС ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗОВАННОЙ КСЕННОГЕННОЙ БРЮШИНЫ
Биологические импланты, используемые для пластики дефектов передней брюшной стенки, могут содержать в себе компоненты, которые в последующем могут вызывать выраженную реакцию иммунной системы организма, выступая в роли антигена. Специфические для отторжения антигены связываются с антителами крови реципиента, образуя циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК). Цель исследования: Изучение иммуногенности децеллюляризованного матрикса ксеногенной брюшины на моделе дефекта передней брюшной стенки у крыс, посредством определения уровня ЦИК в сыворотке крови. Эксперимент проводился на 54 белых нелинейных половозрелых крысах. В качестве материала сравнения выступал свиной ацеллюлярный дермальный коллаген «Permacol» (Covidien, USA). Животные были распределены по 24 особей в 2 группах, в 6 подгруппах случайным образом. Контрольная группа включала в себя 6 особей. Периоды наблюдения: 7 сутки, 21 сутки, 30 сутки и 90 сутки. Полученные результаты показали: децеллюляризованная ксенобрюшина не вызывает специфической иммунной реакции отторжения, но и вызывает меньший воспалительный ответ.
Ключевые слова: внеклеточныйматрикс, циркулирующие иммунные комплексы, биоимплант, трансплантация, Permacol.
Введение.
С развитием расширенных оперативных вмешательств в лечении широкого спектра заболеваний, приводящих к образованию дефектов передней брюшной стенки, мы все чаще сталкиваемся с проблемой длительно незаживающих послеоперационных ран. Проблема заключается в недостаточной состоятельности собственных тканей организма перекрыть обширный дефект брюшной стенки первичным натяжением. Решением этой проблемы может стать применение импланта для замещения дефекта. История использования имплантов в восстановительной хирургии брюшной полости начинается не один десяток лет назад. На сегодняшний день используется широкий спектр видов имплантов с различными свойствами [1, 2, 3]. Синтетические материалы устойчивы к разрыву, но нередко вызывают такие осложнения как: реакция отторжения инородного тела с образованием инфильтратов и сером, инфицирование послеоперационных ран с последующей инкапсуляцией и некрозом импланта. Биологические импланты благодаря природной структуре позволяют минимизировать процент послеоперационных осложнений, не снижая функциональность передней брюшной стенки, но не исключают полностью реакцию отторжения реципиента [4]. Таким образом, актуальным становится поиск нового прочного, устойчивого к инфекциям и не вызывающего реакции отторжения материала для укрепления дефектов передней брюшной стенки.
Тканевая инженерия позволяет использование рецеллюляризованных биологических каркасов тканей и органов, полученных путем децеллюляризации от разных видов млекопитающих [5,6,7]. Хирургическая имплантация биоматериала в организм запускает воспалительную реакцию реципиента с соответствующим заживлением поврежденной ткани. Биологические материалы обычно состоят из множества компонентов, каждый из которых может воздействовать на ткань и вызывать выраженную реакцию иммунной системы организма, выступая в роли антигена. Эта реакция может быть настолько выражена, что в конечном итоге может привести не только к повреждению тканей и выходу биоимпланта из строя, но и к гибели организма [8]. Наиболее распространённой формой реакции иммунной системы организма является острое клеточное отторжение, связанное с Т-клетками. Существуют данные, что специфические для отторжения антигены связываются с антителами в крови реципиента, образуя ЦИК, изучение присутствия которых в сыворотке реципиентов, испытывающих отторжение, может быть полезным в качестве диагностических биомаркеров для реакции острого трансплантационного отторжения [9, 10]. Коллективом исследователей Медицинского Университета г. Караганды был разработан новый биологический имплант для пластики дефектов передней брюшной стенки на основе внеклеточного матрикса ксенобрюшины
крупного рогатого скота, полученный путем децеллюляризации детергент- ферментативным методом. В рамках эксперимента было установлено, что внеклеточный матрикс ксенобрюшины демонстрирует высокие показатели механической прочности за счет эластичности [5], что позволяет продолжить исследование по изучению биологического ответа организма и межклеточного взаимодействия тканей.
Цель исследования: Изучение иммуногенности децеллюляризованного матрикса ксеногенной брюшины на моделе дефекта передней брюшной стенки у крыс, посредством определения уровня ЦИК в сыворотке крови. Материалы и методы.
Объектом сравнительного экспериментального
исследования является внеклеточный матрикс децеллюляризованной ксеногенной брюшины крупного рогатого скота. Эксперимент проводился на 54 белых нелинейных половозрелых крысах обоего пола, массой 180 -220 г. В качестве материала сравнения выступал свиной ацеллюлярный дермальный коллаген «Permacol» (Covidien, USA), сходный по свойствам биологический имплантат, уже применяющийся в клинической практике для пластики дефектов передней брюшной стенки [12]. Животные были распределены по 6 особей в 2 группах, в 6 подгруппах случайным образом. Контрольная группа содержала в себе 6 особей без операционного вмешательства. Каждая группа соответствовала применяемому биоимпланту, каждая подгруппа - сроку наблюдения и выведения животного из эксперимента. Периоды наблюдения: 7 сутки, 21 сутки, 30 сутки и 90 сутки.
В ходе эксперимента у крыс формировался дефект передней брюшной стенки размером 15мм х 15мм. Не натяжная пластика дефекта передней брюшной стенки производилась по собственно разработанному методу коллективом хирургов Медицинского Университета г. Караганды с применением соответствующего группе биоимпланта [13]. Забор материала для исследования производился после прекращения жизнедеятельности животного, путём внутрисердечной пункции с последующей декапитацией, согласно срокам эксперимента. Для этого, после легкого эфирного наркоза, крысу фиксировали к операционному столику, острым путем производили торакотомию, визуализировали верхушку сердца, после чего, параллельно плоскости грудной клетки, вводили иглу в проекцию левого желудочка, одновременно потягивая поршень на себя. Определение уровня ЦИК осуществлялось методом преципитации из сыворотки крови комплексов антиген-антитело в растворе полиэтиленгликоль-6000 (ПЭГ-6000) (AppliChem, Germany), приготовленном с использованием 0,1М боратного буфера (pH 8,4), с последующим фотометрическим определением оптической плотности преципитата [14]. Для определения высокомолекулярных (ВМ) ЦИК использовался 3,5% раствор ПЭГ-6000, для
среднемолекулярных (СМ) ЦИК - 5% раствор ПЭГ-6000, для низкомолекулярных (СМ) ЦИК применялся 7% раствор ПЭГ-6000. Порция крови без добавления антикоагулянта подвергалась отстаиванию в течение 40 мин, после чего, центрифугировалась на центрифуге ELMI СМ70М.07 два часа при 1500 об/мин ^ +37С). Полученные образцы сывороток подвергались разведению в 3 раза боратным буфером (рН 8,4). После этого, в 3 опытные пробирки (соответственно концентрации 3,5%, 5%, 7%) вносили по 1,8 мл раствора ПЭГ-6000, в контрольную пробирку - 1,8 мл боратного буфера. Затем, разведенные образцы сыворотки (0,2 мл) добавляли в пробирки с растворами ПЭГ-6000 и инкубировали в течение 120 мин при комнатной температуре. Определение оптической плотности преципитата производилось при длине волны 450нм. Высчитывалась разность показателей оптической плотности преципитата между контрольной и опытными пробами, результат умножали на 1000 с получением условных единиц содержания ЦИК в 1,0 мл сыворотки. Статистическая обработка данных
Вестник К03НМУ № I - 2020
Для всех количественных данных вычисляли групповое среднее арифметическое (X), среднеквадратичное отклонение (SD). Достоверность различий между исследуемыми группами определена статистическими методами с помощью непараметрическим критериев: критерий Mann-Whitney для сравнения независимых групп («опыт-контроль»), для оценки различий между долями в группах использовался критерий Х2. Достоверность внутригрупповых различий определена статистическим методом с помощью непараметрическим критериев: критерий Kruskal-Wallis для сравнения независимых групп. Для расчетов использовалось программное обеспечение «Statistica 8.0» и табличный процессор Excel из пакета Microsoft Office 2012. Результаты.
Результаты определения групповых средних арифметических значений ЦИК в сыворотке крови экспериментальных животных после имплантации внеклеточного матрикса ксенобрюшины и ацеллюлярного дермального коллагена «Permacol» представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Групповые средние арифметические значения ЦИК в сыворотке крови экспериментальных животных исследуемых групп_
группа срок ВМ ЦИК, усл.ед СМ ЦИК, усл.ед НМ ЦИК, усл.ед
контроль - 6,0±1,9 5,6±3,0 3,0±2,2
Permacol 7дней 31,87±7,2# 4,37±5,06 12,25±6,3#
21 дней 71,54±20,1# 80,8±22,6# 113,2±33,2#
30 дней 82,3±17,3# 69,25±18,5# 80,62±13,0#
90 дней 5,55±0,89 10,2±0,82# 7,1±1,04
Ксенобрюшина 7дней 11,77±7,6* 3,5±1,75 4,6±2,6*
14 дней 10,875±4,87* 20,5±6,75*# 40,0±20,40*#
21 дней 21,5±12,5*# 39,5±11,5*# 76,5±8.5*#
30 дней 43,5±10,25*# 24,73±7,3*# 55,3±17,78*#
90 дней 6,75±0,7 10,4±0,8# 6,5±0,98
Примечания - Достоверные различия (p level<0,05): *- c группой сравнения # - с контролем
Как видно из таблицы 1, в группе сравнения, где применялся ацеллюлярный дермальный коллаген «Регтасо1», через 7 дней после операции отмечается умеренное повышение содержания ЦИК в сравнении с контрольными показателями, в большей степени за счет высокомолекулярной фракции (31,87±7,2 усл.ед., р<0,05). Максимальные значения ЦИК в сыворотке крови были зафиксированы к 21 дню в двух из трех фракций, с преобладанием низкомолекулярных ЦИК (113,2±33,2, р<0,05), и только на 30 день отмечается снижение содержания средне- и низкомолекулярных фракций, в общей сложности превысив 10-кратное увеличение от контрольной величины (69,25±18,5 и 80,62±13,0 против 5,6±3,0 и 3,0±2,2 соответственно, р<0,05). В группе с внеклеточным матриксом ксенобрюшины подъем содержания ЦИК в сыворотке крови экспериментальных животных начался позже, на 7 сутки отмечался статистически незначимый подъем уровня высокомолекулярных ЦИК по отношению к контрольным показателям (11,77±7,6 против 6,0±1,9, р>0,05 ). К 21 дню показатели ЦИК достигли значимых различий с контрольной группой и группой сравнения, в большей степени за счет низкомолекулярной фракции (76,5±8,5,
р<0,05). В опытной группе подъем ЦИК всех фракций практически вдвое менее выражен, различия между показателями опытной группы и группы сравнения статистически значимые в каждом временном промежутке. Однако, к 90 суткам наблюдения в обеих группах отмечается значительное уменьшение концентрации всех фракций ЦИК, практически достигнув контрольных значений. Статистически значимых различий между показателями опытной группы и группы сравнения на 90 сутки наблюдения не выявлено (р>0,05). Заключение
Общая динамика повышения ЦИК имеет схожие тенденции у крыс с применением обоих видов трансплантантов: нарастание к 21 дню и нормализация к 90 дню после трансплантации. Максимальной чувствительностью обладают низкомолекулярные ЦИК, что больше говорит о классической воспалительной реакции. Однако можно отметить, что после использования ксенобрюшины мы видим статистическую значимую меньшую выраженность иммунологической реакции у крыс, что может говорить не только о том, что ксенобрюшина не вызывает специфической иммунной реакции отторжения, но и вызывает меньший воспалительный ответ.
СПИСОК
1 Егиев В.Н., Чижов Д.В. Проблемы и противоречия «ненатяжной» герниопластики // Герниология. -2004. -№4. - С. 3-7.
2 Мамедов Р.А. Морфологическая оценка местной реакции организма при применении сетчатых материалов для протезирования передней брюшной стенки // Новости хирургии. - 2013. - Т. 21, №1. - С. 23-28.
3 W.J. Gaertner Experimental Evaluation of Four Biologic Prostheses for Ventral Hernia Repair // Journal of Gastrointestinal Surgery. - 2007. - Vol. 19. - P. 352-354.
ЛИТЕРАТУРЫ
4 F.S. Ayubi Abdominal wall hernia repair: a comparison of Permacol and Surgisis grafts in a grat hernia model // Hernia. - 2008. - Vol. 12. - P. 373-378.
5 D.M. Parker Porcine dermal collagen (Permacol) for abdominal wall reconstruction // Currative Surgery. - 2006. - Vol. 63. - P. 255-258.
6 А.А. Венедиктов, В.К. Фуки, М.Т. Генгин, О.В. Калмин, Д.В. Никишин, Л.В. Живаева. Разработка методов получения внеклеточного матрикса на основе ксеноперикардиальной ткани и оценка его свойства / /
VeStnik KQzfimU № I - 2020
Медицинские науки. Теоретическая наука. - 2013. - №4. -С. 13-14.
7 Е.А. Губарева., С. Сьоквист ., А.С. Сотниченко ., М.Л. Лим ., Н. Фелиу-Торрес ., К.А. Даниленко ., С.В. Орлов ., С.Н. Чвалун ., Т.Е. Григорьев ., С.Н. Крашенинников ., В.А. Порханов ., И.С. Поляков ., Е.В. Куевда., И.С. Гуменюк . Децеллюляризация пищевода низших приматов. // Гены & клетки Том IX. - 2014. - №4. - С. 64-66.
8 Anderson JM, Gristina AG, Hanson SR, Harker LA, Johnson RJ, Meritt K, et al. Host reactions to biomaterials and their evaluation. In: Rattner BD, Hoffman AS, editors. Biomaterials Science. - San Diego: Academic Press, 1996. - Р. 165-214.
9 Nozomi Aibaraa, Kaname Ohyamaa, Masaaki Hidakab, Naoya Kishikawaa, Yasuyoshi Miyatac, Mitsuhisa Takatsukib, Susumu Eguchib, Naotaka Kurodaa. Immune complexome analysis of antigens in circulating immune complexes from patients with acute cellular rejection after living donor liver transplantation // Transplant Immunology. - 2018. - №48. -Р. 60-64.
10 G.D. Harkiss., D.L. Drown., R. Cory-Perce. Serial analysis of Circulating Immune Complexis, Complement, and Antithymocyte Globulin Antibodies in Heart transplant
recipients// Journal of Clinical Immunoloy. - 1983. - №2. - Р. 123-125.
11 Р.М. Бадыров., Н.Т. Абатов., М.М. Тусупбекова., И.Н. Альбертон., Д. Н. Матюшко. Изучение биомеханических свойств нового биологического импланта на основе внеклеточного матрикса ксенобрюшины для пластики дефектов передней брюшной стенки // Медицина и экология. - 2018. - №1. - С. 123-124.
12 Hsu P.W., Salgado C.J., Kent K et al. Evaluation of porcine dermal collagen (Permacol) used in abdominal wall reconstruction // J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. - 2009. -№62(11). - P. 1484-1489.
13 Абатов Н.Т., Бадыров Р.М., Асамиданов Е.М., Каукенов Б.Н. Метод реконструкции передней брюшной стенки с применением внеклеточного матрикса ксенобрюшины/ Свидетельство о государственной регистрации прав на объект авторского права; выдано 10.08.2016 г., № 1671.
14 Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии: руководство по клинической лабораторной диагностике: в 2 т. - Изд. 3-е, перер. и доп. - Т. 1. - М.: Гэотар-Медиа, 2012. - 472 с.
Л.В. Максяткина, Н.Т. Абатов, Л.Л. Ахмалтдинова, Р.М. Бадыров, А.Ш. Ирисметов, Е.Б. Болекбаев
«Караганды медициналъщуниверситетi» коммерциялыц емес акционерок кргамы
ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИЯЛАЖАН КСЕНОГЕНД1 1ШТ1КТ1 ТРАНСПЛАНТАЦИЯДА ЦОЛДАЖАН СОН, ЕГЕУЦ¥РЙЬЩТАРДЬЩ АЙНАЛЫМДМЫ ИММУНДЫ КЕШЕНДЕР1Н ТАЛДАУ
ТYЙiн: 1штщ алдыцгы кабыргасындагы ак;аулардыц пластикалык; хирургиясы ушш колданылатын биологиялык; имплантаттар курамында антиген ретшде эрекет етш, агзаныц иммундык; жуйесшщ айкын реакциясын тудыруы мумган. Арнайы кабылданбаган антигендер реципиенттщ ;ан антиденелерiмен байланысып, айналымдагы иммундык; кешендер (АИК) тузедъ Зерттеудщ максаты: Кан сарысуындагы АИК децгешн аныктау аркылы децеллюляризация нэтижесшде пайда болган егеукуйрыктардагы штщ алдыцгы кабыргасыныц а;ауы Yлгiсiндегi ксеногендш iштiктiц децеллюляризацияланган матрицасыныц иммуногендiгiн зерттеу. Тэжiрибе 48 а; жынысты; жетшген егеук;уйрык;тарда ЖYргiзiлдi.
Салыстыру материалы ретшде «Permacol» ацеллярлы дермалды коллагенi (Covidien, USA) ;олданылды. Жануарлар 24-тен 2 топ;а, 6 кiшi топ;а кездейсо; б0лiндi. Салыстыру тобы 6 егеукуйрьщтан турды. Ба;ылау кезецдерi: 7 кун, 21 кун, 30 кун жэне 90 кун. Алынган нэтижелер децеллюляризацияланган ксеноiштiк белгiлi бiр иммунды ;абылдамау реакциясын тудырмайтынын, сонымен ;атар аз ;абыну реакциясын тудыратынын к0рсеттi.
ТYЙiндi свздер: жасушадан тыс матрикс, айналымдагы иммунды; кешендер, биоимплант, трансплантация, Permacol.
L.V. Maksyatkina, N.T. Abatov, L.L. Aqhmaltdinova, RM. Badyrov, A.Sh. Yirismetov, E.B. Bolekbayev
Non-profit joint-stock company at "Medical University of Karaganda"
ANALYSIS OF CIRCULATING IMMUNE COMPLEXES IN RATS AFTER TRANSPLANTATION OF A DECELLULAR XENOGEN PITCH
Resume: Biological implants used for plastic surgery of defects in the anterior abdominal wall may contain components that subsequently can cause a pronounced reaction of the body's immune system, acting as an antigen. Specific rejection antigens bind to the recipient's blood antibodies to form circulating immune complexes (CECs). Objective: To study the immunogenicity of the decellularized matrix of xenogenic peritoneum on a model of anterior abdominal wall defect in rats resulting from decellularization by determining the level of CEC in blood serum. The experiment was conducted on 48 white nonlinear sexually mature rats. The porcine acellular dermal
collagen Permacol (Covidien, USA) was used as a comparison material. Animals were distributed over 24 individuals in 2 groups, in 6 subgroups randomly. The comparison group included 6 individuals. Observation periods were of 7 days, 21 days, 30 days and 90 days respectively. The results obtained showed that the decellularized xenobrush does not cause a specific immune rejection reaction, but also causes a smaller inflammatory response.
Keywords: extracellular matrix, circulating immune complexes, bioimplant, transplantation, Permacol.
