CC BY
142
© Яцюк В.Я., Елецкая О.А., 2009 УДК 615.322.074
АНАЛИЗ СОСТАВА ВЕЩЕСТВ ПЕРВИЧНОГО СИНТЕЗА РАСТИТЕЛЬНОГО СБОРА
В.Я.Яцюк, О.А. Елецкая
Курский государственный медицинский университет, Курск
Результатами качественного анализа, подтвержденного хроматографическими исследованиями, в составе мочегонного сбора обнаружены вещества первичного обмена: аминокислоты и полисахариды, а также установлен их качественный состав что позволяет прогнозировать возможные фармакологические эффекты, а также предложить выбор методов стандартизации.
Ключевые слова: качественный анализ, синтез, растительный сбор.
Возросший интерес к природным лекарственным средствам, привел к активизации исследований, связанных с разработкой и внедрением в научную медицину новых сборов для лечения различных заболеваний
Многокомпонентные смеси из ЛРС обладают ценным преимуществом перед другими фитопрепаратами: возможность обеспечить основной
фармакологический эффект в сочетании с комплексным воздействием на организм больного в целом, а также мягкость действия и отсутствие, как правило, нежелательных побочных явлений. Они достаточно просты в промышленном производстве и относительно дешевы. Перспективность исследований в области разработки сборов определяется не только их терапевтической ценностью, но и наличием в России достаточной сырьевой базы по многим видам лекарственных растений
Для создания растительного препарата эффективного в комплексном лечении заболеваний урогенитального тракта в состав композиций целесообразно включать растения, обладающие противовоспалительным, бактерицидным, а также иммуномодулирующим действием, учитывая хронический характер течения заболеваний, связанный с развитием вторичных иммунодефицитов. На основе наименований лекарственного растительного сырья, обладающего мочегонным, бактерицидным, противовоспалительным и иммунотропным действием нами была составлена рецептура четырех пятикомпонентных мочегонных сборов, в состав которых включены растения, разрешенные к медицинскому применению на территории РФ [3].
По результатам доклинических испытаний наиболее выраженное диуретическое действие показал сбор состава: лист брусники, цветки календулы, трава пустырника, почки березы, листья смородины. Производящие растения достаточно хорошо и подробно изучены и давно применяются в научной медицинской практике.
Определение состава биологически активных веществ сбора было начато с изучения веществ первичного обмена (аминокислот и состава моно- и полисахаридов). Вещества первичного синтеза образуются в процессе ассимиляции, т.е. превращения веществ, поступающих в организм извне, в
вещества самого организма. К веществам первичного синтеза относят также белки, липиды, ферменты, витамины и органические кислоты.
Учитывая, что растительные сборы применяются в виде водных извлечений, в первую очередь, представляет интерес изучение состава тех групп биологически активных веществ, которые извлекаются водой, а именно полисахаридов и аминокислот [2].
Материалы и методы
В водных извлечениях из образцов сбора определяли свободные и связанные сахара. Свободные сахара определяли:
- по реакции Бертрана: 1 мл водного извлечения нагревали на водяной бане с 1 мл реактива Фелинга, при этом появлялся кирпично-красный осадок меди (I) оксида.
- по реакции с реактивом Несслера: к 1 мл очищенного водного извлечения прибавляли 1 мл реактива Несслера и нагревали на кипящей водяной бане, при этом выпадал черный осадок ртути (I) оксида .
Связанные сахара определяли:
- по реакции Бертрана: 1 мл водного извлечения нагревали на водяной бане с 1 мл кислоты серной 10% в течение 5 минут для достижения гидролиза. После охлаждения к гидролизату прибавляли 1 мл реактива Фелинга, при этом появлялся кирпично-красный осадок меди (I) оксида, по объему превышающий аналогичный при определении свободных сахаров.
- по реакции с а-нафтолом: к 1 мл водного извлечения прибавляли 20% этанольный раствор а-нафтола, а затем по каплям серную кислоту. На поверхности раздела фаз появлялось красное кольцо [2,5].
Для качественного обнаружения аминокислот в водном извлечении сбора использовали нингидриновую реакцию: к 1мл очищенного водного извлечения добавляли 1 мл 0,25% этанольного раствора нингидрина и осторожно нагревали. Появлялось красно-фиолетовое окрашивание, усиливающееся при охлаждении [6,7]
Для установления качественного состава сбора использовали методы хроматографии в тонком слое сорбента в различных системах растворителей в зависимости от физико-химических свойств определяемых БАВ.
Хроматографическое определение аминокислот проводили в системах растворителей бутанол-уксусная кислота ледяная - вода (4:1:2), (12:3:5), бутанол-диэтиловый эфир-уксусная кислота ледяная - вода (9:6:3:1), бутанол-пиридин-вода (6:4:3), используя очищенные водные извлечения [1,2,4,7].
На хроматографическую пластинку размером 150x120 мм «Силуфол» наносили на расстоянии 1 см от нижнего края по 0,2 мкг извлечения из сбора и по
0,2 мкг 0,5% водных растворов стандартных образцов аминокислот. Пластинку с нанесенными образцами помещали в хроматографическую камеру, предварительно в течение часа насыщенную парами смеси растворителей, и хроматографировали восходящим способом. После прохождения фронтом растворителя расстояния 10 см, пластинку извлекали из камеры, просушивали на воздухе. Затем пластику равномерно обрабатывали 0,25% раствором нингидрина в ацетоне, нагревали в сушильном шкафу при температуре 105°С в течение 2-3 минут. Аминокислоты в видимом свете визуализировались в виде розовопурпурных пятен (табл.1) [1,6] .
Таблица 1.
Результаты тонкослойной хроматографии аминокислот водного извлечения мочегонного сбора в системах растворителей бутанол-уксусная кислота ледяная - вода (12:3:5) (I), бутанол-пиридин-вода (6:4:3) (II).
Номер пятна Rf Цвет пятна в после обработки 0,25% раствором нингидрина Аминокислота
Система (I) Система (II)
1 0,12 0,22 серовато-красный гистидин
2 0,13 0,16 пурпурная лизин
3 0,14 0,18 пурпурная аргинин
4 0,23 0,27 пурпурная серин
5 0,22 0,31 серовато-красный глицин
6 0,25 0,19 синяя аспарагиновая кислота
7 0,28 0,34 пурпурная треонин
8 0,31 0,20 пурпурная глутаминовая кислота
9 0,32 0,38 пурпурная аланин
10 0,47 0,54 синяя тирозин
11 0,51 0,37 пурпурная валин
12 0,60 0,56 синяя фенилаланин
13 0,72 0,63 пурпурная лейцин
Идентификацию сахаров, входящих в состав в полисахаридного комплекса (ПСК) проводили после кислотного гидролиза, в результате которого расщепляются гликозидные связи. Для полного гидролиза полисахаридов использовали серную кислоту, поскольку она вызывает наименьшие разрушения продуктов гидролиза и легко удаляется из гидролизата карбонатом бария. Оптимальные условия гидролиза полисахаридов устанавливали экспериментально. Для определения условий гидролиза применяли серную кислоту различной концентрации и определяли время полного гидролиза с через 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 часов по количеству восстанавливающих сахаров [6].
Для этого по 0,01 г (точные навески) ПСК помещали в ампулы и растворяли в 2,5 мл растворов кислоты серной различной концентрации (1-10%). Ампулы запаивали и нагревали при температуре 100оС в течение 2-8 часов. После указанного промежутка времени отбирали пробы гидролизата полисахаридного комплекса. После охлаждения содержимое ампул количественно переносили в стаканчик, разбавляли водой до 15 мл. Раствор нейтрализовали сухим бария карбонатом до нейтральной реакции. Осадок бария сульфата отфильтровали, промывали водой. Фильтрат сгущали под вакуумом на водяной бане до 5 мл.
Продукты гидролиза (нейтральные сахара) осаждали 15 мл этанола 96%. Сформировавшийся осадок отфильтровывали, фильтрат упаривали до 2 мл (раствор А). Осадок бариевых солей кислых сахаров (уроновых кислот) диспергировали в 5 мл очищенной воды и фильтровали через слой катионита КУ-2 (Н+). Элюат, содержащий кислые сахара концентрировали в вакууме при 40-5 0оС до 2 мл (раствор Б).
1. Раствор А хроматографировали на бумаге в системах растворителей этилацетат-пиридин-вода (12:5:4), пропанол-этилацетат-вода (7:1:2), н-бутанол-пиридин-вода (6:4:3), а раствор Б в системе этилацетат-уксусная кислота-муравьиная кислота-вода (18:3:1:4) с достоверными образцами сахаров. В качестве проявителя использовали раствор анилингидрофталата. Обработанные хроматограммы нагревали в сушильном шкафу в течение 1520 минут при температуре 100оС [6,7] Шаршунова, М. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии [Текст] /
М.Шаршунова, В.Шварц, У. Михалец.- М.: Мир, 1980. - Т.1.- 288 с.,- М.: Мир, 1980. - Т.2.- 319 с.
. В растворе А были идентифицированы лактоза, ксилоза, галактоза, глюкоза, арабиноза и рамноза. (табл. 2). Причем дисахарид лактоза обнаруживали только в пробах после 2-4 часового гидролиза ПСК.
Таблица 2.
Тонкослойная хроматография нейтральных моносахаров ПСК мочегонного сбора (раствор А) в системах растворителей: I - н-бутанол-пиридин-вода (6:4:3); II - этилацетат - пиридин -вода (12:5:4): III - пропанол-этилацетат-вода (7:1:2).
Номер пятна Значение КГ в различных системах растворителей Идентифицировано
I II III
1 0,29 0,42 0,84 галактоза
2 0,34 0,50 0,50 глюкоза
3 0,42 0,65 0,58 арабиноза
4 0,45 0,80 0,63 ксилоза
5 0,49 0,75 0,88 рамноза
При хроматографировании раствора Б в системе этилацетат-уксусная кислота-муравьиная кислота-вода (8:3:1:4) было идентифицировано одно вещество с Яг =0,32 - глюкуроновая кислота.
Выводы.
В ходе анализа в составе растительного сбора обнаружены вещества первичного обмена: аминокислоты и полисахариды, качественный состав которых подтвержден хроматографическими исследованиями. Полученные сведения о качественном составе веществ первичного обмена позволяют прогнозировать и объяснять некоторые аспекты разностороннего фармакологического воздействия сбора при различных патологических состояниях, в частности, именно полисахариды обладают противовоспалительными и иммуномодулирующими свойствами, влияют на процессы физиологической и репаративной регенерации, аминокислоты нормализуют обменные процессы и улучшают трофику тканей в месте воспаления. С другой стороны, на основе полученных сведений возможна
разработка метода стандартизации сбора, как лекарственного препарата.
ЛИТЕРАТУРА
1. Доржбал, Э. Изучение аминокислотного состава антимикробного сбора и сухого экстракта/ Э. Доржбал, Ермакова В.А. // Материалы V международного съезда «актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения».- СПб., 2001.-
С.375- 379.
2. Елецкая, О.А. Фармакологические и фитохимические исследования по разработке рецептуры мочегонного сбора// О.А. Елецкая, В.Я.Яцюк, Г.А.Чалый// Прикладные информационные аспекты медицины: научнопрактический журнал. - Воронеж: ВГМА им. Н.Н. Бурденко, 2006. -Т.9.№2.- С. 132-139
3. Киселева, Т. Л. Разработка алгоритма действия по составлению сборов на основе опыта традиционной медицины России/ Т.Л. Киселева, А.В. Чаузова, А.А. Карпеев //Фармация. - 2000.- №2. - С.15- 18
4. Лебедев, А.В. Аминокислотный состав зверобоя четырехгранного/ А.В. Лебедев //Современные проблемы фармакогнозии и фитотерапии: межвуз. сб. науч. трудов, посв. 15- летию каф. фармакогнозии ЯГМА. - Ярославль: ЯГТУ, 1999. - С. 21- 22.
5. Лобанчикова, Н.В. Разработка и стандартизация седативных растительных сборов: Автореф. дис. ...канд.ф. наук. (15.00.02) / Н.В. Лобанчикова; 1 ММИ. - М., 1991.- 27c.
6. Никитина, Л.Е. Физические методы идентификации органических соединений/ Л.Е. Никитина, В.В Племенков. - Казань, 2003. - 92с.
7. Шаршунова, М. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии / М.Шаршунова, В.Шварц, У. Михалец.- М.: Мир, 1980. - Т.1.288 с.,- М.: Мир, 1980. - Т.2.- 319 с.
THE ANALYSIS OF PRIMARY SYNTHESIS SUBSTANCES IN PLANT SPECIES
V.Ya. Yatzuk, O.A.Eletskaya
The results of the qualitative analysis confirmed by a chromatographic assay have revealed in the composition of a diuretic plant species some substances of primary metabolism: amino-acids and polysaccharides, their qualitative composition having been also determined, which gives the opportunity of predicting the possible pharmacological effects and offering a choice of standardization methods
Key words: qualitative analysis, synthesis, vegetable collection
Яцюк Валентина Яковлевна - заведующая кафедрой биоорганической химии, д. фарм. наук, профессор Курского государственного медицинского университета; [email protected]
