CC BY
43
ISSN 0202-5493.МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных
Н.В. Маркин1,
культур. Вып.2 (148-149), 2011
кандидат биологических наук К.В. Азарин1,
кандидат биологических наук
В.С. Лотник1,
младший научный сотрудник
О.Ф. Горбаченко2,
кандидат сельскохозяйственных наук В.А. Гаврилова3, доктор биологических наук А.В. Усатов1,
доктор биологических наук, профессор
'Научно-исследовательский институт биологии Южного федерального университета, Россия, 344090, Ростов-на-Дону, пр. Стачки 194/1, тел. (863) 243-33-94, e-mail: azkir@rambler.ru
2ГНУ ДОС им. ЛА. Жданова ВНИИМК Россельхозакадемии
3ГНУ ГНЦ РФ Всероссийский НИИР им. Н.И. Вавилова, ул. Б.Морская, 42, 19000, Санкт-Петербург
АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ХЛОРОПЛАСТНОЙ ДНК КУЛЬТУРНОГО И ДИКОРАСТУЩЕГО ПОДСОЛНЕЧНИКА Helianthus petiolaris L.
Ключевые слова: подсолнечник, дикорастущая форма, полиморфизм, SSR-маркеры, хлоропластная ДНК
УДК 575.153
Введение. Получение гибридов с высокой продуктивностью и комплексной устойчивостью к факторам среды в первую очередь зависит от генотипов родительских линий. При этом в подавляющем большинстве основной акцент делается на комбинацию только ядерных аллелей. Несомненно, ядерный геном играет ключевую роль в онтогенезе растений. Однако на сегодня твердо доказаны и эффекты цитогенов, как на экспрессию количественных признаков, так и на адаптивный потенциал растений к экстремальным факторам среды (Goloenko et al., 2001; Давыденко, 1989; Машкина и др., 2010).
В настоящее время все коммерческие линии подсолнечника переводят на стерильную основу только одного типа цитоплазмы H. petiolaris (ЦМС типа РЕТ1), впервые полученной Леклерком в 1966 г. из межвидового гибрида H. petiolaris L. х H. annuus L. (Leclerq, 1969). Унификация использования в селекции одной системы ЦМС и, как следствие, одного цитоплазмона может быть причиной снижения адаптационного потенциала
культурного подсолнечника. Наряду с этим демонстрируется сокращение генетической изменчивости в процессе окультуривания и дальнейшей селекции. Так Rieseberg and Seiler (1990), исследовавшие большую коллекцию диких и культурных линий подсолнечника, обнаружили, что культурные формы демонстрируют уменьшенную аллозимную изменчивость и что все они характеризуются одним единственным хпДНК RFLP гаплоти-пом. Таким образом, расширение или, по меньшей мере, сохранение при окультуривании спектра изменчивости генома цитоплазмы является актуальной задачей селекции подсолнечника.
В связи свышеизложенным был проведен SSR-анализа хлоропластной ДНК ЦМС- и Rf-линий культурного подсолнечника Helianthus annuus L. и дикорастущих форм Helianthus petiolaris Nutt.
Материалы и методы. Объектом исследования служил селекционный материал Донской опытной станции им. Л.А. Жданова ВНИИМК, представленный 17-ю ЦМС (ВД 1448, ЭД 931, ЭД 73, ВД 350, ВД 356. ВД 151, ЭД 1433, ЭД 236, ЭД 77, ЭД 169, ВД 255, ВД 22, ВД 149, ВД 354, ЭД 869, ВД 344, ЭД 95) и 29-ю Rf (ВД 541, ВД 110, ЭД 788, ВД 195, ВД 114, ЭД 538, ВД 62, СИ 0306, СИ 361, СИ 4917, СИ 991, СИ 90592, СИ 99017, СИ 941152, СИ 0123, СИ 2288, СИ 843, СИ 0211, СИ 40181, СИ 515, СИ 543, СИ 1671, СИ 1228, СИ 7307, СИ 1854) линиями подсолнечника, а также формами дикорастущего вида H. petiolaris с различными номерами интродукции из мировой коллекции ВИР.
Геномную ДНК выделяли из первой пары настоящих листьев проростков по методу Р. Бума (Boom et al., 1990) c нашими модификациями.
Для анализа микросателлитных последовательностей хлоропластной ДНК были отобраны SSR-маркеры (табл. 1), выявляющие, по данным литературы (Wills et al., 2005), высокий уровень полиморфизма хпДНК в семействе Compositae.
Полимеразную цепную реакцию проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл, содержащей 67 мМ трис-HCl pH 8,4, 16 мМ (NH4)2 SO4, 2,5 мМ MgSO4, 0,1 мМ меркапто-этанола, 0,25 мМ каждого дНТФ (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ), 15 пмоль праймера, 2,5 ед. Taq-полимеразы, 30 нг выделенной ДНК. Амплификацию проводили в термоциклере Palm Cycler Corbett Research (Австралия) по следующей программе: первоначальная денатурация 3 мин при 95 оС, после чего десять
циклов: 30 сек при 94 оС, 30 сек при 58 оС (температура отжига была уменьшена на 1 оС на каждый цикл), 45 сек при температуре 72 оС, а затем до 30 циклов: 30 сек при 94 оС, 30 сек при 48 оС, 45 сек при температуре 72 оС, а окончательная элонгация 20 мин при 72 оС.
Таблица 1
Праймеры, использованные для SSR-анализа хпДНК дикорастущего и культурного подсолнечника
Номер Локус Последовательность фланкирующих праймеров 5'-3'
1 ccmp 1 Fwd: CAGGTAAACTTCTCAACGGA Rev: CCGAAGTCAAAAGAGCGATT
2 ccmp 4 Fwd: AATGCTGAATCGAYGACCTA Rev: CCAAAATATTBGGAGGACTCT
3 ccmp 5 Fwd: TGTTCCAATATCTTCTTGTCATTT Rev: AGGTTCCATCGGAACAATTAT
4 NTCP 7 Fwd: TGATCCCGGACGTAATCC Rev: CGAATCCCTCTCTTTCCG
5 NTCP 9 Fwd: CTTCCAAGCTAACGATGC Rev: CTGTCCTATCCATTAAGACAATG
6 NTCP 18 Fwd: CTGTTCTTTCCATGACCCCTC Rev: CCACCTAGCCAAGCCAGA
7 NTCP 30 Fwd: GATGGCTCCGTTGCTTTAT Rev: TGCCGGAGAGTTCTTAACAATA
8 NTCP 40 Fwd: TAATTTGATTCTTCGTCGC Rev: GATGTAGCCAAGTGGATCA
Амплифицированные продукты визуализированы на автоматическом ДНК-анализаторе 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) с использованием программы GeneMapper ID (версия 3,2).
Результаты и обсуждение. В результате исследования 46 ЦМС-линий и Rf-линии подсолнечника по 8 хлоропластным микроса-теллитным локусам был выявлен один гапло-тип (так называемый «основной» культурный гаплотип). Размер амлифицированного фрагмента у всех исследованных образцов составил: 137 п.н. для маркера ccmp 1, 126 п.н. -для ccmp 4, 95 п.н. - для ccmp 5, 192 п.н. -для NTCP 7, 257 п.н. - для NTCP 9, 185 п.н. -для NTCP 18, 157 п.н. - для NTCP 30, 254 п.н. - для NTCP 40 (рис. 1).
Рисунок 1 — Фореграммы продуктов амплификации хлоропластной ДНК культурных линий подсолнечника с SSR праймерами: 1 - ccmp 1, 2 - ccmp 4; 3 -ccmp 5, 4 - NTCP 7, 5 - NTCP 9, 6 - NTCP 18, 7 -NTCP 30, 8 - NTCP 40. По оси х - количество н.п., у - относительные флуоресцентные единицы
Отличительной особенностью хпДНК Н. petiolaris от культурных линий является наличие полиморфных вариантов по исследованным SSR локусам. В результате SSR-анализа Н. petiolaris было показано, что из восьми исследованных микросателлитных маркеров локусы КТС? 9 и КТС? 30 являются полиморфными (табл. 2). У пяти исследованных растений Н. petiolaris для локуса №ГСР 9 характерен аллель 256 п.н., для двух растений характерно наличие ампликона 255 п.н. Двумя аллельными вариантами также характеризуется локус КТС? 30 (табл. 2).
Дискриминационный потенциал изученной маркерной системы оказался недостаточным для идентификации линий культурного подсолнечника. Вследствие генетического сходства по изученным микросателлитным
локусам хпДНК необходим дополнительный подбор маркеров. С другой стороны, проведенный SSR-анализ хлоропластного пластома дикорастущего вида Н. petiolaris показал для маркеров КТС? 9 и КТС? 30 наличие полиморфных позиций.
Таблица 2
Аллельныеразличия ЗЖ локусов хлоропластной ДНК Н. рвНо1аш
№ п/п Проба Локус, размер аллелей п.н.
сстр1 4 СР а о о 5 СР а о о ОТСР7 ОТСР9 МГСР18 МГСР30 МГСР40
1 Культурные линии (17 ЦМС- и 29 Иллиний) 137 126 95 192 257 185 157 254
2 Н. petiolaris (440560)* 137 126 95 192 256 185 157 254
3 Н. petiolaris (440560) 137 126 95 192 256 185 157 254
4 Н. petiolaris (440560) 137 126 95 192 255 185 157 254
5 Н. petiolaris (503232) 137 126 95 192 256 185 158 254
6 Н. petiolaris (б/№) 137 126 95 192 255 185 158 254
7 Н. petiolaris (б/№) 137 126 95 192 256 185 157 254
8 Н. petiolaris (б/№) 137 126 95 192 256 185 157 254
* - в скобках указан номер интродукции Н. pet-iolaris на Кубанской опытной станции ВИР им. Н.И. Вавилова
Таким образом, в данной работе была исследована изменчивость генома органелл у селекционных линий подсолнечника, а также дикорастущих форм Н. petiolaris как источников потенциально важных плазмотипов. В результате анализа полиморфизма микроса-теллитных локусов хлоропластной ДНК семи генотипов Н. petiolaris определены четыре гаплотипа. SSR-анализ полиморфизма хпДНК 17 ЦМС- и 29 М-линий (селекционный материал ДОС им. Л.А. Жданова ВНИИМК) не выявил аллельных различий. Хлоропластный геном, в данном случае, представлен одним SSR гаплотипом.
Получение селекционного материала, который наряду с высокой урожайностью и масличностью будет обладать комплексной устойчивостью к действию внешних факторов среды, возможно с привлечением потен-
циала дикорастущих форм подсолнечник (Гаврилова, Анисимова, 2003). Снижение ци-топлазматического генетического разнообразия, сопровождающие процессы доместикации и искусственного отбора, предполагает введение в культуру новых плазмотипов. Таким образом, обнаруженные в результате SSR-анализа хпДНК дикорастущих форм редкие плазмотипы представляют непосредственный интерес для селекции культурного подсолнечника.
Исследование выполнено при финансовой поддержке ФЦП Министерства образования и науки РФ, госконтракты № 16.740.11.0485 и № 16.552.11.7024.
Список литературы
1. Гаврилова, В.А. Генетика культурных растений. Подсолнечник / В.А. Гаврилова, И.Н. Анисимова. - Санкт-Петербург: Изд-во ВИР, 2003. - 209 с.
2. Давыденко, О.Г. Роль цитоплазматиче-ской изменчивости в эволюции и селекции растений. // Цитология и генетика. - 1989. -Т. 24. - С. 66-76.
3. Машкина, Е.В. Сравнительный анализ термотолерантности хлорофильных мутантов подсолнечника Е.В. Машкина, А.В. Усатов, М.В. Скорина // Генетика. - 2010. - Т. 46. - № 2. - С. 1-7.
4. Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids / R. Boom, C.J. Sol, M.M. Salimans, C.L. Jansen, P.M. Wertheim-van Dillen, J. Wertheim-van der Noordaa // J. Clin Microbiol. - 1990. - Vol. 28(3). - P. 495503.
5. Goloenko, I.M. Some nucleicytoplasmic combinations of barley substituted lines collection change the productivity characteristics / I.M. Goloenko, A.A. Teljatnicova, N.V. Lukhanina, O.G. Davydenko // In Genetic Collection, Isogenic and Alloplasmic Lines: Proc. Intern. Conf. - Novosibirsk, 2001 - P. 70-74.
6. Leclerq, P. Une sterilite cytoplasmique chez le tournesol / P. Leclerq // Ann. Amelior. Plant. - 1969. - Vol. 19.- P. 99-106.
7. Rieseberg, L.H. Molecular evidence and the origin and development of the domesticated sunflower (Helianthus annuus, Asteraceae) / L.H. Rieseberg, G.J. Seiler // Econ Bot. 1990. Vol. 44. P. 79-91.
8. Wills, DM. Chloroplast SSR polymorphisms in the Compositae and the modeof organellar inheritance in Helianthus annuus / D.M. Wills, M L. Hester, A. Liu, J.M. Burke // Theor. Appl. Genet.- 2005. - Vol. 110. - P. 941-947.
