CC BY
49
МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 2 (141), 2009
Н.В. Маркин1,
кандидат биологических наук
М.А. Тихонова1,
аспирантка
И.Н. Анисимова2 ,
доктор биологических наук
В.Т. Рожкова3,
кандидат биологических наук
В.А. Гаврилова2,
доктор биологических наук
А.В. Усатов1,
доктор биологических наук
'НИИ биологии Южного федерального университета Россия, 344090, Ростов-на-Дону, пр. Стачки, 194/1 тел. (863) 243-33-94, e-mail: [email protected].
2ГНУ ГНЦ РФ ВИР им. Н.И. Вавилова, 19000, Санкт-Петербург, ул. Б.Морская, 42,
3ГНУ Кубанская опытная станция ВИР им. Н.И. Вавилова, п. Ботаника, Гулькевический район, Краснодарский край
SCAR-МАРКЕР ГЕНА Rf1 ПОДСОЛНЕЧНИКА У ЛИНИЙ ВОССТАНОВИТЕЛЕЙ
ФЕРТИЛЬНОСТИ ПЫЛЬЦЫ РАСТЕНИЙ С РАЗЛИЧНЫМИ ТИПАМИ ЦМС
Ключевые слова: подсолнечник (Helianthus), цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС), CAR- (Sequence Characterized Amplified Region) маркер, гены Rf, гибридологический анализ
УДК 575.12:547.962: 633.854.78
Введение. В настоящее время главным направлением селекции подсолнечника (Helianthus annuus L.) является получение гетерозисных гибридов. Для производства таких гибридов используют материнские линии ЦМС на основе цитоплазмы однолетнего дикорастущего вида подсолнечника Н. petiolaris и отцовские растения, несущие гены-восстановители фертильности пыльцы (Rf) [1]. Поиск растений, восстанавливающих фертильность пыльцы линий ЦМС, является отдельным предметом исследований в гетерозисном производстве подсолнечника.
Одним из перспективных подходов в этом направлении является поиск надежных ДНК-маркеров, ассоциированных с генами Rf [2, 3, 4, 5, 6]. Установлено, что у большинства культурных линий подсолнечника восстановление фертильности пыльцы определяют два ядерных доминантных гена - Rf1 и Rf2. При этом ген Rf2 присутствует практически у всех инбредных линий, в том числе и закрепителей ЦМС, и только ген Rf1 интродуцируется линиями восстановителями, приводя к получению фертильных гибридов подсолнечника [7, 1, 8]. С целью ухода от унификации использования одной системы ЦМС в селекции подсолнечника во Всероссийском институте растениеводства им. Н.И. Вавилова исследуется возможность в качестве материнской формы использовать линии с другим типом ЦМС. Наиболее перспективным в этом направлении является ЦМС на основе цитоплазмы многолетнего дикорастущего вида подсолнечника Н. rigidus.
В связи с этим целью настоящей работы является выявление доноров восстановителей фер-тильности пыльцы линий ЦМС, полученных на основе H. petiolaris и H. rigidus, представленных в коллекции Всероссийского института растениеводства им. Н.И. Вавилова, с помощью SCAR-маркера гена Rf1 подсолнечника.
Материалы и методы. Материалом для молекулярно-генетического исследования служили проростки семян подсолнечника линий-восстановителей фертильности пыльцы: ВИР 792,
ВИР 793, ВИР 160, RIL 38, RIL 228, RIL 130 из коллекции Всероссийского института растениевод-
ства.
Геномную ДНК выделяли из этиолированных проростков по методике Шагай-Маруфа с нашими модификациями. Растертые проростки (стебли и семядоли) инкубировали в 600 мкл (на один образец) экстракционного буфера (в 100 мл буфера 10 мл 1 М трис/HCl pH 0,8; 8,19 г NaCl; 0,744 г ЭДТА; 2 г СТАВ; 1 г ПВП; 0,5 % Na2S2Ö3) при температуре 65 °С в течение 1,5 часа. После хлороформ-изопропаноловой экстракции жидкую фазу отделяли центрифугированием в течение 10 минут при 5000 об/мин. Затем в пробы вносили 1 %-ную РНК-азу и инкубировали при температуре 37 °С в течение 1 часа. После повторной экстракции и центрифугирования в надосадочную жидкость добавляли равный объем изопропанола, охлажденного до -20 °С, пробы оставляли в холодильнике на ночь при +4 °С. ДНК осаждали центрифугированием в течение 15 минут при 14000 об/мин, три раза промывали 75 % этанолом, охлажденным до +4 °С, с последующим центрифугированием в течение 10 минут при 13000 об/мин. ДНК высушивали при комнатной температуре и растворяли в 100-200 мкл ТЕ-буфера (в 100 мл - 1 мл 1 М трис/HCl pH 0,8; 0,2 мл 0,5 М ЭДТА). Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре SmartSpec (Bio-Rad, США).
Амплификацию специфического участка ДНК, связанного с геном Rf1 подсолнечника, проводили, используя SCAR-маркер - HRG02/OPY10, разработанный Р. Хорн с сотрудниками [4].
Для каждой ПЦР-реакции использовали 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1,5 мкл ДНК, 1,2 мкл 1,2 мМ dNTP, 2,5 мкл 10* реакционного буфера (Silex, Москва), по 0,5 мкл прямого и обратного праймера HRG02/0PY10 в концентрации 20 пМ, 0,8 мкл Taq полимеразы (Синтол, Москва) и 14,3 мкл Н2О. Амплификацию проводили в термоциклере ТесЬпе TC-312 по следующей программе: один цикл: 1 мин 94 °С; 35 циклов: 45 сек 94 °С , 45 сек 65 °С и один цикл: 7 мин 72 °С.
Продукты реакции амплификации разделяли электрофоретически в 1,8 %-ном агарозном геле с бромистым этидием (1 мкг/мл), используя трис-боратный буфер. Размер амплифицирован-ных фрагментов определяли путем сравнения их подвижности с подвижностью маркера в агароз-ном геле.
Для гибридологического анализа использовали материнские растения четырех линий: ВИР 471, ВИР 116, ВИР 109 и ВИР 151, представленных в двух вариантах: 1) с ЦМС на основе Н. peti-olaris (PET1) и 2) с ЦМС на основе H. rigidus (RIG0) (таблица). Аналоги линий ЦМС RIG получены путем 8-кратного бекроссирования.
Результаты и обсуждение. Результаты амплификации SCAR-маркера у шести из семи исследованных линий-восстановителей фертильности пыльцы показали, что маркер гена Rf1 присутствует у линий ВИР 792, ВИР 793, RIL 38, RIL 228, RIL 130. При этом выявлен специфический фрагмент размером около 738 п.н., который не обнаружен у растений линии ВИР 160 (рисунок).
Рисунок - Электрофореграмма продуктов амплификации геномной ДНК линий восстановителей фертильности пыльцы с праймером ОРУЮ: 1 - ВИР 792; 2 - ВИР 793; 3 - МЬ 38; 4, 5 - МЬ 228; 6, 7, 8 - ШЬ 130; 9, 10, 11 - ВИР 160. М - маркер.
Восстанавливающая способность пыльцы линий-восстановителей ЦМС на основе Н. petiolaris (РЕТ1) и Н. rigidus (КЮ0) была исследована с помощью гибридологического анализа.
Как видно из таблицы, линии ВИР 792, ВИР 793, RIL 38, RIL 228 восстанавливают фертильность пыльцы как ЦМС РЕТ, так и ЦМС RIG, линия RIL 130 восстанавливает фертильность пыльцы только ЦМС РЕТ, а линия ВИР 160 закрепляет стерильность пыльцы обоих источников ЦМС. Эти данные не противоречат результатам амплификации специфического маркера гена Rf1.
Таблица - Линии ЦМС, восстановители фертильности пыльцы и восстановление фертильности пыльцы гибридов F1
Линии ЦМС Линии-восстановители фертильности пыльцы Гибриды, восстановление фертильности пыльцы в F1
ВИР 471 РЕТ ВИР 792 ВИР 471 РЕТ х И 792 +
ВИР 471 RIG ВИР 471 RIG х ВИР 792 +
ВИР 471 РЕТ ВИР 793 ВИР 471 РЕТ хВИР 793 +
ВИР 471 RIG ВИР 471 RIG х ВИР 793 +
ВИР 116 РЕТ RIL 38 ВИР 116 РЕТ х RIL 38 +
ВИР 116 RIG ВИР 116 RIG х RIL 38 +
ВИР 116 РЕТ RIL 228 ВИР 116 РЕТ х RIL 228 +
ВИР 116 RIG ВИР 116 RIG х RIL 228 +
ВИР 109 PET RIL 130 ВИР 109 PET х RIL 130 +
ВИР 109 RIG ВИР 109 RIG х RIL 130 -
ВИР 151 PET ВИР 160 ВИР 151 PETхВИР 160 -
ВИР 151 RIG ВИР 151 RIG х ВИР 160 -
Известно, что наличие гена Rf1 недостаточно для восстановления фертильности пыльцы линий ЦМС RIG. Было высказано предположение, что восстановление фертильности пыльцы ЦМС RIG находится под контролем трех генов - Rfrl, Rfr2 и Rfr3. Более того, рецессивная аллель гена Rfr3 в гомозиготном состоянии оказывает эпистатирующее действие на гены Rfrl и Rfr2, и восстановления фертильности пыльцы не происходит [9].
Необходимо также учитывать, что в настоящее время нуклеотидная последовательность гена Rfl не известна и SCAR -маркер комплементарен не самому гену Rfl, а сцепленной с ним последовательности, и находится на расстоянии 2 сМ от гена, т.е. это сцепление не является полным, что в свою очередь не исключает рекомбинационную изменчивость этого локуса. Линия ВИР 160 может и не являться носителем гена Rfl, так как закрепляет стерильность пыльцы ЦМС на основе H. petiolaris и H. rigidus.
Заключение. Полученные результаты указывают на то, что используемый SCAR-маркер выявляет наличие гена Rf1 в генотипе линий-восстановителей фертильности пыльцы и его можно использовать для прогнозирования восстановительной способности в отношении мужско-стерильных линий, полученных на цитоплазматической основе H. petiolaris. Однако результаты, полученные на линии RIL 130, подтверждают, что восстановление фертильности пыльцы ЦМС RIG предполагает участие большего количества генов Rf по сравнению с ЦМС РЕТ, следовательно, наличие этого маркера в генотипе восстановителя не всегда указывает на восстановительный потенциал в отношении ЦМС на основе H. rigidus.
В результате настоящего исследования проведена идентификация новых линий, необходимых для селекции подсолнечника на гетерозис. Линии ВИР792, ВИР 793 и L 38 и L 228 введены в состав генетической коллекции подсолнечника как носители генов восстановления фертильности пыльцы к двум типам ЦМС на основе H. petiolaris (РЕТ1) и H. rigidus (RIG0).
Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства науки и образования РФ (грант «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010)» № 2.1.1/4947) и гранта РФФИ (проект 08-04-90112-Мол_а).
МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 2 (141), 2009
Список литературы
1. Serieys, H. Identification, study, and utilization in breeding programs of new CMS sources / H. Serieys // Helia. - 1996. - Vol. 19. - P. 144-160.
2. Berry, S.T. Molecular marker analysis of Helianthus annuus L. 2. Construction of a RFLP linkage map for cultivated sunflower / S.T. Berry, A.J. Leon, C.C. Hanfrey, P. Challis, A. Burkholz, S.R. Barnes, G.K. Rufener, M. Lee, P.D.S. Galigari // Theor. Appl. Genet. - 1995. - Vol. 91. - P. 195-199.
3. Gentzbittel, L. Development of a consensus linkage RFLP map of cultivated sunflower (Helianthus annuus L.) / L. Gentzbittel, F. Vear, Y.X. Zhang, A. Berville // Theor. Appl. Genet. - 1995. -Vol. 90. - P. 1079-1086.
4. Horn, R. Molecular mapping of the Rf1 gene restoring pollen fertility in PET1 - based F1 hybrids in sunflower (Helianthus annuus L.) / R. Horn, B. Kusterer, E. Lazarescu, M. Prüfe, W. Friedt // Theor. Appl. Genet. - 2003. - Vol. 106. - P. 599-606.
5. Kusterer, B. Molecular mapping of the fertility restoration locus Rf1 in sunflower and development of diagnostic markers for the restorer gene. Euphytica / B. Kusterer, R. Horn, W. Friedt. - 2005. -Vol. 143. - P. 35-43.
6. Feng, J. Introgression and molecular tagging of Rf4, a new male fertility restoration gene from wild sunflower Helianthus maximiliani L. / J. Feng, C.-C. Jan // Theor. Appl. Genet. - 2008. - Vol. 117. -P. 241-249.
7. Leclercq, P. Une sterilite male chez le tournesol / P. Leclercq // Ann. Amel. Plantes. - 1969. -Vol. 19. - P. 99-106.
8. Horn, R. Recombination: Cytoplasmic male sterility and fertility restoration in higher plants / R. Horn // Progress in Botany. - 2006. - Vol. 67. - P. 31-52.
9. Гаврилова, В.А. Доноры восстановления фертильности пыльцы линий ЦМС подсолнечника для гетерозисной селекции / В.А. Гаврилова, В.Т. Рожкова // Идентифицированный генофонд растений и селекция. - СПб: ВИР, 2005. - С. 377-389.
