CC BY
92
УДК 575.174.015.3+575.113.2
АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ВОЬА-ЭЯВЗ У СИММЕНТАЛЬСКОИ ПОРОДЫ
КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
О 2011 А.Л. Козлов, И.А. Смазнова, В.В. Заякин, И.Я. Нам
ГОУ ВПО «Брянский государственный университет им. акад. И. Г. Петровского», г. Брянск
Поступила 15.07.2011
Проанализирован аллельный полиморфизм гена ВоЬА-БИЗЗ в стаде крупного рогатого скота симментальской породы. Проанализирована связь некоторых аллелей с молочной продуктивностью. Не было выявлено корреляций между удойностью и аллелями устойчивости или чувствительности.
Ключевые слова: ВоЬА-ОКВЗ, симментальская порода, аллели устойчивости, аллели чувствительности.
На сегодняшний день проблема лейкоза крупного рогатого скота (КРС) является одной из наиболее актуальных в животноводстве. Это обусловлено в первую очередь значительными экономическими потерями, причиняемыми данным заболеванием. При этом за последнее десятилетие наблюдается значительный рост числа заболевших животных [1, 2]. Проблема усугубляется также и тем, что лейкоз КРС во многом является малоизученным заболеванием, безопасность которого для человека четко не установлена. Вирус лейкоза крупного рогатого скота (BJI КРС) относится к группе ретровирусов типа С и по своей организации очень похож на вирус, вызывающий лейкемию у человека. Известны случаи проявления клинических признаков лейкоза у овец, свиней и шимпанзе при заражении их BJI КРС [3]. Кроме того, традиционная селекционная работа направлена в основном на улучшение признаков, связанных с продуктивностью, тогда как признаки, ответственные за устойчивость к болезням, не учитывались. Это стало причиной увеличения подверженности животных заболеваниям, в частности лейкозу [4].
Главный комплекс гистосовместимости (ГКГ) является ключевым в организации иммунного ответа организма. Входящий в него ген BoLA-DRB3 определяет устойчивость животных к лейкозу. Он высокополиморфен и к моменту исследования известно более 90 его аллелей, из которых для трех установлена их связь с устойчвостью к лейкозу, а для четырех - с восприимчивостью [5,6].
В работах, проведенных ранее, показано различие в полиморфизме гена BoLA-DRB3 у различных пород КРС [7,8]. При этом устойчивость породы к лейкозу в целом определяется долей аллелей устойчивости в её генофонде.
Цель данного исследования - анализ полиморфизма второго экзона гена BoLA-DRB3 у
Козлов Александр Леонидович, e-mail:
alexander@biotechny.com; Смазнова Ирина Александровна, e-mail: irina.smaznowa@yandex.ru; Заякин Владимир Васильевич, докт. биол. наук, проф., e-mail: iyanaml@yandex.ru; Нам Ирина ЯнГуковна, докт. биол. наук, проф., e-mail: iyanaml@yandex.ru.
животных симментальскои породы в сравнении с айрширской и черно-пестрой, а также выявление связи его аллелей с молочной продуктивностью.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование было проведено на КРС симментальской породы из колхоза «Большевик» Старо дубского р-на Брянской обл. Всего проанализировано 77 особей.
ДНК животных выделяли из цельной крови коров согласно методике [9]. Для выявления различных аллелей гена ВоЬА-ЭЯВЗ использовали метод ПЦР-ПДРФ. Температурный профиль реакции для анализа полиморфизма гена ВоЬА-БКВЗ: денатурация ДНК - 94°С, 3 мин. - первый цикл, денатурация - 94 С, далее по 1 мин. Отжиг праймеров - 65°С, 1 мин., элонгация ДНК - 72°С, 60 сек. количество циклов - 28. Достраивание одноцепочечной формы ДНК - 72°С - 5 мин согласно [10, 11]. Рестрикция фрагмента гена ВоЬА-ЭЯВЗ длиной 284 п.о., полученного при амплификации, осуществлялась с помощью эндонуклеаз рестрикции Ква1, ВвЙУ и НаеШ. Продукты рестрикции анализировали
электрофорезом в 9% полиакриламидном геле.
Связь с молочной продуктивностью возможно было проследить только для тех аллелей, которые имели наибольшую частоту в выборке. При этом общая совокупность генотипов разбивалась на две. Первая была представлена генотипами гомозиготными в отношении анализируемого аллеля в сумме с генотипами, несущими данный аллель вместе с редкими нейтральными в отношении лейкоза аллелями, не вошедших в выборки других анализируемых аллелей. Вторая совокупность особей, большая по количеству, была представлена всеми остальными генотипами выборки, не несущими анализируемый аллель. Каждая совокупность была проанализирована на характер распределения с помощью теста Колмогоров а-Смирнова.
Статистическое различие между парами совокупностей оценивалось с помощью И-теста Манна-Уитни: при значении его р-уровня меньше 0,05 различие между совокупностями считалось статистически достоверным. Для оценки характера
Генетика
данного различия использовали среднее арифметическое. Все вычисления проводились с помощью пакета SPSS 15.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе исследования выявлено неравномерное распределение аллелей в выборке (табл. 1.).
Таблица 1. Частоты аллелей гена BoLA-DRB3 в исследованных стадах
№ алле ля Частота, % i Частота, % i Частота, % i
симментальская айрширская черно-пестрая
1 0.65 5.02 - - 0.79 2.91
2 0.65 5.02 1.06 4.30 0.79 2.91
3 0.65 5.02 - - 0.79 2.91
5 2.60 2.13 - - - -
6 - - - - 0.79 2.91
7 16,23 15.95 39,36 175. 42 2.38 0.89
8 7.14 0.13 1.06 4.30 9,52 6.16
9 3.90 0.89 - - - -
10 11,04 3.67 1.06 4.30 5.56 0.34
11 12,99 7.26 4.26 0.64 14,29 22.72
12 0.65 5.02 4.26 0.64 0.79 2.91
13 1.95 2.96 - - 2.38 0.89
14 - - - - 1.59 1.75
15 1.95 2.96 3.19 1.50 6.35 0.92
16 11,69 4.73 2.13 2.72 1.59 1.75
18 5.84 0.03 - 2.72 - -
19 - - 4.26 0.64 0.79 2.91
20 1.95 2.96 2.13 2.72 5.56 0.34
22 2.60 2.13 - - 6.35 0.92
23 - - 8.51 0.82 15,08 26.49
24 10,39 2.74 9,57 1.77 13,49 19.23
25 0.65 5.02 6.38 0.00 0.79 2.91
26 - - - - 0.79 2.91
28 1.30 3.92 8,51 0.82 3.97 0.03
30 - - - - 1.59 1.75
32 1.30 3.92 - - - -
33 1.95 2.96 - - - -
36 0.65 5.02 2.13 2.72 3.97 0.03
46 0.65 5.02 - - - -
53 0.65 5.02 - - - -
составила 12,99%, *16 - 11,69%, *24 - 10,39%. Довольно высока доля нейтральных аллелей: *7 -16,23%, *10 - 11,04%. Что касается остальных нейтральных аллелей, то их частота значительно ниже.
Распределение аллелей различно среди разных пород, что возможно связано с различным их происхождением. Для симментальской породы характерно наличие ряда аллелей, не присутствующих у других пород: *5, *9, *32, *33, *46, *53. Профиль аллелей связанных с устойчивостью к лейкозу также различен среди пород. Для исследованной выборки симментальской породы характерна высокая частота аллелей чувствительности. В то же время ввиду доминантного характера наследования аллелей устойчивости [12] важно то, в каком состоянии находятся аллели. Диаграмма, отображающая распределение аллелей по генотипам, представлена на рис.
Черно-пестрая
Рис. Соотношение генотипов устойчивых, нейтральных и чувствительных к вирусу лейкоза животных в изученных стадах
Ввиду сложной структуры главного комплекса гистосовместимости, интересным является проанализировать связь между полиморфизмом гена ВоЬА-ЭЯВЗ и удойностью. В работах, посвященных исследованию структуры ГКГ, отмечается сцепление между различными локусами этого региона [13, 14]. Некоторые исследователи отмечают связь между отдельными аллелями и параметрами молочной продуктивности [15].
Таблица 2. Связь продуктивностью
аллелей
молочной
Прим.: 1) аллели устойчивости, 2) аллели чувствительности
Для сравнения приведены данные полученные нами ранее для айрширской и черно-пестрой пород. Наибольшей частотой для симментальской породы характеризуются аллели *7, *10, *11, * 16, *24. Из них аллель *11 относится к аллелям устойчивости, * 16, *24 - чувствительности, а *7 и *10 являются нейтральными. Частота аллеля *11
№ аллеля М±т о2 Р- Манна-Уитни п
7 3954,9±90 80407.2 0.929 10
10 4010.4±167 139336.3 0.811 5
11 4011,33±122 134923.0 0.679 9
16 4008.77±133 230928.2 0.950 13
24 3777,4±31 4778.8 0.121 5
В представленной выборке симментальского скота были выбраны несколько совокупностей генотипов, несущих анализируемый аллель. Данные анализа представлены в таблице 2. В ходе проведенного анализа не было выявлено каких-
либо корреляций между удойностью и наличием определенного аллеля.
Таким образом, проведенное исследование показало необходимость учета аллелей гена BoLA-DRB3.2 при организации племенной работы, т.к. в проанализированных стадах довольно высоко содержание аллелей чувствительности к лейкозу одновременно с низкой долей аллелей устойчивости.
Проведенный анализ связи между молочной продуктивностью и полиморфизмом исследуемого участка не выявил статистически значимых корреляций.
Работа выполнена при поддержке грантов ФЦП № 02.740.11.0285, АВЦП № 2.1.1/224 и гранта администрации Брянской области № 215.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гулюкин М.И., Симонян Г.А., Замараева Н.В. и др. Научные основы профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота // Труды ВИЭВ. 1999. Т. 72. С. 38-47.
2. Коровин Р.Н., Богданов А.И., Борисенкова А.Н. Построение обобщенного показателя оценки эпизоотической ситуации // Доклады РАСХН. 2002. Т. 2. С. 54-55.
3. Schwartz /., Levy D. Pathology of bovine leukemia virus // Vet. Res. 1994. V. 25. P. 521-536.
4. van Dorp R.T., Martin S.V., Shoukri MM. et al. Epidemiologic study of disease in 32 registered Holstein dairy herds in British Columbia // Can. J. Veterin. Res. 1999. V. 63. P. 185-192.
5. Harris A. L., George С R., Elizabeth L.G. Comparative organization and function of the major histocompatibility complex of domesticated cattle // Immun. Rev. 1999. V. 167. P. 145-158.
6. Mir sky M. L., Olmstead C., Da Y., Lewin H.A. Reduced bovine leukaemia virus proviral load in genetically resistant cattle//Anim. Gen. 1998. V. 29. P. 245-252.
7. Рузина M.H. и др. Полиморфизм гена BoLA-DRB3 у крупного рогатого скота монгольской, калмыцкой и якутской пород // Генетика. 2010. Т. 46. № 4. С. 517-525.
8. Сулимова Г.Е., Удина И.Г., Шайхаев Г.О., Захаров И.А. ДНК-полиморфизм гена BoLA-DRB3 у крупного рогатого скота в связи с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу // Генетика. 1995. Т. 31. № 9. С. 1294-1299.
9. Boom R., Sol C.J.A., Salimans МММ. Rapid and simple method for purification of nucleic acids // J. Clin. Microbiol. 1990. V. 28. P. 495-503.
10. van EijkM.J.T., Stewart-Haynes J.A., Lewin H.A. Extensive polymorphism of the BoPA-DRB3 gene distinguished by PCR-RFPP //Anim. Gen. 1992. V. 23. P. 483-496.
11. Xu A., Van EijkM.J. Т., Park Ch., Lewin H.A. Polymorphism in BoPA-DRB3 exon 2 correlates with resistance to persistent lymphocytosis caused by bovine leukemia virus // J. Immunol. 1993. V. 151. P. 6977-6985.
12. Удина И.Г., Карамышева E.E., Туркова C.O., Орлова А. Р., Сулимова Г.Е. Генетические механизмы устойчивости и чувствительности к лейкозу у айрширской и черно-пестрой пород крупного рогатого скота, установленные на основе распределения аллелей генаBoPA-DRB3 //Генетика. 2003. Т. 39. С.383-396.
13. Beever J.E., Lewin НА., Barendse W. et al. Report of the first workshop on the genetic map of bovine chromosome 23 //Anim. Gen. 1996. V. 27. N 2. P. 69-75.
14. Leprovost F. Prolactin gene expression in ovine and caprine mammary gland // Neuroendocrinology. 1994. V. 60. P. 305-313.
15. Carlos Souza do Nascimento, Marco Antonio Machado, Mario Luiz Martinez. Association of the bovine major histocompatibility complex (BoPA) BoPA-DRB3 gene with fat and protein production and somatic cell scorein Brazilian Gyr dairy cattle (Bos indicus) // Gen. Mol. Biol. 2006. V. 29. №4. P. 641-647.
ANALYSIS OF GENE BOLA-DRB3 POLYMORPHISM IN SIMMENTAL CATTLE © 2011 A.L. Kozlov, I.A. Smaznova, V.V. Zayakin, I.Ya. Nam
Bryansk State University named by acad. I.G. Petrovsky, Bryansk
Gene BoPA-DRB3 polymorphism has been analyzed in Simmental cattle. Correlation between alleles and milk yield has been carried out. There wasn't found any correlation between milk production and resistance or susceptibility alleles.
Kew words: BoLA-DRB3, simmental cattle, stable alleles, sensitive alleles.
Kozlov Alexander Leonidovich, e-mail:
alexander@biotechny.com; Smaznova Irina Aleksandrovna, email: irina.smaznowa@yandex.ru; Zayakin Vladimir Vasilievich, Doctor of Biology, Professor, e-mail: iyanaml@yandex.ru; Nam Irina YanGukovna, Doctor of Biology, Professor, e-mail: iyanaml@yandex.ru
