CC BY
30
УДК 575:616.7:636.2
АЛЛЕЛЬНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА BOLA-DRB3.2 ПРИ НЕКРОБАКТЕРИОЗЕ КОРОВ УКРАИНСКОЙ ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ МОЛОЧНОЙ ПОРОДЫ
Т. М. СУПРОВИЧ, Р. В. КОЛИНЧУК
Подольский государственный аграрно-технический университет, г. Каменец-Подольский, Хмельницкая обл., Украина, 32316
(Поступила в редакцию 18.01.2018)
Приведены исследования на возможность использования аллелей гена BoLA-DRB3.2 у коров украинской черно-пестрой молочной породы,, в качестве ДНК-маркеров предрасположенности к некробактериозу.
Ключевые слова: корова, некробактериоз, главный комплекс гистосовместимости, аллели.
Researches on the possibly are given of using the alleles of the BoLA-DRB3.2 gene at cows of Ukrainian black-pied dairy cattle, as DNA markers of predisposition to necrobacteriosis.
Key words: cow, necrobacteriosis, major histocompatibility complex, alleles.
Введение. Некробактериоз крупного рогатого скота полиэтиологическое заболевание, которое вызывает существенные экономические потери в молочном скотоводстве. В Украине распространение данного заболевания происходит именно в племенных хозяйствах, где содержатся высокопродуктивные животные. Причины некробациллезу коров имеют многофакторный характер: нарушение норм кормления или изменение ее типов, неблагоприятные условия содержания животных, закупка скота из европейских государств с целью улучшения молочных качеств коров местных пород. Эпизоотологический мониторинг последних лет по некробактерио-зу крупного рогатого скота показал значительное распространение на территории страны именно из-за импорта животных [2, 3, 5].
Лечебно-профилактическим мероприятиям при некробактериозе коров посвящено значительное количество работ. В последнее время стала очевидна необходимость разработать методические подходы и получить достоверные критерии, позволяющие оценить генетическую предрасположенность животного к данному заболеванию.
Анализ источников. Гены класса II главного комплекса гистосовместимости наиболее вовлечены в ассоциации к заболеваниям. Функции антигенов класса II заключаются в том, чтобы представить чужеродные белки (после внутриклеточного процессинга) Т-клеткам, которые стимулируют соответствующий иммунный ответ гуморального типа. Методом ПЦР-ПДРФ описано 54 аллеля одного из наиболее полиморфных генов класса II BoLA-DRB3. Высокое аллельное разнообразие данного гена обу-
словлено необходимостью связывания широкого спектра чужеродных антигенов [6].
Аллели второго экзона гена BoLA-DRB3 в качестве ДНК-маркеров, часто используются в популяционных исследованиях для изучения биоразнообразия крупного рогатого скота. Наибольшее же распространение они получили в связи с поиском ассоциаций «аллель - заболевание». Установлены аллели тесно связаны с лейкозом [4,7, 12], маститом [8, 13], содержанием соматических клеток в молоке [9,10]. Изучаются связи между геном BoLA-DRB3 и менее распространенными болезнями КРС: ящуром [11], клещевыми заболеваниями, тейлериозом, туберкулезом [14]. Активно проводятся исследования влияния гена BoLA-DRB3.2 на хозяйственно полезные признаки КРС [1].
Целью представленной работы было определить аллельный полиморфизм гена BoLA-DRB3.2 в популяции коров украинской черно-пестрой молочной породы и выявить аллели, ассоциированные с устойчивостью и восприимчивостью к некробактериозу.
Материал и методика исследований. Исследование проведено в племенном хозяйстве «Казацкая долина 2006» Дунаевецкого района Хмельницкой области. Диагностирование заболевания некробактериозом устанавливалось на основании эпизоотологических, клинических и пато-логоанатомических данных и результатов лабораторных исследований. Аллельный спектр экзона 2 гена BoLA-DRB3 изучали с использованием ПЦР. Выделение ДНК проводили с применением наборов «DIAtom TMN APRep 200» фирмы ООО «Лаборатория Изоген» в соответствии с требованиями производителя. Амплификации фрагмента BoLA-DRB3.2 проводили в два этапа (VanEijketal, 1992; Сулимова и др., 1995) с использованием набора «GenePak TM PCR Core» (IsogeneLab.Itd., Москва). Использовали праймеры: первый раунд HLO-30 и HLO-31, второй раунд - HLO -30 и HLO -32.
Характеристика праймеров:
HLO -30 (5'-3': TCCTCTCTCTGCAGCACATTTCC);
HLO-31 (5'-3': ATTCGCGCTCACCTCGCCGCT),
HLO-32 (5'-3': TCGCCGCTGCACAGTGAAACTCTC) [5, 12].
Рестрикционный анализ продуктов амплификации проводили с использованием эндонуклеаз Rsal, HaelII и BstYI (XhoII). Продукты реакции разделяли с помощью электрофореза в 4 % агарозном геле (TopVision ™ LE GQ agarose, Fermentas, Литва) в присутствии бромистого этидия (5 мМ / мл) и тестировали в УФ-свете (рис.1).
Сравнение ДНК-паттернов, полученных с использованием трех рест-рикционных эндонуклеаз RsaI, HaeIII и BstYI, позволяет идентифицировать 54 аллеля гена BoLA-DRB3.
Подсчет частот аллелей проводился с учетом количества гомозигот и гетерозигот, найденных по соответствующему аллелю по формуле:
р _2Ы1+Ыг, ' ' '
' 2п
где N1 и N2 - соответственно, число гомозигот и гетерозигот для исследуемого аллеля;
п - объем выборки.
bd bb ab
Haelll
bb bb ab
Xholl
28 29 30 М
» 300
200
150
100
75
50
пд nf In
RsaI
Рис. Фрагменты электрофореграмм продуктов амплификации экзона 2 гена BoLA-DRB3 полученных из образцов ДНК коров украинской черно-пестрой молочной породы при помощи рестриктаз HaeIII, XhoII и RsaI: М - маркер молекулярной массы фирмы «GeneRuler™ UltraLowRange DNA Ladder» фiрми «Fermentas», Литва. Указаны: внизу варианты ДНК-паттернов; вверху - номера образцов
Критерий соответствия указывает на статистически значимую разницу между частотой нахождения рассматриваемого BoLA - аллеля антигена среди больных и здоровых животных и определяется по формуле: , _ N (ad — be)' .
(а + b)(a + c)(b + d)(c + d) где N - число аллелей; а - восприимчивые к заболеванию животные имеющие аллель; b - резистентные к заболеванию животные носители аллеля; с - восприимчивые к заболеванию животные без аллеля; d - резистентные к заболеванию животные, у которых нет аллеля.
Наличие ассоциации между заболеванием и геном обнаруживали на основе сравнения частот аллелей у больных и здоровых коров. Показателем различия частот определения аллелей в группах восприимчивых и устойчивых к некробактериозу животных служит величина относительно-
го риска ЯЯ. Она показывает во сколько раз риск развития заболевания является большим в случае присутствия в генотипе аллеля, чем при его отсутствии. При расчетах относительного риска использовано формулу:
Ъс
Результаты исследований и их обсуждение. Изучение аллельного разнообразия проведено на поголовье из 114 коров. По результатам исследования установлено, что в общей группе животных определяется 32 аллеля (средняя частота 3,57 %) из 54 описанных методами ПЦР-ПДРФ для гена BoLA-DRB3.2 (табл. 1).
Таблица 1. Частоты аллелей BoLA-DRB3.2 у коров украинской черно-пестрой молочной породы
ВоЬА^ЯВ3.2 Частота определения аллелей ВоЬА-DRB3.2 Частота определения аллелей
все стадо здоровые больные все стадо здоровые больные
*01 0,009 0,014 0 *20 0,009 0,007 0,012
*02 0,018 0,021 0,012 *21 0,013 0,021 0
*03 0,053 0,077 0,012 *22 0,079 0,106 0,035
*04 0,018 0,021 0,012 *23 0,044 0,021 0,081
*06 0,004 0,000 0,012 *24 0,180 0,169 0,198
*07 0,044 0,042 0,047 *25 0,004 0 0,012
*08 0,061 0,063 0,058 *26 0,022 0,028 0,012
*10 0,061 0,063 0,058 *28 0,075 0,085 0,058
*11 0,009 0,014 0,000 *31 0,004 0,007 0
*12 0,026 0,035 0,012 *32 0,022 0,021 0,023
*13 0,035 0,042 0,023 *36 0,031 0,042 0,012
*14 0,009 0,000 0,023 *37 0,035 0,028 0,047
*15 0,018 0,021 0,012 *41 0,004 0,007 0
*16 0,053 0,007 0,128 *42 0,009 0,007 0,012
*18 0,018 0,007 0,035 *48 0,018 0,021 0,012
*19 0,009 0 0,023 *51 0,009 0 0,023
Достаточно широкий аллельных спектр, который наблюдается в исследованном стаде коров, основывается на особенностях создания отечественной породы. В породе присутствуют генотипы нескольких отродий голландской, эстонской, литовской, черно-пестрой московской и других селекций, а на заключительном этапе формирования состоялась и продолжается масштабная голштинизация скота. Поэтому наличие 32 аллелей гена BoLA-DRB3, определенная в общей выборке, вполне соответствует генеалогии данной породы. С частотой выше 5 % в общей популяции выявлялось 7 аллелей. Наиболее распространенным оказался аллель BoLA-DRB3.2 *24, носителями которого являются 18 % животных. Также часто определялись аллели *22 (7,9 %) и * 28 (7,5 %). Порог в 5 % превысили аллели BoLA-DRB3.2 *08 и * 09 (по 6,1 %), *03 и *16 (по 5,3 %). Реже всего, с частотой менее 0,4 %, выявлялись аллели *06 *25 *31 и *41.В группе здоровых коров чаще всего определялись аллели BoLA-DRB3 *24
(16,9 %), *22 (10,6 %), *28 (8,5 %), *03 (7,7 %), *08 и *10 (6,3 %). Совсем в этой выборке не выявлены следующие аллели: *06, *14, *19, *25 и *51.
У больных некробактериозом животных наиболее распространенными оказались аллели *24 (19,8 %), *16 (12,8 %), *23 (8,1 %), *8, *10 и *28 (по 5,8 %). Совсем отсутствовали аллели: *1, *11, *21, *31 и *41. С помощью биометрических показателей, критерия соответствия (%2) и относительного риска заболеваемости (RR) выявлены аллели BoLA-DRB3.2, которые ассоциируются с резистентностью и заболеваемостью исследованного стада животных некробактериозом (табл. 2).
Таблица 2. Биометрические показатели аллелей BoLA-DRB3.2 коров украинской черно-пестрой молочной породы в связи с заболеваемостью некробактериозом
Аллели Частота Р(А) Критерий соответствия I2 Риск заболеваемости ЕЕ Проверка достоверности по х2
(а+Ъ> (а+с)/К (а+Ъ> (ъ+ауы (с+а> (а+с)/К (с+а> (ъ+аук
*01 0,009 1,233 -3,129 0,75 1,21 42,25 69,75
*02 0,018 0,285 0,54 1,51 2,42 41,49 68,51
*03* 0,053 4,93 -7,7 4,53 6,42 38,47 63,53
*04 0,018 0,285 0,54 1,51 2,42 41,49 68,51
*06 0,004 0,025 0,821 1,13 1,84 41,87 69,13
*07 0,044 0,024 1,111 3,77 6,05 39,23 64,77
*08 0,061 0,027 0,906 5,28 8,23 37,72 62,28
*10 0,061 0,027 0,906 5,28 8,23 37,72 62,28
*11 0,009 1,233 -3,129 0,75 1,21 42,25 69,75
*12 0,026 1,195 -3,182 2,26 3,53 40,74 67,26
*13 0,035 0,593 0,528 3,02 4,70 39,98 66,02
*14 0,009 0,266 1,683 1,51 2,49 41,49 68,51
*15 0,018 0,285 0,540 1,51 2,42 41,49 68,51
*16*** 0,053 16,62 24,1 4,53 8,53 38,47 63,53
*18 0,018 2,453 5,25 1,51 2,56 41,49 68,51
*19 0,009 0,266 1,683 1,51 2,49 41,49 68,51
*20 0,009 0,131 1,667 0,75 1,25 42,25 69,75
*21 0,013 1,866 -4,445 1,13 1,79 41,87 69,13
*22* 0,079 4,033 -3,571 6,79 9,32 36,21 59,79
*23* 0,044 4,862 4,407 3,77 6,58 39,23 64,77
*24 0,18 0,382 1,28 15,46 23,02 27,54 45,46
*25 0,004 1,666 5,047 0,38 0,63 42,62 70,38
*26 0,022 0,699 -2,507 1,89 2,98 41,11 67,89
*28 0,075 0,587 0,647 6,41 9,54 36,59 60,41
*31 0,004 0,611 0,54 0,38 0,61 42,62 70,38
*32 0,022 0,012 1,106 1,89 3,07 41,11 67,89
*36 0,031 1,743 -3,877 2,64 4,05 40,36 66,64
*37 0,035 0,552 1,718 3,02 4,98 39,98 66,02
*41 0,004 0,611 0,54 0,38 0,61 42,62 70,38
*42 0,009 0,131 1,667 0,75 1,25 42,25 69,75
*48 0,018 0,285 0,54 1,51 2,42 41,49 68,51
*51 0,009 0,266 1,683 1,51 2,49 41,49 68,51
По критерию относительного риска значимые ассоциации с восприимчивостью или устойчивостью к некробактериозу имеют 11 аллелей. На связь с заболеваемостью (RR > 2) указывают 4 аллеля, а именно: *16 (24,1), * 18 (5,25), * 25 (5,04) и * 23 (4,41). Значимые по критерию х2 есть четыре аллеля BoLA-DRB3.2, которые имеют достаточный уровень достоверности для исследованных биологических объектов. Уровень доверительной вероятности исследования Р = 0,999 проявляет аллель *16 (16,6). Три аллеля имеют минимальный порог достоверности P = 0,95: *03 (4,93), *23 (4,86) и *22 (4,03). На устойчивость к некробактериозу (RR < -2) указывают 8 аллелей: *3 (- 7,7), *21 (- 4,44), * 36 (- 3,87), *22 (- 3,57), *12 (3,18), *1, *11 (- 3,13) и * 26 (- 2,51).
Ассоциированным с заболеванием считается аллель, для которого выполняется условие RR > 2 и х2 > 3,8. Всего насчитывается 2 таких аллеля: *16 ^ = 24,1; х2 = 16,6), *23^ = 4,41; х2 = 4,86). По риску заболеваемости аллели *18 (5,25) и * 25 (5,08) проявляют себя также связанными с заболеванием. Но у них уровень достоверности не соответствует действительности (2,45 и 1,66 соответственно).
Ассоциированным с резистентностью к заболеванию считается аллель, для которого выполняется условие RR < -2 и х2> 3,8. Таких обнаружено также 2 аллеля; *03 ^ = -7,7; х2 = 4,93) и *22 ^ = -3,57; х2 = 4,03). Аллели *01, *11, *12, *21, *26 и *36 по риску заболеваемости также указывают на резистентность коров, но эти значения не являются достоверны.
Заключение. Таким образом, изучение распределения аллелей гена BoLA-DRB3 в группе здоровых и больных некробактериозом коров украинской черно-пестрой молочной породы позволило выявить два аллеля (*16 и *23), которые имеют тесную связь с восприимчивостью и два аллеля (*03 и *22), которые ассоциируются с резистентностью к данному заболеванию. Учитывая то, что исследования проводились непосредственно на ДНК крови животных, обнаруженные аллели BoLA-DRB3 целесообразно использовать как ДНК-маркеры при анализе склонности или устойчивости коров данной популяции к некробациллезу.
ЛИТЕРАТУРА
1. Горковенко, Л. Г. Взаимосвязь генотипа по локусу ВоЬА DRB 3 главного комплекса гистосовместимости крупного рогатого скота с молочной продуктивностью / Л. Г. Горковенко, Н. В. Ковалюк, В. Ф. Сацук // Вестник РАСХН. - 2007. - № 3. - С.73-74.
2. Особливосп профилактики некробактерюзу у кор1в / М. В. Демчук [та ш.] // Науковий вюник ЛНУВМБТ ¡меш С. Г. Гжицького,- Т.12,- № 2 (44). - 4.1. - 2010. - С.74-81.
3. Мошторинг некробактерiозу, основний видовий спектр мжробних асоцiацiй за учасп Б. песгорЬогит та специфичш засоби профшактики / О. М. Жовшр [та ш.] // Ветеринарна бютехнолопя. - №27. -2015. - С. 112-121.
4. Ковалюк, Н. В. Наследственная предрасположенность к лейкозу у крупного рогатого скота и методы её выявления / Н. В. Ковалюк, О. В. Шумейко // Сборник научных трудов
КРИА. - Краснодар, -2008,- №17,- С. 83-93.
5. Ставецька Р. Голштишзащя: коли зупинитися / Р. Ставецька // Тваринництво Украши. -2015,-№5.-С. 10-14.
6. Сулимова, Г. Е. ДНК-маркеры в изучении генофонда пород крупного рогатого скота / Г. Е. Сулимова // Генофонды сельскохозяйственных животных: генетические ресурсы животноводства. - М. : Наука, 2006. - С.138-166.
7. ДНК-полиморфизм гена BoLA-DRB3 у крупного рогатого скота в связи с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу / Г.Е. Сулимова [и др.] // Генетика. - 1995. -Т. 31. -№ 9,- С. 1294-1299.
8. Супрович, Т. М. Розподш алелiв гена BOLA-DRB3.2 у ко^в украшсько!' червоно-рябо1 молочно!' породи в зв'язку i3 маститами / Т. М. Супрович // Тваринництво Украши. -2015. -№11. - С. 14-19.
9. Association between BoLA-DRB3 and somatic cell count in Holstein cattle from Argentina / L.R. Baltian, M.V. Ripoli, S. Sanfilippo, S.N. Takeshima, Y. Aida, G. Giovambattista // Mol Biol Rep. -2012. -№39(7). - P. 7215-7220.
10. Dietz A.B. Bovine lymphocyte antigen class II alleles as risk factors for high somatic cell counts in milk of lactating dairy cows / A.B. Dietz, N.D. Cohen, L. Timms, M.E. Kehrli // J. Dairy Sci.- 1997,-№80(2).- P. 406^112.
11. Association of BoLA-DRB3 alleles with variability in immune response among the crossbred cattle vaccinated for foot-and-mouth disease (FMD) / Gowane G.R., Sharma A.K., Sankar M., Narayanan K., Das В., Subramaniam S., Pattnaik B. // Res. Vet. Sci. - 2013. - P.156-163.
12. Major Histocompatibility Complex-Associated Resistance to Infectious Diseases: The Case of Bovine Leukemia Virus Infection / S.E. Gutiérrez, E.N. Esteban, C.M. Ltitzelschwab and M.A. Juliarena // In book: Trends and Advances in Veterinary Genetics. - 2017. P. 101-126.
13. Rupp, R. Association of bovine leukocyte antigen (BoLA) DRB3.2 with immune response, mastitis, and production and type traits in Canadian Holsteins / R. Rupp, A. Hernandez and B. A. Mallard // J. Dairy. Sci. - 2007. - Vol. 90. - № 2. - P. 1029-1038.
14. Association of BLV infection profiles with alleles of the BoLA-DRB3.2 gene / M.A. Juliarena, M. Poli, L. Sala, С. Ceriani, S. Gutierrez, G. Dolcini, E.M. Rodriguez, B. Marino, C. Rodnguez-Dubra, E.N. Esteban // Animal genetics. - 2008. - P. 432-439.
