АНАЛіЗ ОКРЕМИХ ГРУП МіКРООРГАНіЗМіВ, ВИДіЛЕНИХ іЗ АТЕРОСКЛЕРОТИЧНО ЗМіНЕНИХ КОРОНАРНИХ АРТЕРіЙ ХВОРИХ, В ЗАЛЕЖНОСТі ВіД 896 A/G ПОЛіМОРФіЗМУ ГЕНА TLR4 Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Том 17. N 3-4 2013 р.

© Скочко О. В., Веснша Л. Е., Боброва Н. О., Шликова О. А., Мамонтова Т. В., 1змайлова О. В., Кайдашев I. П. УДК 616.132.2-004.6-008.87-092

АНАЛ1З ОКРЕМИХ ГРУП М1КРООРГАН13М1В, ВИД1ЛЕНИХ 13 АТЕРОСКЛЕРОТИЧНО ЗМ1НЕНИХ КОРОНАРНИХ АРТЕР1Й

ХВОРИХ, В ЗАЛЕЖНОСТ1 В1Д 896 A/G ПОЛ1МОРФ1ЗМУ

*

ГЕНА TLR4

Скочко1 О. В., ВеснНа2 Л. Е, Боброва2 Н. О., Шликова О. А., Мамонтова2 Т. В., 1змайлова О. В., Кайдашев11. П. 1 Кафедра внутршньоТ медицини №3, 2НД1 генетичних та !мунолопчних основ розвитку патологи та фармакогене-тики Вищого державного навчального закладу УкраТни «УкраТнська медична стоматолопчна академ1я», м. Полтава, УкраТна

Изучены образцы коронарных сосудов, полученные при аутопсии 31 умершего от ишемической болезни сердца (ИБС) и 5 здоровых людей. Пародонтопатогенные микроорганизмы обнаружены в 83,9%. В 51,6% случаев выявлялось 2 и более микроорганизмов. У больных, умерших от ИБС, достоверно чаще встречалась аллель 896 G гена TLR4 (р=0,04), ОШ 2,92 (1,15-7,41). Наличие в генотипе индивидуумов полиморфного аллеля G гена TLR4 определяет повышенную контаминацию тканей бляшки представителями следующих видов: Lactobacillus sp.,Enterobacterium sp., Sneathia sp. /Leptotrihia sp. /Fusobacterium sp.,MobiUuncus sp. /Corynebacterium sp.,Peptostreptococcus sp. Полученные результаты подтверждают возможное участие указанных групп микроорганизмов в патогенезе атеросклероза, а также роль полиморфного варианта гена TLR4 в повышенной микробной контаминации тканей коронарных артерий.

Ключевые слова: пародонтопатогенные микроорганизмы, атеросклероз, полиморфизм, Toll-подобный рецептор 4.

Дослщження останшх роюв переконливо довели, що в основ! патогенезу атеросклерозу лежить хроыч-ний запальний процес, що призводить до пошкоджен-ня ендотел1ю та формування в ст1нц1 артерм атеро-склеротичних бляшок. Тому, все бтьше уваги придь ляеться Ыфекцшним агентам, як можливим етюлопч-ним факторам ¡н1ц1ац1Т та прогресування атерогенезу [3, 7].

Актуального значення набувае концепц1я У^ацп процес1в атерогенезу при взаемодп екзогенних i ендо-генних мiкробних лiгандiв з Toll-подiбними рецепторами (TLRs). Генетична мшливють TLR може визна-чати вщмшносп в сприйнятливост органiзмiв до бак-терм та вiрусiв, штенсивност запального процесу [9].

Метою даноТ роботи стало встановити присутнють окремих груп мiкроорганiзмiв, в тому чи^ парадонто-патогенних, в атеросклеротичнш бляшцi i навколиш-нiх тканинах та залежнiсть рiвня мiкробного обаме-нiння вiд полiморфiзму 896A/G гена TLR4 (rs4986790), а також виявити можливий зв'язок розвитку атеросклерозу i 896 A/<A/G полiморфiзму гена TLR4 у хво-рих на iшемiчну хворобу серця (1ХС).

Матерiали та методи дослщження

Дослщжено 31 зразок аутопсiйного матерiалу тканин коронарних артерiй померлих внаслщок 1ХС, що отриманi у асептичних умовах. Контрольну серю склали зразки вщ 5 померлих без 1ХС. Дослiдження проводили з дозволу комiсiТ з бiоетики Вищого державного навчального закладу УкраТни «УкраТнська медична стоматолопчна академiя».

Видтення ДНК з тканини проводили лiзуючим методом з використанням набору для видтення ДНК з бюпта^в «Хелкопол» (НПФ «Лтех», Москва) та отри-мували розчин ДНК, який використовували для пода-льшого якюного визначення пародонтопатогенiв. Якь сне визначення ДНК пародонтопатогенних мiкроорга-нiзмiв (Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Treponema denticola, Bacteroides forsythus) проводили методом полiмеразноT ланцюговоТ реакцiT (ПЛР). Специфiчну дiлянку ДНК амплiфiкували на амплiфiкаторi «Тер-цик» («ДНК-Технологiя», Москва) з використанням специфiчних мультиплексних ол^онуклеотидних праймерiв, використовуючи набiр «МультиДент» (ТОВ НВФ «Гентех», Росiя). lдентифiкацiю ДНК проводили за допомогою електрофорезу в 2% агарозному гел^ забарвленому ет^фумом бромiдом з наступною вiзуа-лiзацieю в УФ свiтлi i фотографуванням. Отриманий розчин ДНК використовували для подальшоТ ктькю-ноТ оцiнки бюти в дослiджуваних зразках, яку проводили методом мультиплексноТ ПЛР в режимi реального часу на детектуючому амплiфiкаторi ДТ-322 (НВО «ДНК-Технолопя», Москва) за допомогою набору реа-гентiв «Фемофлор» («ДНК- Технологiя», Москва), що дозволяе визначати такi показники, як загальна бак-терiальна маса i мiкроорганiзми / групи мiкроорганiз-мiв: Lactobacillus sp., Enterobacteriaceae, Streptococcus sp., Staphylococcus sp., Gardnerella vaginalis / Prevotella bivia / Porphyromonas sp., Eubacterium sp., Sneathia sp. / Leptotrihia sp. / Fusobacterium sp., Megasphaera sp. / Veillonella sp. / Dialister sp., Lachnobacterium sp. / Clostridium sp., Mobiluncus sp. /

* Цитування при атестаци кадрiв: Скочко О. В., Веснна Л. Е., Боброва Н. О., Шликова О. А., Мамонтова Т. В., 1змайлова О. В., Кайдашев I. П. Анализ окремих груп м1кроорган1зм1в, видлених iз атеросклеротично зм1нених коронарних артер1й хворих, в залежностi вiд Asp299Gly полiморфiзму гена TLR4 //Проблеми екологп iмедицини. - 2013. - Т. 17, № 3-4. - С. 56 -58.

Проблеми екологц та медицини

Corynebacterium sp., Peptostreptococcus sp., Atopobium (At.) vaginae, Mycoplasma (M.) (genitalium + hominis), Ureaplasma (urealyticum + parvum), Candida sp. Полiморфну дiлянку 896A/G гена TLR4 ам^фку-вали методом ПЛР з використанням спец^чних оль гонуклеотидних праймерiв.

Статистичну обробку отриманих даних проводили за допомогою стандартного пакету програм «STATISTICA 6.0» (StatSoft Inc., США). При порiвняннi показникiв i Тх взаeмозв'язкiв використовували непа-раметричн методи: критерiй Вiлкоксона, t-тест, внут-рiшньогруповi кореляцiТ i коварiацiТ. Статистично зна-чущими вважали вiдмiнностi при P <0,05. Порiвняння частот генотитв мiж дослiджуваними групами проводили шляхом аналiзу таблиць поеднання 3х2 за допомогою точного тесту Фшера. Для порiвняння частот варiантiв у незв'язаних групах обчислювали вщно-шення шансiв (ВШ) з визначенням 95% довiрчого ш-тервалу (Д1).

Результати дослiдження та ix обговорення

У вщповщност з метою дослщження нами були вивченi зразки аутопайного матерiалу тканин корона-рних артерш 31 пацiента, що померли вщ 1ХС, i 5 па-^ен^в, якi померли в результатi Ыших причин i не мали уражень коронарних артерй Аналiз 5 зразгав тканин коронарних артерiй пацiентiв, померлих вщ причин, не пов'язаних з атеросклерозом, показав вщ-сутнiсть мiкроорганiзмiв в судиннiй стiнцi.

При аналiзi наявностi основних пародонтопатоген-них мiкроорганiзмiв у тканинах атеросклеротичних

Розподл

бляшок коронарних артерiй виявлено присутнють хо-ча б одного з ммкрооргаызммв у 26 з 31 па^енпв, що склало 83,9%. Найчастiше виявлялися P. gingivalis -64,5%, T. denticola - 41,9%, A. actinomycetemcomitans -32,3%, менш часто виявлялись B. forsythus i P. intermedia - 12,9% i 6,5%, вщповщно. Слщ зазначити, що присутнiсть трьох мiкроорганiзмiв виявлялась в 22,6% зразгав. Переважали мiкробнi асоцiацií, утворе-н P. gingivalis, T. denticola, A. actinomycetemcomitans.

На наступному етап дослщження нами була ви-вчена частота виявлення полiморфного варiанту 896A/G гена TLR4 серед оаб полтавськоí популяци (n = 100) i серед па^енпв, померлих вiд 1ХС (n = 31). Частота розподiлу полiморфного варiанту гена TLR4 в обох групах вщповщала закону Хардi-Вайнберга (х2 Пiрсона з поправкою Йетса 0,79 i 2,67, вiдповiдно). При порiвняннi частоти генотипiв (табл. 1) нами вияв-лена тенденцiя до збтьшення частоти виявлення ге-нотипiв AG i Gg в групi па^енпв, померлих вiд 1ХС (р = 0,086). У вах зразках аутопси виявленi дослiджуванi групи мiкроорганiзмiв, за винятком At. vaginae i M. hominis i M. genitalium. Також встановлено, що серед померлих вщ 1ХС достовiрно частiше зустрiчалася алель G (р = 0,04), ВШ 2,92 (1,15-7,41) при 95% Д1.

У бюптатному матерiалi виявлено 15 зразюв з генотипом АА гена TLR4, 3 - з генотипом AG i 2 - з GG. Враховуючи низьку частоту алеля G, генотипи AG i GG були об'еднан в одну групу як носи алеля G.

Таблиця 1

частоти генотипе i алелей полiморфiзму 896A/G гена TLR4 серед oci6 полтавськоТ популяцп померлих eid (1ХС), % (n)

Ген, по-лiмор-фiзм Частота генотипу Група популярного контролю (n=100) Група померлих вщ 1ХС (n=31) р* Частота алеля Група попу-ляцмного контролю Група померлих вщ 1ХС х2 ™р- сона, df=1 ВШ (95% Д1) р**

TLR4 896A/G АА AG GG 90 (90) 9 (9) 1 (1) 77,42 (24) 16,13 (5) 6,45 (2) 0,086 А G 94,5 (189) 5,5 (11) 85,5 (53) 14,5 (9) 4,25 2,92 (1,157,41) 0,04

р - р/'вень значущост!', отриманий точним тестом Фш р - р/'вень значущост1, отриманий тестом х2 Згщно отриманих результат (табл. 2), у носив алеля G (AG i GG) був достовiрно бтьш високий вмют мiкробноí ДНК групи Lactobacillus sp. - 4,20 ± 0,62 про-ти 3,01 ± 0,14 у носив генотипу АА (р < 0,05), Enterobacterium sp. - 4,68 ± 0,87 проти 3,09 ± 0,17 (р < 0,05), Sneatia sp. / Leptotrichia sp. / Fusobacterium sp. -3,47 ± 0,60 проти 1,78 ± 0,16 (р < 0,05), Mobiluncus sp. / Corynebacterium sp. - 3,06 ± 0,46 проти 2,18 ± 0,10 (р < 0,05), Peptostreptococcus sp. - 3,08 ± 0,67 проти 2,00 ± 0,11 (р < 0,05). Для уточнення можливих мiкробних асо^ацм та ix взаемозв'язку з наявнютю або вщсутнь стю полiморфного варiанта TLR4 були дослiдженi внутрiшньогруповi кореляцií. Серед носiíв генотипу АА були виявлен позитивнi достовiрнi (р < 0,05) коре-ляцiйнi зв'язки мiж кiлькiстю ген-еквiвалентiв наступ-них пар: Lactobacillus sp. - Enterobacterium sp. (0,984877); Lactobacillus sp. -Staphylococcus sp.

(0,781613); Lactobacillus sp. -Eubacterium sp. (0,554622); Lactobacillus sp. -Mobiluncus sp. / Corynebacterium sp. (0,773681); Enterobacterium sp. -Staphylococcus sp. (0,793504) i Enterobacterium sp. -Mobiluncus sp. / Corynebacterium sp. (0,771553); Staphylococcus sp. -Eubacterium sp. (0,697129) i Staphylococcus sp. -Mobiluncus sp. / Corynebacterium sp. (0,613646). Серед носив алеля G (генотипи AG i GG) спостер^алися також достг^рш позитивы коре-ляци, за винятком вщсутност пари Lactobacillus sp. -Eubacterium sp. i появою нових: Lachnobacterium sp. / Clostridium sp. -Lactobacillus sp. (0,826326); Lachnobacterium sp. / Clostridium sp. - Enterobacterium sp. (0,854616); Lachnobacterium sp. / Clostridium sp. -Staphylococcus sp. (0,831228) i Lachnobacterium sp. / Clostridium sp. -Mobiluncus sp. / Corynebacterium sp. (0,909823).

7J

x 0)'

T3

o

H ti

I- 0

70 0 1

ti'

*

]B CD X

0 X

a

X

0)

Ol X

i 0)

s

CO "O

^ H cr a 2

X

0) OD

0 S

OD

ti X

0 CD

X

X

! 0 a

. CO

Ivs

2 0 1

x' X 2'

0 cn

X s i'

i cr

cr E

X

0 0 tl

H. CD

H

ti 0 0) i cr

T3 0 X 0 —1

CO OD 0

S

H T3

^ 0

CO

X I

O X

X

X a

CD

O -1

cn CD

X X

tl' CD

X H

0 ^ X

^ X

T3 0

o

"S ö -8-tl o

CD

Co

2

□J H 0)

H T3

X |\J X

CD CD 0 1 CD X

0 0 O 2' O X a

§12 s 0) T3 -& 0 "O

CO 5 H CO 2 0 X

0) i cr E -i 0) T3 X

CD 0) CD s

i X X X

CD 0 0)

2 CO 0) X 0)

00 H I- T3 H CD

CD OD 73

CD O ji. "O

St

■O H O H 0)

00 _ 0

CD K 0 T3

o> 0 cn 0

> s CO

OD OD

H |\J E S H

0) ^ "CD |\J 0 ^

2 T3 0) 1 £ X CD O X 0 X

X X cr 0)

0 0) i

2 0 0) CD

H i

ti E' CD CD s

i i H

a cr cr

^

CD

OD

X 0

CD H

CO

X CD

0)

X

CD OD

X T3

X 0)

a X

OD 0

OD

^

0) 5

H X

0 s

-1

CD T3

X CD

CD CO

CO

—

0) cr

H H

CD 0)

T3 H

O s

O X

^ 0)

CD E

T3 s

O X

H

s ti

X 0

X 0

0 i

-i

0 ti'

*

"O CD

0) X cr

Tl Tl CD £= "O W)

o ° ° O" 00.

o

0 of "O ^ t—h

o C

° =J O =5

O <" Q T5

(/) o -a H

J 0) CD

m x

CD 03

O S

CT S 0)

a1

® 3

00 s n X

o

09 X

"Ü o

1 II [D

H "o -5

Q) H 5

2 CD 5

III

5 s"

0) Q) H i H CD CD Q) i -a I Ü o s „ O

I o § g 3® ä 3

0)

CO i =s

cd "a 0) o g: o

03 ~~i 0)

(/> x

~P C

: cd "a

: 8 :■ O

CD T3 O H S X x o

■ -C £

CD

- £ o

=r a

o) m

CO

o

CO

Zl 5

§ 5

W X

I CD

0) I

-C S

0) g

m 1

^ 5 °

c ÜD "O

t S O

to o 5

1 3

0 o)

° P

1 -t*

X ro 0) =1 E'

-■ E

Si.

CD 2

EE 55' o "a H o

cr Ol §

-i —: CD x o

x i

CD S

CO OD

-g I

S CO

CD 0)

■a u

~~i to Ej o

□J "O

i ° s OD

2 CD

S tl

0ȣ

0) ±

0) I H X

o S

° I'

"-I 7=1

=1 O

3 -0)

2 EE

O Co

"8" öd o

1 I ^

" CO I- °

J— —a to CD Q) 2

X Q)

OD

=i 0)

o H 2ü X CD o 5 -a

x o o s "a o

ä S § S »-S

hi CD i X

So°

° "a co

£f I

q m g

ä ® s

■ oo ~ CD ^ CD

O

T3 0)

</> != 2.

jH m

s -C

OD 0) "a

cr "a

o x * CD

i -&

II C5-S'

! 2 O

; S H O

® S p-

H O 2

o m

-a i 2

0) 0) s

° "i CD

o "a H o

s o §

g-S

0. o

X =1 X

"a i

0 s C3\ X

8 §» §»1

OD "O

s H 0)

OD i

1 0" CD I

I o

O OD

2 a

Co

O13

< -L

ch o o

O =1 OD O 0) i i. g-

"S-S

SS-&

^ I' 0)

O

B o

0) cr

1 ■B--B-

o EE "a

ti o

0

1 ti

Si S

CD X ^

x ^ IB)» H I X CD ■ T3 I I O 0)

IP

X CD ti "a o) o I

CO

- "a

£ OD

O 2

0) I

x s § S

cö' 0)

— -a

Si

__OD

I 0)

CD 5

Co

X 0)

¡2 f > i\J

0) OD H

o "a od'

"D 0) x

E'

CD

x 0)

1 ° X x 0)

a\ ^ i od

o

O "§ CD

m u cd

0 CD ^

1 " U

s ?

3o

I > ZTT3 ^

O-O

k CD CQ 3- . £ — CD S. >

5 » i 2.» B Q. CD ■< Q. C «I'D 3 » 3 S. o o S ° - o .-

8-0 A I m o ■

ojl I S

\ (D •

(fi

0 w 0 co' H

cn 3"

5' 0) CD

CD

m X O 3 CO H

T3 ■< TT

CD

3 oT

3 U) g. CD

c '— 0

> S O CD

0 1 i 3"

0 0 T3 OS

O =! 0) 3

O) CD U)

<

O < "> >

> S CO T3

CO <' K)

Ca) CD CD cd

cd

z CO 0) CD

co <ä ■<

.' Q) O o

< S<9 Q. 3 O - CD CD

O CD — CD 00 ' CO

ZM|1) » O

10:

CD

0) U)' ro

o 3 Cj I —-a <n P NJffl = i

K).— Q) ™

K> != "jfe

' Q.^

=! ' C 0> ^ ¡.-CD ^

ro ^oN

II-

(D -i O o Q)

=! CD ^

0 S ,

1 Si1

0 rt- ft)

I

< O o

r? Ä O) 0) (Din

1 §•<

"D3 O

D)

cd -i ■ W O _. CO =! O

2. s

5'

3 ">

5; I

ai ro

J.S ai P 00 z

'T3 . 0) | Ss

(D

. CD CD O ^

1 ZJ ■ O

■ CO 1

'1 P <s

i I

. 0) C x —

■ E? : CD 0 3 0) "Z. CD ■

1 CO 0 CD 0 k>"3 ,

S '1 1 CO

O 0)

^ B> 5'

C =! 0)

! 8 S

— ^ W r1 J in L:

s 3

P- O s.

M — ° o

CD I

Q)

= "O

en o

3 CD

C/5 ^

- pa.3

o<«> i- = <

>1-< g p

D) O

ai

OE

CD

P I

I °-a CD Q) Op J2 ->■ > CD

o o Ö'

o

o,cr

00 o'

"zJff

Q)

o! » 1 0

- Q>

CD 3

Si <»

CD ^

U) !=

I Ö

3 ^

3 o

o a> rö <« o

c o

I Od-,

§<2.-0

I CD <0«?

° ö CD P>

"Dto 01

Q) w

3 5

Q) CD

o _. ° 3

T3 M O O 3.

—■ Q)

3 3

CD —

o

Q) Q>

3 s.

(/)' CD

3 " u>

■ u- 0 ->. -n =! U)

I c: 0 -'S» CD F^ 0

n = a>

m Q. m o o D) o

CD ^ (/)

CD ST D) N

N«13-

^ ^ Q) U) H -T3 S-r- I "O CD

^J "0 ■

ai

73

1° CD

O)

Z1

cn

ro0 2

O if ^ a)

"100 s cd m

Q) (DO) CO ■< ■

F

O 01 ^ >§§

Eil

S E o

0- x "o

1-0-&

O cn — ■ o — 00 01 ■—I

U1T3 —1

m iS

S 0) ^fcl'

is

s -

§0

SS-E

0 CD

x m s

S —

1 =1

Q

5

CD o — o

CD

< ai o N>

1 Q) o o

"5 D) U)

lo®

CD Q) CD

- s o^

ro I tl

CO

s

■o

^ CJ -J Q] Q) CD o 3

s 2 ^

g x ° tt 5 ■< T3 "

"E-t

8b>

0)

. en s —

0)

— o

> CD

. O 3

-is

S3 I

CD 0) (/)

P-^cn

', 3 0) CD

1 §"5-0

¿Sli

Ca)

K.O! 2>: ' :

1 Ei is :

^ ^ x

(-1

T3 H J= ^

s 0) CD 0)

0 H

H ^ 0

0) 0 ^ -1

X E T3 CD

X 0 X

a C31 CD

2 i CD Co

0) X H s X 0 OD S 2 s _o

C31 X OD

0' CD -n E

—1 s -8- P° 0

^ CD ^

od' 25 CD X ^ 0 ■

OD S X H

OD X a T3 CD

S OD Ol

X O

OD -1 CD

0) 0 X

X X s ^

x^ CD 2 E O tl

X CO x' 0)

p 2 O -& cr

CD E 0 -i

s - : 0

OD S x: OD ,

5" a-3- CD

CD =J

—5 i—t-

3 s'

CD O Q. Q) 0)' " H > g 0) o o

* 5= o

I1

Ä O

OD CD 0)

. CD S O =1

SÜ.

10 -K)

CDx I 61

CD K)

O OD

0) -C

X CD

0) x

■i-S

(/)

(/) 0) X

c

0)

Qy

o

I

a a o

^ —■

¡S *

o ^to

H X I

-a — ^

? OD OD

J=

S CD

- o

OD OD

H 0)

0 H

1 s

0 X

1 CD

— Co

m cd

"O

a ■Q A O O Pi

O ti O O sc

5 *

O CD

3 ^

H Q) O o

CD O X

s "S

CD

b ^ CQ ± S </> 5 .5

? < o

0) "O

AG+GG (n=5) AA (n=15) feHOTMnn

4.20± 0.62* 3.01 ± 0.14 Lactobacillus spp.

4.68± 0.87* 3.09± 0.17 Enterobacteriaceae

2.96± 0.33 2.38± 0.11 Streptococcus spp.

3.18± 0.64 2.44± 0.13 Staphylococcus spp.

3.50± 0.71 2.82± 0.19 Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp.

3.24± 0.45 2.84± 0.26 Eubacterium spp.

3.47± 0.60* 1.78± 0.16 Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp.

2.7± 0.45 2.08± 0.21 Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp.

2.9± 0.36 3.48± 1.06 Lachnobacterium spp./Clostridium spp.

3.06± 0.46* 2.18± 0.10 Mobiluncus spp./ Corynebacterium spp.

3.08± 0.67* 2.00± 0.11 Peptostreptococcus spp.

1.76± 0.10 1.74± 0.13 Ureaplasma (urealyticum+ parvum)

3.14± 0.10 3.03± 0.05 Candida spp.

-c

c g

o

1

■8

o

0) c

Q-

I 5 I "

3 3

3 CD

I'D

¡1

0 o

31 §1 Is

c S

CD I'

1 $ 0) I

¡S

o o

OJ I g-8 S|

O x •o

CD g

■S 3

i-s

a

0) 0)

i a Si !■§

sfeco N3