Анализ мутаций в гене BRAF в циркулирующей опухолевой ДНК с помощью биологических микрочипов Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

XXI РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС

ПОСТЕРЫ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель. Исследование влияния эпителиально-мезенхималь-ного перехода (ЭМП) на химиочувствительность клеток коло-ректального рака к стандартным препаратам, применяемым в клинической практике.

Материалы и методы. На первом этапе работы использованы стандартные клеточные линии колоректального рака человека НСТ116 и НТ29. Установление ингибирующих концентраций (IC50) для иринотекана, оксалиплатина и 5-фторурацила проводили с помощью МТТ-теста через 72 часа. Индукция ЭМП проводилась у HT29 с использованием StemXVivoTM EMT Inducing Media Supplement. Выявление экспресгаи маркеров ЭМП Е-кадгерина, Ki-67 проводили методом иммуноцито-химии. Миграцию клеток изучали по скорости «заживления» монослоя. На втором этапе проведено выделение временных клеточных культур из операционного материала. Для 14 временных культур была установлена химиочувствительность и степень выраженности ЭМП. Окрашивание парафиновых срезов опухолей пациентов на наличие Е-кадгерина проводили стандартными методами иммуногистохимии. Результаты. Установлено, что стандартные клеточные линии НСТ116 и НТ29 отличаются по чувствительности к исследуемым препаратам. Клеточная линия НСТ116 была более чувствительна ко всем препаратам по сравнению с НТ29 и имела признаки ЭМП. Индукция ЭМП у HT29 сопровождалась изменением морфологии клеток, а также усилением скорости миграции («заживление монослоя» у ЭМП-ндуцированной линии проходило в 3 раза быстрее), пролиферации (в 2,3 раза больше ki-67 позитивных клеток) и снижением экспрессии Е-кадгерина. По результатам оценки величины IC50 установлено увеличение химиочувствительности клеточной линии НТ29 в результате индукции ЭМП ко всем тестируемым препаратам. Также установлена более высокая химиочувстви-тельность временных культур клеток с признаками ЭМП, полученных из образцов опухолей пациентов. Наличие ЭМП у временной культуры коррелировало с экспрессией Е-кадге-рина в гистологическом срезе той же опухоли. Заключение. Таким образом, нами впервые была продемонстрирована зависимость химиочувствительности от ЭМП на стандартных клеточных линиях колоректального рака при индукции ЭМП in vitro и на временных первичных культурах клеток, выделенных из опухолей толстой кишки и метастазов в печень. Полученные данные указывают на потенциальную возможность использования Е-кадге-рина в качестве прогностического критерия химиочув-ствительности при выборе химиотерапии для пациентов с колоректальным раком. Работа поддержана РНФ (проект № 14-25-00129-П).

Улучшение ранней диагностики рака желудка

А. Ф. Лазарев'

Место работы: 'Алтайский филиал ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» Минздрава России, Алтайский государственный медицинский университет e-mail: [email protected]

Несмотря на внедрение новых методов обследования пациентов, в последние годы существенного улучшения ранней диагностики и снижения запущенности рака желудка не произошло. Это связано с тем, что многие методы, позволяющие обнаружить злокачественные новообразования желудка в самом начале своего развития, очень дорогостоящие и для массового применения недоступны, используемые же в рутинной практике выявить рак желудка в ранней стадии в большинстве случаев не могут. Нами предложен двух-

этапный подход к ранней диагностике раке желудка. На первом этапе осуществляется формирование группы пациентов с высоким или абсолютным (100%) онкологическим риском, а затем в ней проводится целевой углубленный поиск злокачественного новообразования желудка. Формирование группы высокого и абсолютного риска рака желудка проводится путем составления индивидуальной карты факторов риска данного заболевания у конкретного пациента, заполнением таблицы влияния этих факторов на развитие заболевания с последующим определением величины онкологического риска по оригинальной формуле. В качестве факторов риска рака желудка взяты все уже доказанные факторы для этого заболевания (отягощенная наследственность, особенности питания, наличие Helicobacter и др.). Определена степень влияния каждого (в баллах). Опытным путем на 10 000 больных злокачественными новообразованиями и 5 000 здоровых (контроль) установлено 6 уровней риска рака желудка: 0 уровень (риск отсутствует) — зарегистрирован у 17,35% в контрольной группе и у 0% больных раком желудка; I уровень (низкий) установлен у 51,1% в контрольной группе и у 7,45% больных; II уровень (пониженный) — 19,5% в контрольной и 14,9% больных; III уровень (среднепопуляционный) — соответственно 4,95% и 11,2%; IV (повышенный) — у 4% и 27,1 %; V (высокий) — у 2,8% и 19,1% и VI (абсолютный) не зарегистрирован в контрольной группе (0%) и обнаружен у 7,5% больных раком желудка. Мы рекомендуем включить во второй этап углубленных исследований пациентов, имеющих III—VI уровни риска, которые наблюдаются у более чем 80% больных раком желудка; в группе здоровых они зарегистрированы лишь у 10%. Предложенный метод позволил сформировать в КГБУЗ АКОД регистр предрака высокого риска (8 278), при углубленном обследовании выявлено 443 больных ЗН, из них с I—II стадией — 97,5%, в том числе при раке желудка — у 44. Данный подход позволит резко снизить контингент пациентов на дорогостоящие, углубленные исследования (в 10 раз) и повысить эффективность проводимых профосмотров.

Анализ мутаций в гене BRAF в циркулирующей опухолевой ДНК с помощью биологических микрочипов

М. А. Емельянова', Е. Н. Телышева2, Г. П. Снигирева2, О. О. Рябая3, К. В. Орлова3, И. С. Абрамов', Л. Г. Гукасян', А. С. Заседателев', Т. В. Наседкина'

Место работы: 'ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук; 2ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России; 3ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина» Минздрава России. e-mail: [email protected]

Цель. Меланома является одной из самых опасных форм рака за счет быстрого прогрессирования. Для ее лечения используют таргетные ингибиторы протеинкиназы BRAF и ее непосредственных эффекторов — MEK1/2. Данные препараты назначаются только пациентам с мутациями в гене BRAF, поэтому его предварительный молекулярно-генетический анализ является обязательным. Как правило, для исследования используется ДНК, выделенная из ткани опухоли, полученной в результате биопсии. Однако такой подход имеет ряд недостатков, прежде всего за счет инвазивности данной процедуры. Анализ циркулирующей опухолевой ДНК (цоДНК)

Злокачественные опухоли

www.malignanttumours.org

Том / Vol. 7 № 3 S 1 /2017

Malignant Tumours

www.malignanttumours.org

XXI РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС

ПОСТЕРЫ

ИНФЕКЦИИ

имеет большой потенциал в диагностике, прогнозе и последующем наблюдении за пациентами из-за низкой инвазивности и возможности быстро и без вреда для пациента проводить исследование.

Материалы и методы. Ранее нами был разработан биологический микрочип для анализа соматических мутаций в гене BRAF (V600E [c. 1799T>A], V600M, V600K, V600R, V600D, V600E [c. 1799_1800delTGinsAA]) в опухолевой ткани. В ходе данной работы он был адаптирован для анализа мутаций и в цоДНК. Для преимущественной амплификации мутант-ной ДНК на фоне избытка ДНК дикого типа использовали LNA-блокирующую ПЦР. Длина ПЦР-продукта составляла 74 п. о., что позволило успешно анализировать деградированную ДНК. Полученные ампликоны служили матрицей на втором этапе ПЦР, в результате которого получали одноцепочечный флуоресцентно-меченный ПЦР-продукт, который затем гибридизовали с аллель-специфичными олиногуклеотидами, иммобилизованными на биочипе. Метод был протестирован на 30 контрольных образцах ДНК, выделенных из опухолевой ткани, и 19 образцах цоДНК. Генотип контрольных образцов был предварительно определен секвенированием по Сенгеру. ЦоДНК была выделена из 2—5 мл плазмы, полученной от пациентов до хирургического вмешательства.

Результаты. Генотипы всех контрольных образцов были определены корректно. Также мы протестировали 19 образцов цоДНК у пациентов с метастатической меланомой с известным статусом BRAF: 12 опухолей были мутированы и 7 были WT. Мутации были обнаружены в 10/12 образцах цоДНК у пациентов, имеющих мутацию BRAF в опухоли, и ни в одном из 7 образцов цоДНК у BRAF WT пациентов. Метод позволяет детектировать мутацию, если ее доля в образце >0,2%. Заключение. Предложенный метод идентификации соматических мутаций в гене BRAF в цоДНК на основе технологии биочипов является эффективным и простым в применении. Работа выполнена при поддержке гранта президента Российской Федерации (# МК-2519.2017.4).

Изменение профиля экспрессии ключевых генов онкогенеза при различных стадиях колоректального рака

У. Станоевич',2, В. К. Боженко', М. В. Захаренко', И. Д. Тро-ценко2, Т. В. Крашихина2, В. А. Солодкий' Место работы: 'ФГБУ «Российский научный центр рент-генорадиологии» МЗ РФ, Москва, Россия; 2Кафедра онкологии и рентгенорадиологии медицинского факультета Российского университета дружбы народов, Москва, Россия e-mail: 8'5879'@gmail.com

Цель. Поиск молекулярно-генетических факторов прогноза клинического течения колоректального рака (КРР). Материалы и методы. Методом ПЦР в реальном времени проанализирован уровень экспрессии 64 генов, ответственных за пролиферацию, апоптоз, ангиогенез, адгезию, ремо-делирование межклеточного матрикса, маркеров и факторов врожденного и приобретенного иммунитета, рецепторов эстрогенов и прогестерона, ароматазы, в 261 образце ткани толстой кишки (132 образцах ткани опухоли и 129 образцах слизистой оболочки толстой кишки без морфологических признаков опухолевого роста (МНТ), полученных от тех же пациентов). Группы сравнения сформированы в зависимости от поставленной задачи: глубина инвазии первичной опухоли (Т1, Т2, Т3, Т4), наличие регионарных (N0, N+) и отдаленных

метастазов (М0, М+), прогрессирование заболевания. Средние сроки наблюдения — 31,4 ± 15,2 мес. Результаты. При определении уровня экспрессии изучаемых генов в зависимости от глубины инвазии не выявлено каких-либо достоверных изменений в группах Т1, Т2 и Т3 как в ткани опухоли, так и в МНТ, тогда как при уровне инвазии Т4 выявлено большое количество генов, достоверно (р<0,05) отличающих данную группу от остальных, как в ткани опухоли (CD56, ММР2, GNLY, 12, ВАХ, LIF, 17, CD45, ^4, SCUBE2, IL2Ra, 115, CD68, VEGFA165, 112а, LGALS1, 16, РАРРА, LIFR, CD69, СОХ-2), так и в МНТ ^СШЕ2, CD56, ВАХ, 115, РТЕ^ GNLY, LGALS1, LIF, 112а, РАРРА). При анализе экспрессии генов в сравниваемых образцах в зависимости от наличия пораженных лимфатических узлов обнаружена ассоциированность регионарных метастазов с повышением (р<0,05) экспрессии ССND1 и Р16 в ткани опухоли и повышением (р<0,05) К1 67 и снижением 16 в МНТ. Наличие отдаленных метастазов ассоциировалось с достоверным (р<0,05) изменением уровней экспрессии 12 из изученных 64 генов в ткани первичной опухоли (ВАХ, TGF-p, ^4, Р161, GNLY, GATA3, IGF1, 17, LIFR, CD45, 16, LIF) и Р14 и TGF-p в МНТ. Прогрессиро-

вание заболевания также характеризуется (р<0,05) изменением экспрессии большого количества генов в ткани опухоли (Р16, 17, 12, ВАХ, CD56, ММР11, 112а, ^4, CD45, GNLY, LIFR, 115, ММР2, ^а, CD69), а также МНТ (С^2, ССШ1, MYBL2, TERT, GREM1, CYP19A).

Заключение. Установлен профиль экспрессии генов, ассоциированный с глубиной инвазии, наличием регионарных и отдаленных метастазов и прогрессированием как в ткани самой первичной опухоли, так и в слизистой оболочке толстой кишки без морфологических признаков опухолевого роста больного КРР.

Стратегия лечения нозокомиальных инфекций, вызванных Enterococcus spp. (Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis) у онкологических больных

В. В. Агинова'

Место работы: 'ГБПОУ ДЗМ «Медицинский колледж №'», г. Москва

e-mail: in. [email protected]

Цель. Анализ резистентности энтерококков, вызывающих инфекционные осложнения у онкологических больных, к антибиотикам для определения стратегии их дальнейшего использования в клинике.

Материалы и методы. Проанализировано 1 419 штаммов энтерококков, выделенных от онкологических больных, имевших различные инфекционные осложнения в период 2014—2016 гг. Идентификация микроорганизмов и оценка их чувствительности к антибактериальным препаратам производилась с помощью современных автоматизированных систем: Vitek-2, WalkAway, MS MALDI TOF. Результаты. Общее количество E. faecalis и E. faecium снизилось с 489 штаммов в 2014 г. до 417 штаммов в 2016 г. (p<0,001). Число ампициллин-резистентных штаммов было минимальным для E. faecalis и составило 8%, что позволяет рассматривать аминопенициллины, в том числе ампицил-лин/сульбактам и амоксициллин/клавуланат, как препараты выбора для лечения инфекций, вызванных этим возбудителем. Напротив, почти все штаммы E. faecium были резистентны к ампициллину, за исключением 2016 г., когда их количество снизилось до 51,9%, оставаясь в целом

Злокачественные опухоли

www.malignanttumours.org

Том / Vol. 7 № 3 S 1 /2017

Malignant Tumours

www.malignanttumours.org