CC BY
269
УДК 617.711-002.152
Быкова Е.В., Соголовская Е.Е., Сотникова Т.О., ГабриэльТ.П.
Краснодарский филиал МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова
E-mail: nok@mail.ru
АНАЛИЗ ИЗМЕНЕНИЯ ФАКТОРОВ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ ОРГАНИЗМА ПРИ ВИРУСНЫХ ПОРАЖЕНИЯХ ГЛАЗНОЙ ПОВЕРХНОСТИ
Известно, что при аденовирусных конъюнктивитах, герпесе и других инфекционных заболеваниях в организме человека усиливается выработка специфических и неспецифических факторов защиты. К неспецифическим факторам относятся лизоцим (мурамидаза) и церулоплазмин, формирующие наряду с другими факторами, антибактериальную, антивирусную и антирадикальную защиту (АБЗ, АВЗ, АРЗ) организма. Аденовирусная инфекция вначале развивается в носоглотке, а затем по слезным каналам поднимается вверх, и в патологический процесс вовлекаются конъюнктива и слезный аппарат глаза. Вирус герпеса постоянно находится в организме человека в латентном состоянии и, периодически обостряясь, вызывает офтальмогерпес. Отдельные лекарственные средства, применяемые в офтальмологии для лечения вирусных инфекций (аденовирусного кератоконъюнктивита и офтальмогерпеса), обладают способностью ингибировать активность лизоцима (например, циклоферон, интерферон и полудан). Ферментная активность церулоплазмина зависит от химической структуры лекарственного средства и дополнительно введенных в его состав ингредиентов.
Ключевые слова: аденовирусный кератоконъюнктивит, офтальмогерпес, церулоплазмин, лизоцим, слезная жидкость.
Из воспалительных заболеваний глаза вирусной этиологии наибольшее распространение имеют аденовирусный кератоконъюнктивит (АВК) и офтальмогерпес (ОГ). Аденовирусная инфекция, по данным многих авторов, занимает 5-10 % от общего числа острых вирусных инфекций [8]. А офтальмогерпес составляет 60 % в общей структуре воспалительных заболеваний глаза [2].
Известно, что при аденовирусных конъюнктивитах, герпесе и других инфекционных заболеваниях в организме человека усиливается выработка специфических и неспецифических факторов защиты. К неспецифическим факторам относятся лизоцим (мурамидаза) и церулоплаз-мин, формирующие наряду с другими факторами, антибактериальную, антивирусную и антирадикальную защиту (АБЗ, АВЗ, АРЗ) организма. Несмотря на то, что лизоцим и церулоплазмин не действуют непосредственно на аденовирус и на вирус герпеса, изучение динамики их активности в клинике представляет большой интерес. Это связано с тем, что вирусы, проникая в клетку, способны в ней индуцировать биосинтез не только собственных белков, необходимых для построения новых вирусов, но и клеточных белков-ферментов (например, лизоцима) [2], [15].
В настоящее время средств этиотропной химиотерапии, специфического лечения аденовирусной и герпетической инфекции не су-
ществует. Стратегия патогенетической терапии при этих инфекциях зависит от локализации поражения и тяжести заболевания и не имеет каких-либо особенностей. При тяжелых формах болезни рекомендуется присоединение иммунотропной терапии: внутривенное введение нормального человеческого иммуноглобулина и препаратов интерферона [8], а также лизоцима [5].
Лизоцим (мурамидаза) - белок, состоящий из 127 аминокислотных остатков, с молекулярной массой около 15 кД. В состав активного центра и стабилизирующих его третичную структуру аминокислот входит 24 аминокислотных остатка [7]. Он относится к ферментам гидролазам, действующим на гликозидную связь между остатками мурамовой кислоты и ^ацетил-глюкозой, которые входят в состав пептидогликанов, составляющих основу плазматических мембран бактериальных клеток
[14].
Существует мнение, что лизоцим синтезируется не только железистыми клетками слизистой оболочки органов желудочно-кишечного тракта, дыхательных путей, слюнными и слезными железами и других органов [2], [9], [11], но также бактериями, особенно кишечной микрофлорой [5], вирусами и даже бактериофагами [2]. Лизоцим синтезируется и транспортируется различными формами лейкоцитов, поэтому,
по-видимому, фермент обнаруживается в различных органах и тканях человека [4, 12].
Церулоплазмин, медь-содержащий глико-протеин плазмы крови с молекулярной массой 150 кД, впервые обнаружен и выделен Холь-мбергом и Лауреллем в 1948 году. Содержание церулоплазмина в плазме человека составляет 0,2-0,3 мг/мл, с ним связано до 99 % всех ионов меди плазмы. В его молекуле имеется 8 атомов меди. Синтезируется он в печени, как и большинство плазменных белков, и относится к а2-глобулиновой фракции [17]. Церулоплаз-мин является регулятором содержания меди в организме, а также обладает ферментативной активностью. Он окисляет полиамины, полифенолы, аскорбиновую кислоту и защищает вне клеток липиды от перекисного окисления, наступающего под воздействием супероксидного кислорода [16]. В настоящей работе рассматривается только его ферментативная функция.
Аденовирусная инфекция вначале развивается в носоглотке, а затем по слезным каналам поднимается вверх, и в патологический процесс вовлекаются конъюнктива и слезный аппарат глаза. Вирус герпеса постоянно находится в организме человека в латентном состоянии и, периодически обостряясь, вызывает офтальмо-герпес. Вследствие этого представляет научный и практический интерес изучение активности ферментов в различных биологических жидкостях организма при этих патологических процессах и способности их лекарственной коррекции.
Цель исследования
1) изучение неспецифической антибактериальной и антирадикальной защиты в слезной жидкости и других биологических жидкостях организма;
2) выяснение действия лекарственных средств, наиболее часто применяемых для лечения аденовирусного кератоконъюнктивита и офтальмогерпеса, на активность лизоцима и церулоплазмина.
Материал и методы исследования
В работе использованы сыворотка донорской крови, слезная (СЖ), ринолакримальная (РЛЖ) и ротовая (РЖ) жидкости, полученные натощак от здоровых людей, в которых опреде-
ляли активность лизоцима и церулоплазмина. Наряду с этим в биологических жидкостях исследовали (in vitro) изменение активности ферментов под воздействием десяти лекарственных средств, наиболее часто применяемых для лечения аденовирусного кератоконъюнктивита и офтальмогерпеса. Для этих целей к раствору лизоцима добавляли одно из лекарственных средств (в соотношении 1:10). Полученную смесь инкубировали в течение 30 мин при температуре 22 оС, после чего в ней определяли активность фермента. Опыты с церулоплазми-ном сыворотки крови ставили аналогичным образом.
Лизоцим определяли методом П.Г. Сто-рожука и соавт., (2006) [13]. Для этого в качестве субстрата использовали патентованную лиофилизированную культуру Micrococcus Lysodeikticus - ML (США) и фермент Lyzozyme (активность 20000 ед/мг), выделенный из ку-ринных яиц (Германия). Растворы субстрата и фермента готовили ex tempore на 0,067 М фосфатном буфере с рН 6,2, которые хранили в емкости со льдом. Рабочий раствор субстрата содержит ML 0,08 мг/мл (в кювете на 5 мл -
0.4 мг), при колориметрии на МФК-2МП он имеет оптическую плотность 0,300 (экстинций) при ^=540 нм и толщине слоя 10 мм. Рабочий раствор лизоцима готовили из расчета: 100 ед фермента в 100 мкл раствора. Такое количество фермента брали в опыт и принимали за 100 %.
Церулоплазмин определяли по методу Ра-вина (в описании В.С. Камышникова, 2000) [3], адаптированному нами для слезы. Метод основан на способности церулоплазмина окислять р-фенилендиамин. Реакцию ставили в течение 1 ч при 35оС, а останавливали путем добавления фтористого натрия. По оптической плотности образовавшихся окрашенных продуктов, определяемой на ФЭК - 2МП в кюветах с толщиной слоя 10 мм при А,=540 нм, судили об активности церулоплазмина.
Результаты и обсуждение
Результаты исследования активности лизо-цима и церулоплазмина в слезе и других биологических жидкостях человека подвергнуты статистической обработке и внесены в таблицу
1, где активность ферментов в сыворотке крови взята за 100 %. Из приведенных данных видно,
что активность лизоцима в РЖ выше на 88 % по сравнению с сывороткой крови, в РЛЖ - на 174 %, а в СЖ она выше в 40 раз. Подобная картина наблюдалась при исследовании лизоцима в молоке, где его активность выше в 4-5 раз по сравнению с сывороткой крови. При этом активность фермента в молозиве значительно выше, чем в молоке, а повышение активности фермента находится в прямой зависимости от сроков недоношенности плода: чем больше сроки недоношенности, тем выше активность лизоцима в молозиве и молоке родильниц.
Из литературных и собственных данных видно, что железистые клетки, синтезирующие лизоцим, рассеяны по многим органам организма, и что слезные железы, вероятно, обладают собственным мощным ферментсинтезирующим аппаратом, продуцирующим лизоцим, который и обеспечивает такую высокую его концентрацию в СЖ.
Активность церулоплазмина оказалась самой высокой в сыворотке крови (принятой за 100 %), а в СЖ она на 30 % ниже. Содержание церулоплазмина в РЛЖ и РЖ составляет всего
11 и 8 % соответственно, по сравнению с сывороткой. Эти данные свидетельствуют о том, что церулоплазмин экскретируется слезными, слюнными железами и железистым аппаратом слизистой носа из сыворотки крови.
В настоящее время для лечения и профилактики воспалительных заболеваний глаза и слезного аппарата применяется широкий арсенал лекарственных средств. В их число наиболее часто включают противовоспалительные (диклофенак, дикло-Ф, циклоферон, интерферон), противовирусные (офтальмоферон, полу-дан), антисептики (раствор сульфацил-натрия), а также анестетики (лидокаин и алкаин) и аскорбиновую кислоту.
В связи с этим проведено исследование (in vitro) действия каждого из вышеперечисленных лекарственных средств на активность лизоци-ма и церулоплазмина. Средние результаты из 5 опытов внесены в таблицу 2.
Только под влиянием трех препаратов: интерферона, циклоферона и полудана - активность лизоцима снижается статистически достоверно на 35-43 %. Семь других лекар-
Таблица 1. Активность лизоцима и церулоплазмина в биологических жидкостях организма
Биологическая жидкость n Лизоцим М± m (ед\мл) % Церулоплазмин М±т (ед\мл) %
СК 8 41,0-3,88 100 198,5-19,5 100
СЖ 8 1640,0-68,5 4000 139,1-13,8 70,0
РЛЖ 8 137,4-6,74 274 22,3-1,96 11,2
РЖ 8 94,2-7,14 188 16,2-1,63 8,1
Примечания: СК - сыворотка крови, СЖ - слезная жидкость, РЛЖ - ринолакримальная жидкость, РЖ - ротовая жидкость.
Таблица 2. Действие лекарственных средств, применяемых в офтальмологии, на активность лизоцима и церулоплазмина после 30 мин их совместной инкубации при 22 оС
Лекарственное средство n Лизоцим М± m (ед\мл) % Церулоплазмин М± m (ед\мл) %
Контроль 5 43-2,9 100 42,0-3,7 100
Сульфацил-натрия 5 50-3,2 116,2 45,3-2,9 107,8
Дикло-Ф 5 49-3,3 113,9 61,6-4,1 146,6
Офтальмоферон 5 42-2,6 97,6 54,9-3,3 130,7
Алкаин 5 50-3,5 116,2 63,0-4,0 150,0
Лидокаин 5 48-3,3 111,6 54,9-3,3 130,0
Контроль 5 58-4,2 100 42,0-3,7 100
Циклоферон 5 38-2,2 65,5 61,2-5,2 145,1
Аскорбиновая к-та 5 57-4,1 98,2 100 % ингибир. -
Интерферон 5 33-2,9 56,9 63,1-4,2 150,0
Диклофенак 5 53-3,7 91,3 100 % ингибир. -
Полудан 5 34-2,8 58,6 55,8-3,4 132,8
ственных средств оказались индифферентными по отношению к этому ферменту. Интерферон является фактором белковой природы, выделенным из лейкоцитов донорской крови, сам по себе не обладает ингибирующим действием на активность ферментов [6], но добавление к нему стабилизатора (например, бензойной кислоты), вероятно, и придает препарату ингибирующие свойства, которые четко выявляются при его действии на лизоцим. Циклоферон относится к низкомолекулярным соединениям - производным акридиноуксусной кислоты и является индуктором интерферона в макрофагах, Т - и В-лимфоцитах. Благодаря своей химической структуре препарат обладает ингибирующими свойствами. А лизоцим, по-видимому, является одним из многих ферментов, на которые действует циклоферон как ингибитор. Что же касается полудана, то это химическое соединение, состоящее из полиадениловой и полиури-диловой кислот с сильно выраженными кислотными свойствами, придающими ему свойства ингибитора [10]. Мы полагаем, что выявленное под действием этих трех препаратов снижение активности лизоцима наступает исключительно за счет существенного сдвига рН среды в кислую сторону.
Активность церулоплазмина при действии дикло-Ф, офтальмоферона, циклоферона, интерферона, полудана, алкаина и лидокаи-на повышается на 30-50 %, а при действии сульфацил-натрия она остается на прежнем уровне. В присутствии аскорбиновой кислоты и диклофенака ферментная активность церуло-плазмина полностью ингибируется. О том, что реакция среды, создаваемая некоторыми препаратами, оказывает ингибирующее действие на активность изучаемых ферментов, свидетельствует динамика активности церулоплаз-мина в присутствии дикло-Ф и диклофенака. В состав обоих препаратов входит одно и то же вещество - диклофенак натрия, натриевая соль 0-[(2,6 дихлорвинил)-амино]-фенил-уксусной кислоты [1], а вспомогательные вещества различные. Так, диклофенак содержит натрий пиросульфат и натр едкий, а в дикло-Ф эти
компоненты отсутствуют. Существенное смещение рН в кислую (аскорбиновая кислота) или в щелочную (натр едкий в диклофенаке) сторону вызывает полное ингибирование фермента. Тогда встает вопрос: почему при действии семи препаратов (из десяти) активность церулоплаз-мина повышается на 30-50 %? Повышение активности церулоплазмина может быть связано: 1) с изменением степени окисления меди, 2) с объединением молекул фермента в комплексы, за счет чего начинает проявляться свойство кооперативности.
Выводы
Установлено, что самой высокой активностью лизоцима обладает СЖ, где она в 40 раз выше, чем в сыворотке крови. В РЛЖ его активность почти в три раза, а в РЖ почти в два раза выше, по сравнению с сывороткой крови. Это свидетельствует о том, что слезные железы являются секреторным органом лизоцима, а слюнные железы, по-видимому, являются экскреторными.
Церулоплазмин, являясь продуктом биосинтеза печени, поступает в кровь, в которой его активность имеет наивысшие значения, из нее он достаточно хорошо экскретируется в СЖ и очень слабо в РЛЖ и РЖ.
Отдельные лекарственные средства, применяемые в офтальмологии для лечения вирусных инфекций (аденовирусного кератоконъюнкти-вита и офтальмогерпеса), обладают способностью ингибировать активность лизоцима (например циклоферон, интерферон и полудан), что связано с их химической структурой или химической структурой вспомогательных веществ.
Ферментная активность церулоплазмина зависит от химической структуры лекарственного средства и дополнительно введенных в его состав ингредиентов, влияющих на степень окисления меди, которая в одних случаях способствует образованию агрегатов, приобретающих свойства кооперативности, повышающих активность церулоплазмина, а в других - его ингибирует.
10.09.2015
Список литературы:
1. Данилов А.Б Диклофенак в лечении болевых синдромов // Лечащий врач - 2009. - №5 - С.34-36.
2. Каспаров А.А. Офтальмогерпес. - М.: Медицина - 1994 - 224 с.
3. Камышников В.С. Определение содержания (активности) перуллоплазмина // Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике - М: МЕДпресс-информ - 2009 - С.71-75.
4. Клетикова Л.В. Влияние вакцинации на лизоцимную активность // Ветеринария - 2009 - №2 - С.19-20.
5. Мазурик Н. Одолеть микробы без опасных последствий // Наука и технологии России - 2008 - №3 - С.28-30.
6. Машковский М.Д. Лекарственные средства - Харьков: Торсинг - 1996 - т 1,2.
7. Меклер Л.Б. Иддис Р.Г. Построение модели трехмерной молекулы лизоцима белка куриного яйца - М.: Медицина - 1981.
8. Молчанов Д. Аденовирусная инфекция в XXI веке: традиционные знания против против многоликого врага человечества -Киев: Здоров,я - 2009 - №16/1 - С. 48-50.
9. Осидзе Д.Ф., Простяков А.Н. Факторы резистентности организма животных// Ветеринария, 1983 - №3 - С.32-34.
10. Регистр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств. - М.: РЛС, 2005. - С. 1392.
11. Ройт А. Основы иммунологии // М.: Мир - 1991 - 328 с.
12. Сохин А.А., Чернушенко Е.Ф. Прикладная иммунология - Киев: Здоров'я - 1984 - 316 с.
13. Сторожук П.Г., Сторожук И.А., Артамонов В.А., Артамонов М.В. Действие патентованных стоматологических противовоспалительных средств на неспецифические защитные факторы слюны // Вестник интенсивной терапии - 2006 - №5. - С. 346-347.
14. Усов А.И. Пептидогликаны. Справочник. Химическая энциклопедия. М: Советская энциклопедия - 1988.
15. Hamilton R. The Herpes book. Los Angeles. - 1980.
16. Нга Хьюинг Важные параметры меди в средстве для лечения ран // Cooper peptide technology - 2010.
17. Murray R.K., Granner D.K., Mayes P.A., Rodwell V.W. Harper's Biochemistry // Prentice-Hall Internetional London - 1993.
Сведения об авторах:
Быкова Елена Владимировна, врач-офтальмолог Краснодарского филиала МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова, кандидат медицинских наук 350012 Краснодар, ул. Красных партизан 6, каб. 210; e-mail: bikova_lena@bk.ru
Соголовская Елена Евгеньевна, заведующая офтальмологическим терапевтическим отделением Краснодарского филиала МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова, кандидат медицинских наук
Сотникова Татьяна Олеговна, врач-офтальмолог Краснодарского филиала МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова, кандидат медицинских наук
Габриэль Татьяна Петровна, врач-офтальмолог Краснодарского филиала МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова
