CC BY
75
Таблица 2
Результаты однофакторного корреляционного анализа в зависимости от метода лечения экспериментального эндофтальмита
метод лечения F F критическое
Витрэктомия+ванкомицин (F1) 3,142953 3,0681
Витрэктомия +ФДТ (F2) 9,155821 3,066391
Витрэктомия +ФДТ+ванкомицин (F3) 14,16693 3,066391
Упорядоченная последовательность опытных групп для всех сроков наблюдения при оценке патоморфологических признаков воспаления имеет вид: группа 1 (F1) < группа 2 (F2) < группа 3 (F3), что свидетельствует о наибольшей эффективности лечения экспериментального экзогенного бактериального эндофтальмита в группе 3, где в ходе витрэктомии проводили АФДТ и в качестве ирригационного раствора использовали раствор антибиотика.
Заключение
Таким образом, проведенный нами комплекс разносторонних экспериментальных исследований свидетельствует о перспективности использования АФДТ при лечении бактериального эндофтальмита. С нашей точки зрения, проведение последующей клинической апробации разработанного метода с его внедрением в клиническую практику позволит значительно повысить эффективность хирургического лечения эндофтальмита, улучшив тем самым качество медицинской реабилитации данного тяжелого контингента больных.
литература
1. Белый Ю. А., Терещенко А. В., Плахотний М. А. и др. Лечение бактериальных язв роговицы методом локальной ФДТ // Рефракционная хирургия и офтальмология. - 2008. - Т. 8. № 2. - С. 28-33.
2. Белый Ю. А., Терещенко А. В., Плахотний М. А. Оценка антимикробного действия фотодинамической терапии in vitro // Инфекции в хирургии. - 2008. - Т. 6. Приложение 1. - С. 13.
3. Белый Ю. А, Терещенко А. В., Плахотний М. А. и др. Интравит-реальная фотодинамическая терапия в лечении экспериментального эндофтальмита // Офтальмохирургия. - 2009. - № 3. - С. 47-52.
4. Белый Ю. А., Терещенко А. В., Шкворченко Д. О., Макаров К. Н., Юдина Н. Н., Носкова Н. Х. Применение озонированных пер-
фторорганических соединений в лечении эндофтальмита // Офтальмохирургия. - 2004. - № 1. - С. 31-34.
5. Белый Ю. А., Терещенко А. В., Юдина Н. Н. Оценка эффективности интравитреального применения электролизного раствора гипохлорита натрия в ходе витрэктомии при лечении экзогенного бактериального эндофтальмита // Офтальмохирургия. - 2007. -№ 2. - С. 40-45.
6. Даниличев В. Ф. Современная офтальмология. - СПб, 2000. - С. 564-568.
7. Мамиконян В. Р., Балаян М. Л., Будзинская М. В. и др. Возможности фотодинамической терапии в лечении грибковых поражений роговицы // Вестник офтальмологии. - 2007. - № 5. - С. 25-28.
8. Родин С. С. Современные подходы к лечению экзогенного бактериального эндофтальмита // Офтальмол. журн. - 1992. -№ 4. - С. 235-237.
9. Хакимов А. М. Эндофтальмит в хирургии катаракты // Офтальмохирургия. - 2008. - № 2. - С. 48-54.
10. Юдина Н. Н., Белый Ю. А., Терещенко А. В. Применение гипохлорита натрия в офтальмологии // Офтальмология. - 2007. -Т. 4. № 3. - С. 15-21.
11. Ermis S. S., Cetinkaya Z., Kiyici H., Ozturk F. Treatment of Staphyiococcus Epidermidis Endophtalminis with Intravitrealmonoflocsacin in a rabbit // Model exp. med. - 2005. - № 3. - P. 223-229.
12. Maisch T., Szeimies R. M., Jori G., Abels C. Antibacterial photodynamic therapy in dermatology // Photochem. photobiol. sci. -2004. - Vol. 3. № 10. - P. 907-917.
13. Meisel P., Kocher T. Photodynamic therapy for periodontal diseases: state of the art // J. photochem. photobiol B. - 2005. -№ 2. - P. 159-170.
14. Parsons C., McCoy C. P., Gorman S. P. at al. Anti-infective photodynamic biomaterials for the prevention of intraocular lens-associated infectious endophthalmitis // Biomaterials. - 2009. -Vol. 30. № 4. - P. 597-602.
Поступила 23.09.2010
E. В. БЫКОВА1, Л. А. СТОРОЖУК2
ДЕЙСТВИЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ, АНТИВИРУСНЫХ, АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ И АНЕСТЕЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ, ПРИМЕНЯЕМЫХ В ОФТАЛЬМОЛОГИИ,
НА АКТИВНОСТЬ ЛИЗОЦИМА СЛЕЗНОЙ ЖИДКОСТИ
Краснодарский филиал ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. академика С. Н. Федорова Росмедтехнологии»,
Россия, 350012, г. Краснодар, ул. Красных партизан, 6;
2кафедра фундаментальной и клинической биохимии Кубанского государственного медицинского университета,
Россия, 350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4. E-mail: IlyaMB@ksma.ru
Кубанский научный медицинский вестник № 1 (124) 2011 УДК 616-7-085..615.355
Кубанский научный медицинский вестник № 1 (124) 2011
Экспериментами (in vitro) установлено, что препараты, используемые в офтальмологии, при их совместной инкубации с лизоцимом в течение 30 мин при 22° С, взятые в соотношении 1:10 , обладают способностью изменять активность фермента. Так, сульфацил-натрия, дикло-Ф и алкаин имеют тенденцию повышать активность лизоцима на 6-7%, а циклоферон, интерферон и полудан - понижать её на 20-25% по сравнению с контролем.
После суточного хранения этих же растворов лизоцима в рефрижераторе при +4° С совместно с исследуемыми препаратами изменений активности фермента не выявлено.
При совместной инкубации раствора лизоцима и лекарственных средств, взятых в соотношении 1:1, и при соблюдении тех же условий, что и в 1-й серии, происходит снижение уровня инактивации фермента на 34-45% по сравнению с контролем.
Ключевые слова: лизоцим, аденовирусный кератоконъюнктивит, слезная жидкость, противовоспалительные, антивирусные, антибактериальные, анестезиологические препараты.
Е. V. BYKOVA1, L. A. STOROZHUK2
THE EFFECT OF ANTIINFLAMMATORY, ANTIVIRAL, ANTIBACTERIAL AND ANAESTHETIC DRUGS, USED IN OPHTHALMOLOGY FOR LACRIMAL FLUID LYSOZYME STRENGTH
1Sv. Fyodorov Eye microsurgery complex, Krasnodar branch,
Russia, 350012, Krasnodar, Krasnykh partizan str., 6, fundamental and medical biochemistry department of Kuban state university of health sciences,
Russia, 350063, Krasnodar, Sedina str., 4. E-mail: IlyaMB@ksma.ru
The trials (in vitro) showed, that the drugs used in ophthalmology by their combined incubation with lysozyme during 30 min at 22° С, in the ratio 1:10, are able to change the ferment strength. Thereby, sodium sulfaoil, diclo-F and alcaine tend to increase lysozyme strength by 6-7%, and cycloferon, interferon and poludan tend to decrease it by 20-25%, compared with the control.
After one day of these lysozyme solutions with the experimental drugs storage in the refrigerator at +4° С the ferment strength changes were not determined.
The combined incubation of lysozyme solutions and drugs, at the ratio 1:1, under the conditions similar to the 1 series, results in the decrease of the ferment inactivation level, which is 34-45% higher, than the control one.
Key words: lysozyme, virus keratoconjunctivitis, lacrimal fluid, antiinflammatory, antiviral, antibacterial and anaesthetic drugs.
Наиболее частым вирусным заболеванием глаза является вирусный кератоконъюнктивит, который вызывается одним из штаммов аденовируса. На долю этого заболевания приходится 5-10% всех вирусных заболеваний [1]. В настоящее время для лечения и профилактики воспалительных заболеваний глаза и слезного аппарата применяется широкий арсенал лекарственных средств. В их число наиболее часто включают: противовоспалительные (диклофенак, дикло-Ф, индоколир), противовирусные (интерферон, офтальмоферон), иммуностимулирующие средства (полудан, цикло-ферон), противомикробные (раствор сульфацил-натрия, витабакт), а также анестетики (лидокаин, алкаин) и аскорбиновую кислоту.
В связи с этим представляло научный и практический интерес изучить действие вышеперечисленных препаратов на активность лизоцима слезной жидкости как одного из основных антибактериальных и антивирусных факторов организма.
Материалы и методы исследования
Действие препаратов на активность лизоцима определяли методом П. Г. Сторожука и соавт. (2006) [2]. Для этого в качестве субстрата использовали патентованную лиофилизированную культуру Micrococcus Lysodeikticus (США) и фермент Lyzozyme, выделенный из куриных яиц (Германия). Растворы субстрата и фермента готовят ex tempore на 0,067 М фосфатном буфере с рН 6,2 (КН2РО4 - 7,24 г + №2НРО4 ■ 2Н2О -1,78 г + ЭДТА - 0,31 г + Н2О до литра), которые хранили в ванночке со льдом.
Рабочий раствор субстрата готовят из расчета 0,08 мг/мл (в кювете на 5 мл - 0,4 мг), при колориметрии на МФК-2МП он должен иметь оптическую плотность 0,300 при А = 540 нм и толщине слоя 10 мм.
Рабочий раствор лизоцима. Вначале 5 мг фермента растворяют в 5 мл буферного раствора, а затем 0,1 мл маточного раствора переносят в 10 мл буфера (разведение 1:1000).
В опыт брали 5 мл субстрата и к нему добавляли 0,1 мл раствора лизоцима. При таких разведениях в кювете находилось 0,4 мг и 0,00001 мг лизоцима, что соответствовало 100 единицам фермента, которые были и взяты за 100%.
Ход эксперимента.
1-я серия. В пробирки вносили по 1,0 мл раствора лизоцима, к нему добавляли по 0,1 мл одного из исследуемых лекарственных средств. Полученную смесь инкубировали при комнатной температуре (22° С) в течение 30 мин. Затем в пробирку с 5 мл рабочего раствора субстрата добавляли 0,1 мл смеси лизоцима с препаратом и включали секундомер, содержимое пробирки переносили в кювету, которую ставили в колориметр. Записывали исходную оптическую плотность, затем строго по секундомеру через 10 мин - конечную.
2-я серия. В ней опыты поставлены так же, как и в первой серии, только инкубация смеси фермента с лекарственным средством продолжалась 24 часа при +4° С.
3-я серия. Она отличается от первой тем, что в ней растворы лизоцима и лекарственного средства взяты в равных количествах (1:1).
Расчет активности фермента после действия препарата
Для расчета активности лизоцима, определяемой после действия препаратов, пользуются специальным калибровочным графиком. По оси ординат находятся величины экстинкции, по оси абсцисс - единицы лизоцима. На этом графике также имеются две пересекающиеся диагонали: на нисходящей отражено уменьшение экстинкций, а на восходящей - увеличение активности фермента. Калибровочный график построен таким образом, что в 5 мл реакционного раствора содержится 100 единиц фермента, взятых нами за 100%.
Поскольку исходная величина экстинкций раствора субстрата не всегда равна 0,300 (она может быть больше и меньше), то расчет ведут следующим образом: а) из исходной величины экстинкций вычитают величину, полученную в конце опыта, б) полученную разницу вычитают из 0,300 и получают точку отсчета единиц фермента по калибровочному графику.
Результаты и обсуждение
Для исследований были взяты представители различных по механизму действия групп лекарственных средств, применяемых в офтальмологии. Поскольку при-
нцип метода определения активности лизоцима ^) основан на его способности гидролизовать муреин, составляющий основу плазматической мембраны Micrococcus Lysodeikticus (ML), один и тот же калибровочный график служит и для определения активности этого фермента, и для определения глубины гидролиза МЬ
С каждым препаратом в каждой серии поставлено по 4 опыта, по ним получены средние величины, которые внесены в таблицы, и результаты первой серии представлены в таблице 1.
Из этой таблицы мы можем видеть, что после 10 мин совместной инкубации лизоцима и лекарственного средства действие фермента на ML в некоторых случаях остается таким же, как и в контроле. Но в присутствии алка-ина, сульфацил-натрия и дикло-Ф оно имеет тенденцию к повышению (на 6-7%), а под влиянием циклоферона, интерферона и полудана - снижается (на 20-25%).
Поскольку собранную слезную жидкость не всегда удается исследовать в день её получения, представляло практический интерес выяснить, изменяется ли в ней активность лизоцима при хранении в течение 24 час в рефрижераторе с +4° С. Соотношения фермента и лекарственного средства взяты такие же, как и в предыдущей серии (табл. 2).
Таблица 1
Действие лекарственных средств на активность лизоцима и на глубину гидролиза МЬ после 30 мин их совместной инкубации при 22° С
(соотношение 1:10)
Препарат п Экстинкции Единиц фермента Негидролизо- ванные мь %
Исходные Конечные Разница
0. Контроль 4 0,314 0,182 0,132 43 57
1. Сульфацил-натрия 4 0,305 0,156 0,149 50 50
2. Дикло-Ф 4 0,304 0,160 0,144 49 51
3. Офтальмоферон 4 0.300 0,174 0,126 42 58
4. Алкаин 4 0,303 0,155 0,148 50 50
5. Лидокаин 4 0,303 0,160 0,143 48 52
0. Контроль 4 0,314 0,137 0,174 58 42
6. Циклоферон 4 0,303 0,184 0,119 38 62
7. Аскорбиновая кислота 4 0,311 0,130 0,181 57 43
8. Интерферон 4 0,312 0,110 0,202 33 67
9. Диклофенак 4 0,305 0,138 0,167 53 47
10. Полудан 4 0,307 0,109 0,198 34 66
Таблица 2
Действие лекарственных средств на активность лизоцима и на глубину гидролиза МЬ после 24 часов их совместной инкубации при +4° С (соотношение 1:10)
препарат п Экстинкции Единиц фермента Негидролизованные мь %
Исходные Конечные Разница
0. Контроль 4 0,316 0,127 0,189 63 37
1. Сульфацил-натрия 4 0,311 0,121 0,190 63 37
2. Дикло-Ф 4 0,304 0,103 0,201 67 33
3. Офтальмоферон 4 0.315 0,112 0,203 68 32
4. Алкаин 4 0,307 0,106 0,201 63 37
5. Лидокаин 4 0,307 0,112 0,195 68 32
Кубанский научный медицинский вестник № 1 (124) 2011
УДК 616.133.32+616.145.15/.16:616.145.151 Кубанский научный медицинский вестник № 1 (124) 2011
Из данных, приведенных в этой таблице, видно, что суточное хранение слезной жидкости в рефрижераторе на активность лизоцима не влияет. Поэтому её можно определять и на второй день после взятия пробы.
Представляло практический интерес выяснить, каким образом влияют исследуемые средства при их введении в конъюнктивальную полость в более высоких концентрациях и смешивании со слезой в соотношении примерно 1:1 (табл. 3).
в соотношении 1:10 обладают способностью изменять активность фермента. Так, сульфацил-натрия, дикло-Ф и алкаин имеют тенденцию повышать активность лизоцима на 6-7%, а циклоферон, интерферон и полудан -понижать её на 20-25% по сравнению с контролем.
2. После суточного хранения этих же растворов лизоцима в рефрижераторе при +4° С совместно с исследуемыми препаратами изменений активности фермента не выявлено.
Таблица 3
Действие офтальмологических средств на глубину гидролиза МЬ ферментом 1 после 30 мин их совместной инкубации при 22° С (соотношение 1:1)
Препарат n Экстинкции Единиц фермента Негидролизованные ML %
Исходные Конечные Разница
0. Контроль 4 0,312 0,204 0,108 35 65
1. Сульфацил-натрия 4 0,305 0,081 0,224 75 25
2. Дикло-Ф 4 0,304 0,075 0,229 73 27
3. Офтальмоферон 4 0,307 0,110 0,197 69 31
4. Алкаин 4 0,304 0,069 0,235 80 20
5. Лидокаин 4 0,301 0,073 0,228 73 27
Из таблицы 3 видно, что при повышении концентрации лекарственного средства существенно изменяется динамика снижения активности лизоцима.
Если в контроле к концу опыта активность лизоци-ма снижается до 35 единиц и остаются неразрушенными 65% МЦ то в присутствии препаратов активность фермента составляет 69-80 единиц, а неразрушенных МL - 20-31%. Это свидетельствует о том, что в присутствии исследуемых препаратов остается на 34-45% меньше инактивированного лизоцима. Чем же можно объяснить подобное действие лекарственных средств? Дело в том, что офтальмоферон является альфа-2 рекомбинантным интерфероном, и для его сохранения в препарат вводят стабилизаторы (например, парабены), а сульфацил-натрия, алкаин, дикло-Ф и лидокаин, по-видимому, являются модуляторами молекул фермента или мембранных белков МЬ
Таким образом, можно заключить:
1. Установлено, что лекарственные средства, используемые в офтальмологии, при их совместной инкубации с лизоцимом в течение 30 мин при 22° С и взятые
3. Совместная инкубация раствора лизоцима и лекарственных средств, взятых в соотношении 1:1, при соблюдении тех же условий, что и в 1-й серии, приводит к снижению уровня инактивации фермента, которая на 34-45% ниже, чем в контроле.
ЛИТЕРАТУРА
1. Быкова Е. В., Соголовская Е. Е., Хвостова Т. С., Сторо-жук Л. А. Биохимические методы исследования слезной жидкости при вирусном кератоконъюнктивите// Актуальные проблемы офтальмологии. V Всероссийская научная конференция молодых ученых: Сб. науч. работ. - М., 2010. - С. 43-45.
2. МайчукЮ. Ф., ЯниЕ. В. Офтальмоферон в лечении аденовирусных заболеваний глаз // Газета «Окулист». - 2006. - № 5. -С. 18-19.
3. Сторожук П. Г., Сторожук И. А., Артамонов В. А., Артамонов М. В. Действие гигиенических средств на активность ферментов органов пищеварения // Кубанский научный медицинский вестник. - 2006. - № 5-6. - С. 108-111.
Поступила 12.10.2011
И. И. КАГАН,1 В. Н. КАНЮКОВ,2 Д. А. ИЛЮХИН1
ДИНАМИКА СТРУКТУРНЫХ ПРЕОБРАЗОВАНИЙ ПЕРЕДНЕГО ОТДЕЛА ГЛАЗНОГО ЯБЛОКА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ НАРУШЕНИИ КРОВОСНАБЖЕНИЯ И ВЕНОЗНОГО ОТТОКА
Кафедра оперативной хирургии и клинической анатомии Оренбургской государственной медицинской академии,
Россия, 460000, г. Оренбург, ул. М. Горького, 45, корп. 2;
2Оренбургский филиал ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. академика С. Н. Федорова Росмедтехнологии»,
Россия, 460047, г. Оренбург, ул. Салмышская, 17, тел. 8 (3532) 65-06-82. E-mail: nauka@ofmntk.ru
