CC BY
215
УДК 615.277.3.07
Z. S. Shprakh
ANALYSIS AND STANDARDIZATION OF ANTITUMOR AGENTS, DERIVATIVES OF NITROGEN MUSTARD
N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
ABSTRACT
The review is devoted to discussion of standardization of antitumor pharmaceuticals derivatives of nitrogen mustard. Modern state of substances and pharmaceutical dosage forms quality control by primary criteria is analyzed, identification methods diversity is demonstrated; foreign pharmacopoeias and leading manufacture’s requirements to related compounds content are adduced; chloroethylamine derivatives assay methods are characterized.
Key words: chloroethylamine derivatives, quality control, pharmacopoeial analysis, identification, related compounds, assay.
3. С. Шпрах
АНАЛИЗ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ПРОИЗВОДНЫХ ХЛОРЭТИЛАМИНА
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
РЕЗЮМЕ
Обзор посвящен обсуждению методов стандартизации противоопухолевых лекарственных средств производных хлорэтиламина. В работе анализируется современное состояние контроля качества субстанций и лекарственных форм по основным показателям; демонстрируется многообразие методов определения подлинности; приводятся требования фармакопей зарубежных стран и монографий ведущих производителей к чистоте противоопухолевых препаратов; характеризуются основные методы количественного определения производных хлорэтиламина.
Ключевые слова: производные хлорэтиламина, контроль качества, фармакопейные методы, подлинность, специфические примеси, количественное определение.
ВВЕДЕНИЕ
Производные хлорэтиламина (ХЭА) — синтетические химические соединения, широко используемые в химиотерапии онкологических заболеваний [2]. Для ХЭА характерно наличие ди(2-хлорэтил)аминной группы К(СН2СН2С1)2, которая ответственна за реакцию алкилирования. ХЭА иногда называют азотистыми ипритами, т. к. они представляют собой азотистые аналоги (атом серы замещен атомом азота) иприта. Препараты, производные ХЭА, используются в клинической практике с конца 1950-х годов [5].
Ряд производных хлорэтиламина — сарколизин, хлорамбуцил и циклофосфамид описаны еще в Государственной фармакопее СССР X издания [3].
В зависимости от химической природы носителя ХЭА разделяются на производные алифатического (новэмбихин) и ароматического (хлорамбуцил) ряда.
N—/А'|/ • HC1 / Cl
Cl
2-хлорпропил-ди-(2-хлорэтил)амина гидрохлорид С1ч
N
*=0
НО
С1
4-[п-[ди(2-хлорэтил)амино]фенил]масляная кислота
Международное непатентованное название (МНН): хлорамбуцил.
Торговое название: Лейкеран.
Лекарственная форма: таблетки 2 и 5 мг.
Большую группу противоопухолевых препаратов составляют производные ХЭА на основе аминокислот и пептидов. Среди этих препаратов сарколизин, новая лекарственная форма которого в виде лиофилизата для приготовления раствора для инъекций 0,02 г разработана в Лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН [13].
О
ОН
HNH2 • НС1
clv/\
МНН:
Торговое название: Амиронин.
Лекарственная форма: таблетки 250 мг.
Наиболее широко используется в онкологической практике и активно выпускается в настоящее время фосфорилированное производное хлорэтиламина — циклофосфамид.
О
// г
Р------N
Л
V
С1 • Н20
'NH
Л
С1
ВЬ-а-амино-Р-^-ди^-хлорэтил^мино^фенилалани-на гидрохлорид
МНН:
Торговое название: Сарколизин.
Лекарственная форма: лиофилизат для приготовления раствора для инъекций.
Широко известен L-изомер сарколизина — мелфа-лан, выпускаемый фирмой Glaxo Wellcome Foundation (Великобритания) в виде таблеток 2 и 5 мг и лиофили-зата для приготовления инъекционного раствора 50 и 100 мг под торговым названием Алкеран.
В ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН синтезированы дипептиды сарколизина, из которых один (цифе-лин) разрешен для клинического применения [14].
С-0-С2Н5
Этиловый эфир №[№-ацетил-[п-ди(2-хлорэтил)амино-фенилаланил]-валина
МНН:
Торговое название: Цифелин.
Лекарственная форма: таблетки 250 мг.
Амиронин — хлорэтильное производное, имеющее в своем составе тирозиновую структуру.
ОН
DL-а-амино-P-{n[n-ди(2-хлорэтил)аминофенокси]-фенил}-пропионовая кислота
К-ди-(Р-хлорэтил)-№,0-триметиленовый эфир диамида фосфорной кислоты
МНН: циклофосфамид.
Торговое название: Циклофосфан, Цитоксан, Эн-доксан, Ледоксина.
Лекарственная форма: таблетки 25 и 50 мг; таблетки, покрытые оболочкой, 50 мг; драже 50 мг; лиофили-зат для приготовления раствора для инъекций 100, 200, 500 и 1000 мг.
Необходимо отметить, что в настоящее время в России не производится ни одной субстанции производных ХЭА; однако многие известные зарубежные фармацевтические фирмы, такие как GlaxoSmithKline (Великобритания), Teva (Израиль), Brystol-Mayers Squibb (США), Asta Medica (Швейцария) представляют на российском рынке таблетки и лиофильно высушенные инъекционные лекарственные формы.
Несмотря на многолетнее использование производных хлорэтиламина в медицинской практике, методы контроля качества этих препаратов разработаны в недостаточной степени и не всегда удовлетворяют требованиям фармакопейного анализа.
В настоящем обзоре рассматривается современное состояние методов контроля качества производных ХЭА по таким основным показателям, как «Подлинность», «Посторонние примеси (родственные соединения)» и «Количественное определение», по данным фармакопей разных стран [20; 22; 31] и периодической литературы.
ПОДЛИННОСТЬ
Подлинность хлорамбуцила устанавливается качественной реакцией с бихроматом калия в серной кислоте и нитропруссидом натрия и пиперидином.
Одной из основных реакций подлинности ХЭА, включенной во все рассматриваемые фармакопеи и нормативные документы отдельных производителей для препаратов, имеющих свободную аминогруппу, является реакция на а-аминокислоту с нингидрином. Также практически во всех нормативных документах, регламентирующих качество субстанций производных
ХЭА, проводится определение ионного хлора реакцией с нитратом серебра.
Качественные реакции, результатом которых являются окрашенные продукты, позволяют определить различные функциональные группы в препаратах. Так, реакция с концентрированной азотной кислотой с последующим воздействием паров аммиака позволяет определить остаток урацила в допане, а выпадение оранжевых кристаллов после взаимодействия с реактивом Драгендорфа свидетельствует о наличии третичного азота в данном препарате. Отечественная фармакопейная статья на субстанцию циклофосфамида предусматривает определение фосфора по фармакопейной реакции с хлоридом аммония и раствором аммиака [16].
Несмотря на то, что плавление исследуемых препаратов, как правило, сопровождается частичным термическим разложением, а разные изомерные формы цифелина плавятся при различной температуре, определение температуры плавления используется с целью идентификации субстанций всех производных ХЭА.
Наряду с описанными выше реакциями в большинстве фармакопей и других нормативных документов для установления подлинности субстанций ХЭА широко используются физико-химические методы, например ИК- и УФ-спектроскопия, хроматография в тонких слоях сорбента (ТСХ). Кроме того, для субстанции мелфалана, являющегося L-стереоизомером, Британская (ВР), Европейская (EurPh) и Американская (USP) фармакопеи предусматривают подтверждение подлинности методом поляриметрии (препарат должен вращать плоскость поляризации света) [20; 22; 31].
ИК-спектры практически всех ХЭА, включенных в фармакопеи, дают возможность их надежной идентификации. Определение проводят сравнением ИК-спек-тров исследуемого соединения и стандартного образца, снятых в одинаковых условиях (мелфалан, циклофо-сфамид, хлорамбуцил), стандартными спектрами, приведенными в соответствующих фармакопейных статьях (сарколизин, цифелин, амиронин), или путем отнесения отдельных полос поглощения соединения к характеристическим полосам колебаний известных функциональных групп атомов. Как правило, аналитические полосы достаточно характеристичны и общая структура молекулы не оказывает большого влияния на положение полосы поглощения, характерной для данной группы атомов.
В ряде фармакопейных статей для идентификации ХЭА используется метод УФ-спектроскопии [8]. При этом определение проводят по наличию в спектре препарата характерных максимумов, а в отдельных случаях, и минимумов поглощения при указанных значениях в нормативных документах длин волн. При проведении УФ-спектроскопии в соответствии с требованиями зарубежных фармакопей определение проводится в сравнении со стандартными образцами (Reference Standards, RS).
Подлинность практически всех ХЭА, для которых разработаны нормативные документы, отвечающие
современным требованиям, устанавливают методом ТСХ. При этом определение проводят по сравнению с соответствующими стандартными образцами, рассматривая одинаковую хроматографическую подвижность, размеры и окраску пятен на хроматограмме как доказательство подлинности.
Следует отметить, что зарубежные фармакопеи [31] используют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для определения подлинности только в субстанции циклофосфамида.
Методы определения подлинности ХЭА в однокомпонентных лекарственных формах, как правило, аналогичны методам, используемым для определения подлинности соответствующих лекарственных веществ. По фармакопее [20] для определения подлинности хлорамбуцила в таблетках используют метод ИК-спектроскопии после предварительного выделения активного вещества. Многие производители используют метод ИК-спектроскопии как дополнительный в сочетании с другими физико-химическими методами, например ТСХ или ВЭЖХ [10; 11; 12; 17].
Подлинность мелфалана [20; 22] в таблетках и инъекционной лекарственной форме дополнительно характеризуется качественной реакцией с у-(4-нитро-бензил)-пиридином.
Перечень физико-химических методов, используемых в анализе ХЭА, постоянно расширяется, и для определения подлинности лекарственных форм все чаще применяется метод ВЭЖХ. Так, по фармакопеям, а также монографиям большинства зарубежных производителей определение подлинности мелфалана, хлорамбуцила, циклофосфамида в таблетках или лио-филизированных лекарственных формах для приготовления раствора для инъекций проводится методом ВЭЖХ [6; 7; 8]. Обычно определение подлинности методом ВЭЖХ проводится одновременно с количественным определением.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСЕЙ
Традиционными показателями, характеризующими прежде всего чистоту субстанций производных ХЭА, являются испытания на предельное содержание хлоридов, сульфатов, тяжелых металлов, сульфатной золы, прозрачность и цветность растворов. При этом только ВР количественно ограничивает содержание хлоридов и фосфора в циклофосфамиде — не более 330 и 100 ррм соответственно, сульфатной золы — в хлорамбуциле и мелфалане (не более 0,1 и 0,3 % соответственно) и сульфатной золы в циклофосфамиде (не более 20 ррм).
Наряду с этим в ряде случаев предусматривается испытание на предельное содержание специфических примесей, например, отрицательная реакция с нингид-рином подтверждает отсутствие в субстанции цифели-на исходного аминокомпонента синтеза [18]; определение ионного хлора в субстанциях мелфалана и сар-колизина проводится титриметрически [22; 31].
Все документы, нормирующие качество ХЭА, требуют определения примесей: с одной стороны, это тех-
нологические примеси, такие, например, как примеси ацетилсарколизина и хлоргидрата этилового эфира в цифелине [9], этилового эфира сарколизина в сарко-лизине [18; 31]; с другой стороны, это примеси возможных продуктов разложения и, прежде всего, гидролиза производных хлорэтиламина [28].
Ни Британская, ни Европейская фармакопеи не предусматривают определения примесей в мелфалане. Однако для определения посторонних примесей в субстанции хлорамбуцила, а также в субстанции и в лекарственных формах (для инъекций и таблетках) цик-лофосфамида используется метод хроматографии на пластинках с тонким слоем силикагеля, который нормирует в субстанции хлорамбуцила одну примесь на уровне не более 2 %, и только одно пятно может превышать уровень 0,5 %. В циклофосфамиде должно быть не более 1 % одной примеси, при этом из оценки исключается пятно на старте, хотя, как показали отечественные исследования, именно пятно на старте в цик-лофосфамиде характеризует стабильность препарата [16]. Данное пятно говорит о наличии в испытуемом образце примесей олиго- или полимерной природы, накопление которых происходит в процессе разложения препарата, что подтверждено результатами масс-спектрометрического исследования продукта разложения. В ЦБР данный раздел (определение посторонних примесей) отсутствует, по-видимому, ввиду того, что количественное определение проводится для всех указанных препаратов методом ВЭЖХ с использованием стандартных образцов или внутреннего стандарта.
Поскольку в водных растворах производные ХЭА гидролизуются с образованием легкорастворимых мо-но- и дигидроксипроизводных [23], все фирмы проводят определение в выпускаемых лекарственных средствах продуктов гидролиза.
Методы, используемые в контроле качества ХЭА, и прежде всего методы определения посторонних примесей, отражают историю развития фармацевтической химии противоопухолевых соединений и возрастание требований к качеству лекарственных средств. Первоначально специфические примеси в препаратах не определялись, позднее для анализа стали использовать метод ТСХ на пластинках с незакрепленным слоем силикагеля, затем — на готовых пластинках с закрепленным слоем силикагеля на различных подложках.
В лекарственной форме сарколизина метод ТСХ позволяет определять основное действующее вещество, продукты гидролиза препарата и вспомогательные вещества многокомпонентной лекарственной формы, в таблетках нерастворимых в воде цифелина и амиро-нина — технологические примеси [18].
В последнее время при оценке качества производных ХЭА все шире применяется метод ВЭЖХ. Испытание этим методом предусмотрено практически для всех производных ХЭА импортного производства и позволяет определить значительное количество примесей различной природы. Так, для лиофилизирован-ного порошка алкеран, кроме примеси моногидрокси-мелфалана, определяются хлорэтоксимелфалан, димер
мелфалана и продукт фотолиза [8]; в лекарственной форме хлорамбуцила — кроме примеси гидроксиам-буцила — ди-, три- и тетрамеры [7; 8]. Деструкцию циклофосфамида можно описать как гидролиз, сопровождающийся освобождением хлористоводородной кислоты и ди-хлорэтиламина и образованием эфиров фосфорной кислоты [27].
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Основным методом количественного определения в субстанциях производных хлорэтиламина остаются титриметрические методы и, прежде всего, метод аргентометрии.
Прямое аргентометрическое титрование после щелочного гидролиза препарата используется для количественного определения мелфалана в ЦБР и ВР. Британская и Европейская фармакопеи для количественного определения циклофосфамида также рекомендуют аргентометрию, но обратное титрование по методу Фоль-гарда. При аргентометрическом титровании субстанции сарколизина эквивалентности определяется визуально, что затруднено ввиду образования частично окрашенных в розовый цвет продуктов сарколизина или потенциометрически с использованием серебряного или каломельного электродов.
Аргентометрическое титрование производных ХЭА обычно включает в себя стадию щелочной деструкции и определение хлорид-иона на конечной стадии и, по существу, является методом элементного анализа, а как таковой не может дать исчерпывающей характеристики качества производных ХЭА.
Одним из очевидных методов количественного определения производных ХЭА, которые диктуются структурой изучаемых соединений, является их кислотно-основное титрование, которое используется Американской и Британской фармакопеями для определения хлорамбуцила в субстанции. При этом навеска препарата растворяется в смеси ацетона и воды, и титрование проводится раствором едкого натра в присутствии фенолфталеина.
Метод ВЭЖХ для субстанций рекомендуется только ЦБР для определения содержания циклофосфами-да, при этом в качестве внутреннего стандарта используют раствор этилпарабена.
Для количественного определения цифелина и амиронина в субстанциях применяется метод сжигания в колбе с кислородом, описанный во всех ведущих фармакопеях [4; 20; 22; 31]. Сжигание в кислороде дает водорасторимые неорганические продукты, которые определяются методом меркуриметрического титрования с использованием в качестве индикатора дифенил-карбазона. Сочетание метода сжигания в кислороде с предварительной проверкой однородности препаратов методом хроматографии в тонком слое сорбента, определением температуры плавления и данными УФ-спектрофотометрии гарантирует качество субстанций цифелина и амиронина.
Методы количественного определения производных ХЭА в лекарственных формах часто соответствуют ме-
тодам их определения в субстанциях, хотя и осложняются мешающим влиянием вспомогательных веществ и наполнителей. Необходимость извлекать основное вещество из таблеток специально подобранными растворителями увеличивает трудоемкость и уменьшает точность определения. Так, ВР для количественного определения циклофосфамида в инъекционной лекарственной форме и таблетках рекомендует использовать аргентометричес-кое титрование по Фольгарду, в лиофилизированной лекарственной форме отечественными производителями циклофосфамид титруется меркуриметрически после щелочного гидролиза [17], а израильская фирма «Тева» использует для количественного определения и определения однородности дозирования таблеток циклофосфа-мида метод Кьельдаля.
Наряду с этим для количественного определения в сложных лекарственных формах все шире используются различные физико-химические методы: УФ-спектрофотометрия и ВЭЖХ.
Метод прямой спектрометрии, основанный на способности производных ХЭА, имеющих в структуре бензольное кольцо, поглощать излучение в области 260 нм, успешно применяется для количественного определения сарколизина в лиофилизированной форме для инъекций, таблеток цифелина, амиронина и мелфалана [1; 13; 20].
Повышение эффективности контроля качества производных ХЭА по показателю «Количественное определение» достигается применением метода ВЭЖХ. Метод рекомендован Американской и Британской фармакопеями для контроля качества таблеток циклофосфамида, хлорамбуцила, мелфалана, а также для инъекционных форм этих лекарственных средств. В качестве стандартных образцов используют специально синтезированные и охарактеризованные стандарты ЦБР и БигРЪ. Определение проводят методом внутренней нормализации без использования внутреннего стандарта для таблеток мелфалана или с использованием внутренних стандартов — этилпарабена (для анализа циклофосфамида), пропилпарабена (для анализа хлорамбуцила). В качестве подвижной фазы для контроля качества таблеток мелфалана рекомендуется 0,025 М раствор диэтиламина в смеси метанола и воды (1:1), доведенный до рН 5,5 3,5 М раствором хлористоводородной кислоты; раствор ледяной уксусной кислоты в этиловом спирте (хлорамбуцил) или смесь воды и ацетонирила (70:30) — для анализа циклофо-сфамида. Определение обычно проводят в изократиче-ском режиме [19]. Использование специально разработанных методик ВЭЖХ (в основном, в градиентном режиме) позволяет производителям одновременно проводить количественное определение, оценивать подлинность и содержание примесей. Однако отсутствие в России государственных фармакопейных стандартов делает нецелесообразным использование данного метода отечественными производителями.
Анализ данных периодической литературы показывает, что в исследованиях производных ХЭА авторы используют в основном современные физико-химиче-
ские методы. Так, для определения подлинности наряду с ИК-спектроскопией и УФ-спектрофотометрией предлагаются методы масс-спектрометрии в сочетании с ВЭЖХ. Некоторые авторы [25] советуют использовать для идентификации производных ХЭА метод высокоэффективной хроматографии в тонком слое сорбента. Метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ) не нашел широкого применения в контроле качества производных ХЭА, т. к. не подходит для анализа термолабильных и неустойчивых соединений [26].
Для количественного определения производных ХЭА многие авторы предлагают спектрофотометрию в видимой области спектра, используя реакцию образования полиметиновых красителей (реакция Фуджи-вары) в различных вариантах и реакцию с у-(4-нитро-бензил)-пиридином [9].
Но наибольшее внимание в настоящее время в анализе производных ХЭА уделяется методу ВЭЖХ. Данный метод используется как для качественного и количественного определения, так и исследования стабильности в различных условиях [6-12].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в фармакопеях последних лет и нормативных документах ведущих зарубежных фирм для характеристики противоопухолевых лекарственных средств производных ХЭА наряду с классическими химическими методами все шире используются физико-химические методы, прежде всего хроматография в тонком слое сорбента — для установления подлинности и определения специфических примесей и высокоэффективная жидкостная хроматография — для определения примесей и количественного определения. Перспективы дальнейшего развития методов анализа и стандартизации производных ХЭА заключаются в наиболее полном использовании спектральных и хроматографических методов, рациональном их сочетании как между собой, так и с химическими методами, с учетом разрешающей способности каждого из них.
ЛИТЕРАТУРА
1. Арзамасцев А. П., Полозкова А. П., Шпрах 3. С. и др. // Химико-фармацевтический журнал. — 1998. — № 2. — С. 78-79.
2. Блохин Н. Н., Переводчикова Н. И.Химиотерапия опухолевых заболеваний. — М., 1998. — 304 с.
3. Государственная Фармакопея СССР. Х издание. — М., 1968. — 1079 с.
4. Государственная Фармакопея СССР. Х1 издание. — М., 1987. — Т. 1. — 336 с.
5. Ларионов Л. Ф. Химиотерапия злокачественных опухолей. — М., 1982. — 464 с.
6. НД 42-11372-00.
7. НД 42-1670-00.
8. НД 42-3705-00.
9. НД 42-3734-99.
10.НД 42-5058-01.
11.НД 42-6447-01.
12.НД 42-9748-99.
13.Оборотова Н. А., Шпрах 3. С., Смирнова Л. И. и др. // Химико-фармацевтический журнал. — 2001. — Т. 35, № 12.
— С. 39-45.
14.Оборотова Н. А., Смирнова Л. И., Зимакова Н. И. и др. // Российский онкологический журнал. — 2001. — № 5. — С. 46-48.
15.Смирнова Л. И., Оборотова Н. А., Шпрах 3. С. идр. // Вестник РОНЦ РАМН. — 2001. — № 4. — С. 49-52.
16.ФС 42-2026-99.
17. ФСП 42-1107-01.
18.Шпрах 3. С. Совершенствование методов стандартизации и контроля качества противоопухолевых лекарственных средств, производных хлорэтиламина на основе аминокислот: Дис. ... канд. фарм. наук. — М., 1996. — 215 с.
19.Bosanquet A. G., Gilby E. D. // J. Chromat. — 1982. — Vol. 232, No. 2. — P. 345-354.
20.British Pharmacopoeia. — London: Stationary Office, 2001.
— Vol. 1. — 1744 p. — Vol. 2. — 2651 p.
21.Erhsson H., Eksborg S., Wallin I. et al. // J. Pharm. Sci. — 1980. — Vol. 69. — P. 1091-1094.
22.European Pharmacopoeia. 3rd Edition. Council of Europe, Strastburg, France, 2001. — 1705 p.
23.Furner R. L., Vellet L. V., Brown R. K. // Drug Metab. Disp.
— 1976. — Vol. 4, No. 6. — P. 577-578.
24.Golumbic C., Fruton J. S., Bergman M. // J. Org. Chem. — 1986. — Vol. 11. — P. 518-535.
25.Handbook of thin-layer chromatography / Ed. by J. Sherma andB. Fried. — N.Y.: Marcel Dekker, 1991. — 1047p.
26.Jennings W. Analytical Gas Chromatography. — San-Diego, Ca: Academic Press, 1987. — 259 p.
27.Kensler T T., Behme R. J., Brooke D. // J. Pharm. Sci. — 1979. — Vol. 68, 2, 10. — P. 172-174.
28.Lunn G., Sunsone E. B., Andrews A. W. et al. // J. Pharm. Sci.
— 1989. — Vol. 78, No. 8. — P. 652-659.
29.Shprakh Z., Oborotova N., Kikotj B., Zimakova N. // 9th International Pharmaceutical Technology Symposium (IPTS-98), Procced. — Turkey, 1998. — P. 175-176.
30. Tchikineva N., Yavorskaya N., Golubeva I. et al. // 3rd International Symposium on Pharmaceutical Chemistry, Proceed. — Turkey, 2001. — P. 195-196.
31.The U.S.Ph., 24 rev. — US Pharmacopoeial Convention, INC. — 2569 p.
