CC BY
42
АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ POA PRATENSIS L. В УСЛОВИЯХ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПОЧВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ IRAP-МАРКЕРОВ
Н.М. ДЕВЯТОВА (фото),
студент,
Н.Н. БЕЛЬТЮКОВА, Т.Н. СВЕТЛАКОВА, аспиранты, А.В. СУСЛОНОВ,
соискатель, Пермский государственный университет А.В. НАЗАРОВ (фото), кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН
Ключевые слова: нефтяное загрязнение почв, Poa pratensis L., IRAP-метод, полиморфизм IRAP-маркеров, генетическое разнообразие.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ № 07-04-96016-р_урал_а.
Цель и методика исследований
Вследствие своей производственной и энергетической значимости нефть играет важную роль в жизни человечества. Но вместе с тем увеличивается и количество нефтяных загрязнений. Опасность данного загрязнителя прежде всего связана с высокой чувствительностью к нему высших растений, притом что они занимают ключевое положение практически во всех наземных экосистемах, определяя существование и состав остальных биологических компонентов биогеоценозов. На чувствительности высших растений основаны методы биоиндикации окружающей среды. Такие методы позволяют оценить комплексное влияние загрязнителей на среду.
Методы и критерии оценки влияния нефтяного загрязнения на растения довольно разнообразны. В области изучения влияния загрязнения нефтью на
полиморфизм ДНК растений интересным является использование ретрот-ранспозонов в качестве праймеров в полимеразной цепной реакции (PCR). Известно, что в растениях мобильные элементы составляют более половины ДНК [1]. В качестве повторяющихся последовательностей ретротранспозо-ны рассеяны по всему геному; в связи с этим они удобны для ДНК-генотипи-рования растений [2].
Сбор материала для изучения влияния нефтяного загрязнения на растения производился на опытном стационаре Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (г. Пермь) в дер. Ключи Добрянского района Пермского края. Экспериментальные площадки были заложены в дерново-подзолистой почве злаково-разнотравного лугового биоценоза. В 1996 и 1999 годах площадки площадью 1 м2 были перекопаны с уборкой растительности и залиты не-
614990, г. Пермь, ул. Букирева, д. 15; тел.: 8-9048447803,
8-9226440847;
e-mail: natashi4-vyatka@yandex.ru, nntihomirova@mail.ru
614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13; тел. 8-9504440888; e-mail: nazarov@iegm.ru
фтью концентрацией 24 л/м2. Также для исследования был взят материал с контрольных площадок.
На этих же экспериментальных площадках проводились исследования структуры и разнообразия микробных сообществ. Описано изменение качественного и количественного состава микроорганизмов, влекущее за собой изменения в микробно-растительных взаимодействиях. Разработаны рекомендации по биорекультивации нефте-загрязнённых почв.
Для исследования был выбран распространённый в луговых сообществах вид Poa pratensis L. из семейства Poaceae. Злаки относятся к одним из наиболее устойчивых по сравнению с остальными растениями. Вид был представлен на всех площадках разного года загрязнения, а также на
Oily soils, Poa pratensis L., IRAP-method, IRAP-markers polymorphism, genetic diversity.
46
Аграрный вестник Урала
№ 2 (68), 2010 г.
Биология
контрольных площадках.
Целью нашей работы являлось непосредственное изучение генетического разнообразия растений, произрастающих в условиях нефтезагрязнённых почв, с применением IRAP-метода на примере P pratensis.
Для разработки и апробации методики молекулярно-генетического анализа из листьев P. pratensis была выделена ДНК. Всего было взято 90 особей P. pratensis: 30 особей с площадок 1996 года, 30 - с площадок 1999 года и 30 особей -с контрольных площадок, не загрязнённых нефтью. Для выделения ДНК брали пробы из 100 мг листьев по методике [2] с незначительными модификациями.
При исследовании генетического разнообразия растений был избран IRAP-метод (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism). I RAP-метод представляет собой анализ полиморфных участков ДНК, амплифицированных между рет-ротранспозонами. Ретротранспозоны -мобильные генетические элементы, широко распространённые в геномах эукариот. В некоторых случаях число их копий может составлять более 70% ядерного генома [3]. Для создания праймеров использовались последовательности LTR (Long Terminal Repeats - длинные концевые повторы).
Амплификация проводилась с использованием 5 I RAP-праймеров в термоциклерах «Терцик» (НПФ «ДНК-Техно-логия», г. Москва) и MJ Mini Cycler (BioRad, USA). Всего была проведена амплификация 450 проб ДНК. Продукты амплификации разделяли путём электрофореза в 2,0%-ном агарозном геле в 1х ТВЕ буфере, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. В качестве отрицательного контроля (К-) в реакционную смесь для проверки чистоты реактивов добавляли вместо ДНК 5 мкл деионизированной воды.
Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100 bp + 1,5 + 3 КЬ DNA Ladder) (ООО «СибЭнзим-М», г. Москва). Определение длин фрагментов проводилось с использованием программы Quantity One в системе гель-документации Gel Doc XR (Bio-Rad, USA).
Для проведения компьютерного анализа молекулярно-генетического полиморфизма были использованы программа Popgen32 и макрос GenAlEx6. Па-
раметры, взятые для исследования: доля полиморфных локусов (р095), общее число аллелей (na), эффективное число аллелей (ne), ожидаемая гетеро-зиготность (He) [4]. Уровень внутрипо-пуляционного разнообразия оценен через показатели среднего числа морф (ц) и доли редких морф (h) [5].
Достоверность различий между показателями генетической изменчивости определялась по критериям Стьюдента, Фишера и Уилкоксона при уровне достоверности 0,95 [6].
Результаты исследований
Для проведения анализа генетической изменчивости растений при нефтяном загрязнении на примере P. pratensis рекомендуется методика выделения ДНК [2] с применением СТАВ, которая позволила выделить ДНК без примесей фенолов. Для амплификации ДНК отобраны 5 наиболее информативных IRAP-праймеров из 20, синтезированных в ЗАО «Синтол» и ЗАО «Евроген» (г. Москва).
При амплификации ДНК P. pratensis с 5 IRAP-праймерами было выявлено 77 фрагментов ДНК. С помощью одного IRAP-праймера в среднем было ампли-фицировано 15 фрагментов ДНК (рис.). Число амплифицированных фрагментов ДНК на праймер варьировало от 11 (праймер 2159) до 21 (праймер 2165) (табл. 1). Число амплифицированных фрагментов ДНК P. pratensis с каждым из праймеров по годам загрязнений и в контроле было одинаковым. Амплифи-цированные фрагменты ДНК были отнесены к мономорфным, если частота их встречаемости была >0,95. Фрагменты с меньшей частотой встречаемости были отнесены к полиморфным. Доля полиморфных фрагментов ДНК оказалась недостоверно выше в контрольных образцах по сравнению с образцами, взятыми с опытных площадок (р095<1,96).
Матрицы бинарных признаков, в которых наличие или отсутствие в IRAP-спектрах одинаковых по размеру фрагментов рассматривалось соответственно как состояние 1 или 0, были обработаны в компьютерных программах Popgen32 и специализированного макроса GenAlEx6 для MS Excel для определения показателей генетического разнообразия (табл. 2).
Предпринята попытка оценки генетического разнообразия в исследуемых выборках посредством показателям ц-
Таблица 1
Характеристика амплифицированных фрагментов ДНК P pratensis при нефтяном загрязнении почв
Прай- мер Нуклеотидная последовательность (5-3') Pазмеры фраг- ментов Число ампли- фициро- ванных фраг- ментов ДНК Доля полиморфных фрагментов
1996 г. 1999 г. конт- роль
Х5 GGA ATG ATA GGC CTT GCC 460-2720 13 0,9231 0.8461 0,9231
2151 ACA ACT CCA CGC TTG TCC GCT CC 180-1100 12 0,7500 0,6667 0.8333
2159 AGC GAA TCA ACA GGG GCT GCC CGA 250-1370 11 0.8182 0,8182 0,8182
2165 GTT CT CCTT ACT AGCCG AT GTGGG A 370-2680 21 0,7000 0,8000 0,8500
2182 GT GT CTTT GCACT AGGT AG AG G ACC 260-3230 20 0,8095 0,8095 0,8571
Всего 77 0,8002 0,7881 0,8563
среднее число морф в выборке. Исходными данными для этого анализа являются частоты морф (в нашем случае -частоты проявления фрагмента ДНК). Наряду со средним числом морф определена доля редких морф (h). Этот показатель даёт новую в сравнении с ц информацию о характере генразнообразия. В то время как м даёт оценку степени разнообразия выборки, показатель h оценивает структуру этого разнообразия (табл. 2). Достоверность отличий между показателями ц и h оценивали с помощью u-критерия [5]. Значение ц для контрольных образцов оказалось достоверно выше значения ц для образцов, взятых с площадок 1996 года загрязнения, и недостоверно выше ц образцов, взятых с площадок 1999 года загрязнения. Значения этого показателя для площадок разной давности загрязнения оказались отличными на достоверно значимом уровне (u>1,96). Значения показателя h на контрольных и опытных площадках отличаются на уровне ниже достоверно значимого.
Функцией от доли полиморфных ло-кусов, числа аллелей на локус и вырав-ненности частот аллелей является эффективное число аллелей (ne). Таким образом, оно является мерой генетического разнообразия. Эффективное число аллелей оценивает величину, обратную гомозиготности, и представляет собой такое число аллелей, при одинаковой частоте которых гетерозиготность будет равна фактической. Абсолютное и эффективное число аллелей на локус (в нашем случае - на фрагмент ДНК) оказалось недостоверно выше в контрольных образцах (табл. 2).
Выводы. Рекомендации
Таким образом, в нашем исследовании уровня генетического разнообразия P. pratensis с 5 IRAP-праймерами мы выявили повышенные значения показателей генразнообразия у особей P.
Рисунок. IRAP-спектр особей Роа pratensis L. с праймером 2165, произрастающих на экспериментальных площадках 1999 г. Цифрами обозначены номера проб. М - маркер молекулярного веса. Стрелками указаны некоторые полиморфные фрагменты
№ 2 (68), 2010 г.
Аграрный вестник Урала
47
Биология - Агрономия
pratensis контрольных площадок по сравнению с особями площадок, загрязнённых нефтью в 1996 и 1999 годах, на недостоверно высоком уровне. На данных особях, произрастающих на тех же экспериментальных площадках, также были проведены исследования на выявление изменений уровня генразнообразия с применением ISSR-метода (Inter-Simple Sequence Repeat) (работа в печати). В данных исследованиях при использовании двух разных методов изучались разные участки генома P. pratensis. Были получены схожие закономерности при разных уровнях достоверности: показатели генетического разнообразия выше у образцов P. pratensis контрольных площадок по сравнению с об-
Таблица 2
Сравнение показателей генетического разнообразия P. pratensis в условиях нефтяного загрязнения почв
Давность загрязнения Па Пе He Показатели разнообразия
h
1996 г. 1,8442 (0,3651) 1,5881 (0,3405) 0,336 (0,019) 1,7388 (0,0300) 0,1308 (0.0152)
1999 г. 1,8312 (0,3771) 1,6312 (0,3491) 0,360 (0,019) 1,6028 (0,0348) 0,1512 (0.0178)
Контроль 1,8571 (0,3522) 1,6356 (0,3307) 0,375 (0,016) 1,7662 (0,0278) 0,1171 (0.0140)
П римечание: па - абсолютное число аллелей на локус; пе - эффективное число аллелей на локус; Не - ожидаемая гетерозиготность; в скобках даны стандартные отклонения; м - среднее число морф; И - доля редких морф.
разцами, взятыми с площадок, загрязнённых нефтью в 1996 и 1999 годах, на достоверно значимом уровне с исполь-
зованием ISSR-метода и на уровне ниже достоверно значимого при применении ^АР-метода.
Литература
1. Гвоздев В. А. Подвижная ДНК эукариот. Роль в регуляции активности генов и эволюции генома // Соросовский образовательный журнал. 1998. № 8. С. 15-21.
2. Torres A. M, Weeden N. F., Martin A. Linkage among sozyme, RFLP and RAPD markers in Vicia faba // Theor Appl. Genet. 1993. V. 5. P. 937-945.
3. Kumar A., Bennetzen J. Plant retrotransposons // Annu. Rev.Genet. 1999. V. 33. P. 479-532.
4. Kimura M., Crow J. F. The number of alleles that can be maintained in a finite population // Genetics (US). 1964. V. 49. P. 725-738.
5. Животовский Л. А. Показатель внутрипопуляционного разнообразия // Журнал общей биологии. 1980. T. 41. № 6. C. 828-836. Лакин Г. Ф. Биометрия : учеб. пособие для биол. спец. вузов. Изд. 4-е, перераб. и доп. М. : Высшая школа, 1990. 352 с.
