CC BY
162
УДК: 582.675.1:575.174.015.3
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПАСПОРТИЗАЦИЯ ПОПУЛЯЦИЙ РЕДКИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ РОДА ADONIS С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ISSR- И IRAP-MAPKEPOB*
С.В. БОРОННИКОВА
(Кафедра ботаники и генетики растений Пермского государственного университета)
Молекулярно-генетический анализ популяций A. sibirica Patrin ex Ledeb. и Adonis vernalis L. выявил общие и специфические для этих видов сочетания длин амплифицированных фрагментов ДНК с использованием ISSR- и IRAP-методов. Предлоясен принцип генетической паспортизации и штрих-кода популяций редких видов растений, который может найти применение как при разработке мер охраны и восстановления природных популяций, так и при идентификации растительного сырья лекарственных растений.
Ключевые слова: геномика, идентификация, полиморфизм, редкие виды.
Современные молекулярно-генети-ческие технологии позволяют изучать тонкую структурно-функциональную организацию геномов различных организмов. Анализ генетической изменчивости пород животных, сортов растений и штаммов микроорганизмов, идентификация и паспортизация хозяйственно-ценных особей стали возможны благодаря получению специфических геномных маркеров ДНК. С помощью произвольных праймеров идентифицировали генотипы видов рода Рапах (АгаИасеае) [5], а впоследствии и эндемичного вида ОхуЬгофв скапкаеп-ягя «Ти^г. (ГаЪасеае) [1]. Работы по мо-лекулярно-генетической идентификации сортового материала растений проводятся в основном на важнейших продовольственных [2,4], а также ягодных культурах [10, 12]. Идентификация генотипов растений проведена с помощью ПЦР анализа рассеянных повторяющихся последовательностей 11173 [6], разработаны основы паспортизации зерновых [3,15] и ягодных культур [14].
* Работа выполнена при частичной :
Значительно меньше внимания уделено анализу генетической изменчивости природных популяций, особенно редких и ресурсных видов растений. Весьма актуальной является проблема идентификации растительного сырья у близкородственных лекарственных видов растений, таких как виды рода Adonis.
В геномах растений и животных количество микросателлитных повторов очень велико, что делает ISSR-метод (Inter-Simple Sequence Repeat) очень эффективным и удобным в генетическом анализе. Основой ISSR-ме-тода или анализа полиморфных участков ДНК между микросателлитами является ПЦР с одним или несколькими праймерами длиной в 15-24 нуклеотида, но праймеры состоят из тандемных коротких 2~4 нуклеотидных повторов и одного селективного нуклеотида на З'-конце праймера [19, 7]. ISSR не требует предварительного клонирования и секвенирования фрагментов для подбора праймеров и хорошо воспроизводим в строгих условиях
вдержке гранта РФФИ № 07-04-96032.
реакции. IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) — это анализ полиморфных участков ДНК, ам-плифицированных между ретротранс-позонами [16, 17]. В качестве повторяющихся последовательностей ретро-транспозоны рассеяны по всему геному; в связи с этим они удобны для ДНК-генотипирования растений [7, 15]. При идентификации растительного сырья лекарственных растений, при мониторинге состояния природных популяций редких и исчезающих видов растений, для рекомендаций мер их охраны и при их восстановлении после антропогенных воздействий важна обобщенная генетическая характеристика по типичным для данного рода, вида, популяции ДНК-маркерам.
Объекты исследований и методика
В качестве объектов исследований были избраны 6 природных популяций двух редких лекарственных и декоративных видов растений из семейства Ranunculaceae Juss.: Adonis vernalis L. и Adonis sibirica Patrin ex Ledeb. с категорией угрожаемого состояния 3 (R) — редкие виды [4, 9]. Молекулярно-генетический анализ 6 популяций двух видов рода Adonis проведен в 2006-2008 гг. Исследованы три популяции A. vernalis: первая (Avl) расположена на остепненном лугу около с. Михино Ординского района, вторая (Av2) — в березовом редколесье около д. Мерекай Уинского района, третья (Av3) — на остепненном лугу около с. Ишимово Октябрьского района Пермского края. Для выявления общих для двух близкородственных видов ДНК-маркеров исследованы 3 популяции A. sibirica в Добрянском, Кишертском и Ильинском районах Пермского края. Для анализа молекулярно-генетического полиморфизма ДНК 2 видов рода Adonis были собраны листья в каждой популяции с 30 случайно выбранных растений на расстоянии от 30 до 50 м друг от друга. Для выделения ДНК использовали методику, приведенную в [18]
с незначительными модификациями. Выявление генетического полиморфизма ДНК проводили в ПЦР-лаборато-рии Пермского государственного университета ISSR- [19] и IRAP-методом [16]. Клонирование [11] и секвенирова-ние ДНК, а также дизайн праймеров проведены в лаборатории растительной геномики института Биотехнологии университета Хельсинки (Финляндия) [8]. В ЗАО «Синтол» и «Евроген» (Россия) синтезированы 10 ISSR-прайме-ров, а 70 IRAP-праймеров — в «MWG» (Германия). Реакционная смесь для полимеразной цепной реакции объемом
25 мкл содержала: 2 единицы Taq-no-лимеразы («Силекс М»), 2,5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР (Силекс М), 25 пМ праймера, 2,5 мМ Mg2+, 0,25 мМ dNTP, 5 мкл геномной ДНК. На смесь наслаивали 2 капли минерального масла. Амплификацию ДНК двух видов рода Adonis проводили в термоциклере «Терцик» (НПФ «ДНК-Техно-логия», Москва) с использованием ISSR-праймеров по следующей программе: предварительная денатурация 94°С, 2 мин.; первые пять циклов 94°С, 20 с; t отжига, 10 с; 72°С, 10 с; в последующих тридцати пяти циклах 94°С,
5 с; t отжига, 5 с; 72°С, 5 с. Последний цикл элонгации длился 2 мин при 72°С. Температура отжига в зависимости от от G/С состава праймеров варьировала от 46 до 56°С. IRAP-амплификацию проводили по следующей программе: предварительная денатурация 94°С,
4 мин; 32 цикла 94°С, 40 с; t отжига, 1 мин; 72°С, 2 мин. Последний цикл элонгации длился 5 мин при 72° С. Температура отжига в зависимости от G/C состава праймеров варьировала от 46 до 60°С. В качестве отрицательного контроля (К-) в реакционную смесь для проверки чистоты реактивов добавляли вместо ДНК 5 мкл деионизированной воды. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1,7% агарозном геле в 1х ТВЕ буфере, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ульт-
рафиолетовом свете с помощью системы гельдокументации «Gel-Doc»(Bno-рад, США). Определение длины фрагментов ДНК проводили с помощью программы «Quantity One» с использованием маркера молекулярной массы (100 Ьр+1.5+3 Kb DNA Ladder) («ООО-СибЭнзим-М», Москва). ПЦР-анализ геномной ДНК особей изучаемых популяций и суммарной выборки повторяли не менее трех раз. Учитывали только хорошо воспроизводимые в повторных экспериментах фрагменты ДНК, интенсивность фрагментов не брали в расчет. Компьютерный анализ полученных данных проведен с помощью программы PopGen32 и специализированного макроса GenAlEx6 для MS-Excel.
Результаты и их обсуждение
При изучении полиморфизма ДНК
б других новых популяций двух видов рода Adonis нами были отобраны наиболее информативные 4 ISSR- и
5 IRAP-праймеров, длина амплифи-цированных фрагментов ДНК при ISSR-анализе варьировала от 210 до 1610 пн , а при IRАР-анализе — от 215 до 2530 пн (табл. 1). В среднем при ISSR-анализе один праймер инициировал синтез 14, а при IRАР-анализе —
26 фрагментов ДНК (рис. 1).
Предлагается отличная от часто встречающейся [10, 13] запись фрагмента ДНК с указанием типа фрагмента (родовой, видовой, полиморфный),
Таблица 1
Характеристика фрагментов ДНК, избранных для паспортизации двух видов рода Adonis
Обозна- чение праймера Нуклеотидная последовательность (5' —»3') Размеры выявленных фрагментов ДНК, пн ПЦР-фрагменты ДНК, избранные для паспортизации
мономорфные полиморфные
длина, пн обозначение длина, пн обозначение
ISSR (AC)8 cg 270-1570 630 Av р 630 мі 470 Av р470 мі
Ml 380 AD r380 мі 450 As р450мі
ISSR (AC)8CT 240-1390 480 AD r 480 м3 780 Av p 780 мз
М3 340 As v 340 м3 820 As p 820M3
ISSRM12 (CA)6G 210-1610 830 Av v 830 m 12 460 Av p460 міг
550 As v 550 mi2 750 As p 750мі2
ISSR (AGC)6G 310-1730 490 Av v490 xii 950 Av p 950 xii
Xll 550 AD , 550 xii 320 As p 320 xi i
1RAP TTA GAC CCG GAA CCG 215-2530 310 AV у 3 10 IR75 650 Av p 650 IR75
2175 CCG TG 420 Av v420 [R75 610 AV p 6 1 0 IR75
1510 AS у 1510 IR75 350 Av p 350 ]R75
IRAP GAA GTA CCG ATT TAC 400-2630 1480 Av у 1480 iR97 1370 Av p 1370 1R97
2197 TTC CGT GTA 1310 AD r 1310 IR97 880 Av p 880 1R97
480 Av v 480 1R97 760 Av p 760 [R97
930 AS у 930 ]R97 440 Av p 440 [R97
IRAP АТС CTT CGC GTA GAT 310-2800 850 AD r 850 ir98 1360 Av p 1360 |R98
2198 CAA GCG CCA 640 Av p 640 IR98 1030 Av p 1030 |R98
430 As у 430 ]R98 2120 As p 21 20jr98
IRAP TGG CGC TTG АТС TAC 320-2170 980 As v980 [ro2 620 Av p 620 iR02
2202 GCG AAG GA 530 Av v530 iro2 750 As p 750ir04
IRAP AAC TTG АТС CAG АТС 340-2980 510 Av v 510 iro4 750 Av p750 iro2
2204 АТС ТСС 710 Av у 710 iro4 590 Av p 590 iro4
Примечание: ADr— фрагменты ДНК, общие для двух видов рода Adonis; Avv и Asv— фрагменты ДНК, характерные для каждого вида; Avp и Asp — полиморфные фрагменты ДНК.
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
А
1 2 3 4 5 6 7 8 К- 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Б
Рис. 1. 188Р-спектр популяции А. \zernaHs (Ау1) около с. Михино с праймером М1 (А) и 1РАР-спектр популяции А. vernalis (АуЗ) около с. Ишимово с праймером 1И2204 (Б): цифрами обозначены номера проб, М — молекулярный маркер, с фрагментами размером сверху вниз 2000 пн, 1500 пн., 1000 пн, 900 пн, 800 пн и т.д.; К — отрицательный контроль, стрелками указаны некоторые полиморфные фрагменты ДНК
длины фрагмента и указания праймера нижним индексом, например, Avv630Mi- Нами выявлены фрагменты ДНК, общие для особей двух видов рода Adonis, которые мы предлагаем назвать «родовыми» и обозначить первыми буквами названия рода AD с указателем «г» от «rod» нижним индексом, например, ADr550xn- Эти фрагменты ДНК являются надвидовыми, среди них могут быть как присущие роду, так и более высоким таксонам, но мы предлагаем оставить название «родовые», имея ввиду, что эти фрагменты
четко воспроизводятся у особей изучаемого рода. Четко воспроизводимые при ПЦР-анализе только у особей одного вида фрагменты ДНК предлагается назвать «видовыми» и обозначить как Av и As с указанием «V» от «vid», например, Avv830Mi2- Полиморфные фрагменты ДНК предлагается обозначить индексом «р» от «polimorph», например, Avp650lR75-
Для паспортизации особей рода Adonis и двух изученных видов были выделены четко воспроизводимые 17 моно-морфных и 20 полиморфных фрагмен-
тов ДНК (см. табл.1). Мономорфные фрагменты ДНК позволили идентифицировать принадлежность особи и к роду, и к виду, а полиморфные фрагменты ДНК при их различных сочетаниях позволили составить уникальный генетический паспорт популяций. Как родовые, так и видовые фрагменты ДНК в основном установлены с использованием ISSR-метода. С помощью этого же метода возможна и идентификация листьев лекарственного вида A.vernalis, применяемого в качестве лекарственного сырья для получения сердечных гликозидов, не обладающих кумулятивным эффектом. Для паспортизации видов рода Adonis мы отобрали по 4 фрагмента ДНК, общих и специфических для двух изучаемых видов этого рода (табл. 2). Это минимальное число фрагментов ДНК, с помощью которых нам удалось провести паспортизацию. Природные популяции или группы близкорасположенных популяций можно охарактеризовать разными сочетаниями полиморфных фрагментов ДНК, причем главную роль в данном случае играют полиморфные фрагменты ДНК, амплифицированные IRAP-методом. В качестве примера приведены молекулярно-генетические формулы 3 популяций A. vemalis, расположенные в островной Кунгурской лесостепи (см. табл.2).
Сочетания полиморфных фрагментов ДНК не совпадают ни у одной из
изученных популяции, что позволяет их рекомендовать для генетической паспортизации популяций редких видов растений. Помимо буквенно-цифровой записи молекулярно-генетического паспорта популяций предлагается графическая запись в виде штрихкода. Родовые фрагменты предлагается обозначить толстой линией, видовые — линией средней толщины, а полиморфные фрагменты — тонкой линией. Для штрих-кода предлагается использовать 10 штрихов, из которых четыре характерны для рода, четыре — для вида, а два — для популяции. Фрагменты ДНК в штрих-коде располагаются в зависимости от их длины от большего к меньшему (рис. 2). Как молекулярно-генетическая формула, так и штрих-код позволят идентифицировать принадлежность как растительного сырья, так и отдельных особей не только к роду и виду, но и к определенной группе популяций А. г>ег-паИз или А. эгЫНса.
Заключение
Молекулярно-генетическая паспортизация ресурсных видов растений включает в себя следующие этапы: выбор эффективных методов анализа полиморфизма ДНК, сбор материала, подбор эффективных праймеров, молекулярно-генетический анализ с использованием ПЦР, выявление идентификационных маркеров ДНК, моно-
Таблица2
Молекулярно-генетическая паспортизация 3 популяций A.vernalis
Обозначение популяции Тип фрагментов ДНК Молекулярно-генетическая формула
Avl Rod AD r550xiь AD r850 Щ98; AD , 480 мз? AD r 380 mi
Vid Av v 830 м 12 5 Av v V10 jr04 Av v 630 Мь Av v 490 xn
Polimorph Av p 900 mi2 ; Av p 620 [R02; Av p 440 1R97; Av p 350 1R75
Av2 Rod AD , 550xib AD r850 ir.98? AD r 480 мз? AD r 380 mi
Vid Av v 830 mi2> Av v 710 1R04 ; Av v 630 мь Av v 490 x 11
Polimorph Av p 1200 1R97; Av p 760 1R97; Av p620 iR02; Av p 610 1R75
Av3 Rod AD , 550 xiь AD r850 ir98j AD r 480 мз> AD r 380 mi
Vid Av v 830 M12 5 Av v 710 1R04; Av v 630 мь Av v 490 xi i
Polimorph Av p 1100 iR98; Av p 8801R97; Av p 750 [R02; Av p 650 ^75
Маркер Штрих-код Номер Обозначение
молекулярного фрагмента фрагмента
веса, пн ДНК
900 ---------------- 1 Аур 880 ір97
^■ 2 Айг 850^98
_______ 3 А\/У830мі2
800
______ 4 АУу710|РО4
-------------- 5 Аур650|К75
6 А\/у630м1
600
■■■■■■■I 7 А0Г 550хп
500 8 Ауу 490x11
______ 9 АОг475мз
400 ■■■■■■■ 10 А0г380м1
Рис. 2. Генетический штрих-код популяции АчЗ А vernalis около д. Ишимово Октябрьского района Пермского края
морфных и полиморфных фрагментов ДНК, составление молекулярно-гене-тической формулы, штрих-кода и генетического паспорта [2]. Для молекулярно-генетической паспортизации ресурсных растений нами рекомендуются ИЗБЕ, и ШАР методы, которые в совокупности позволяют выявить полиморфизм большей части генома изучаемых видов растений, являются стабильными, дают четко воспроизводимые результаты. ГОАР-метод анализа полиморфных фрагментов ДНК апробован на 5 редких видах Пермского края, имеющих высокий фармацевтический потенциал. Именно данный метод анализа полиморфизма ДНК перспективен для выявления генетических механизмов адаптации популяционных систем в гетерогенной среде. Нами впервые клонированы и секвенирова-
ны последовательности ДНК пяти редких и фармацевтически значимых ресурсных видов растений Пермского края [8]. Секвенированные последовательности ДНК пяти редких лекарственных видов растений размещены в мировой базе генетических данных «ОепВапк» (иБА) (№ Е191000-ЕП91012).
Предлагаемая методика молекуляр-но-генетической паспортизации является относительно недорогой и при наличии эффективных ШАР праймеров пригодна для массового анализа. Разработанный на примере редких лекарственных видов растений принцип паспортизации может являться моделью, которая рекомендуется для паспортизации сортов продовольственных культур и идентификации растительного сырья лекарственных растений.
Библиографический список
Артюкова Е.В., Холина А.Б., Козыренко М.М., Журавлев Ю.Н. Анализ генетической изменчивости редкого эндемичного вида Oxytropis chankaensis Jurtz. (Fabaceae) на основе RAPD маркеров // Генетика. 2004. Т. 40, № 7. С. 877-884.
Боронникова С.В. Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация редких и находящихся под угрозой исчезновения видов растений. Перм. ун-т. Пермь, 2008.
Глазко Т.Т., Глазко В.И. Молекулярно-генетические подходы в селекции зерновых // Известия ТСХА. 2006. №4. С. 100“ 107.
Горчаковский П.Л., Шурова Е.А. Редкие и исчезающие растения Урала и Пре-дуралья. М.: Наука, 1982.
Журавлев Ю.Н., Козыренко М.М., Артюкова Е.В. и др. ПЦР—генотипирование женьшеня с использованием произвольных праймеров // Докл. Академии наук. 1996. Т.349, №1. С.111-114.
Зайцев B.C., Хавкин Э.Е. Идентификация генотипов растений с помощью ПЦР-анализа рассеянных повторов последовательностей R173 // Докл. РАСХН. 2001.№2. С. 3-5.
Календарь Р.Н., Глазко В.И. Типы молекулярно-генетических маркеров и их применение // Физиология и биохимия культурных растений. 2002. Т.34. №.4. С.141—156.
Календарь Р.Н., Боронникова С.В. Анализ молекулярно-генетического полиморфизма природных популяций редких видов растений Урала с помощью ретрот-ранспозонов // Материалы Четвертого Московского международного конгресса (Москва, 12-16 марта 2007 г.). М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И.-Менделееева, 2007.4. 2.
Красная книга Пермского края / науч. ред. А.И. Шепель. Пермь: Книжный мир, 2008.
Малышев С.В., Урбанович О.Ю., Картель Н.А. Идентификация и паспортизация сортов сельскохозяйственных культур (мягкой пшеницы, картофеля, томата, льна и свеклы) на основе ДНК-маркеров: методические рекомбинации. Минск, 2006.
Молекулярная генетика: учеб.-метод. пособие / под. ред. С.В.Боронниковой. Пермь, 2007.
Оганисян А.С., Кочиева Е.З., Рысков А.П. Маркирование видов и сортов картофеля с помощью метода RAPD-PCR // Генетика. 1996. Т.32, №3. С.448-451.
Падутов В.Е., Баранов О.Ю., Воропаев Е.В. Методы молекулярно-генетического анализа. Минск, 2007.
Соболев В.В., Карлов Г.И., Соболева А.Г., Озеровский А.В., Казаков И.В., Феськов А.А. Использование ISSR-маркеров для молекулярно-генетической идентификации и паспортизации сортов малины // Сельскохозяйственная биология. 2006. №5. С.48-52.
Цветков И.А., Иванов А.Н., Глазко В.И. Генетическая дифференциация сортов риса по IRAP маркерам // Известия ТСХА. 2006. №4. С.155-159.
Kalendar R., Grob Т., Regina М., Suoniemi F., Schulman A. IRAP and REMAP: two new retrotransposon-based ДНК fingerprinting techniques // Theor. Appl. Genet. 1999. V. 98. P. 704-711.
Kalendar, R., Schulman, A. IRAP and REMAP for retrotransposon-based genotyping and fingerprinting // Nature Protocols. 2006. №.1(5). P. 2478 - 2484.
Torres A.M., Weeden N.F., Martin A. Linkage among sozyme, RFLP and RAPD markers in Vicia faba // Theor. Appl. Genet. 1993. V.5. P. 937-945.
Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. 1994. V.20. P. 176-183.
Рецензент — д. с.-х. н. В.И. Глазко
SUMMARY
Molecular-genetic analysis of Adonis vernalis L. and A. sibirica Patrin ex Ledev. reveals common and specific for these two species Adonis combinations of amplificated DNA fragments length, ISSR and IRAP techniques used. The principle of genetic sertification and bar code of rare species populations which may be used both in rare plants renewal and in identification of drug crops raw material has been offered in the article.
