CC BY
133
Известия ТСХА, выпуск 1. 2008 год
УДК 575:174.015
АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОМ ИЗМЕНЧИВОСТИ ПОПУЛЯЦИЙ ДВУХ РЕДКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВИДОВ РОДА ADONIS С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ISSR-MAPKEPOB
С.В. БОРОННИКОВА, Н.Н. ТИХОМИРОВА
(Кафедра ботаники и генетики растений Пермского государственного университета)
Проведено изучение генетического полиморфизма ДНК двух редких ресурсных видов растений с использованием ISSR-маркеров. Рассчитаны показатели, характеризующие уровень полиморфизма и генетического разнообразия. Получены данные о выраженных межвидовых отличиях по сочетанию длин ампли-фицированных фрагментов ДНК двух видов рода Adonis. Для популяционно-генетического мониторинга генофондов лесных редких видов растений предложен способ определения уровня генетического разнообразия.
Одним из важнейших достижений науки и практики минувшего века явилось то, что леса планеты стали рассматриваться в общественном сознании как один из глобальных факторов обеспечения устойчивого развития человечества и экологической безопасности его жизнедеятельности. Доказано, что леса — наиболее емкий резервуар генетического разнообразия организмов [12].
Для разработки стратегии сохранения и рационального использования лесных ресурсов, обеспечивающих удовлетворение экономических потребностей общества и охрану биоразнообразия природных сообществ, необходимы глубокие знания о состоянии их генофондов, оцениваемых уровнями внутри- и межпопуляцион-ного генного разнообразия. Для мониторинга генофондов ресурсных видов растений в соответствии с современным уровнем развития науки требуются количественные оценки популя-ционно-генетических параметров с помощью молекулярно-генетических маркеров.
Особое место среди ресурсных видов растений занимают травянистые лекарственные виды, большая часть которых из-за антропогенного воздействия является редкими. При использовании лекарственных видов растений важна идентификация растительного сырья, так как близкие виды растений, используемые в качестве лекарственных, могут обладать различным фармацевтическим потенциалом.
Цель нашей работы — провести анализ генетической изменчивости двух редких лекарственных видов растений на популяционном уровне. На основе полученных в ходе выполнения данной работы и при обобщении ранее полученных результатов установить принцип определения уровня генетического разнообразия как основы популяционно-генетического мониторинга генофондов лесных ресурсных видов растений с использованием мо-лекулярно-генетических маркеров, пригодных для молекулярно-генетической идентификации и паспортизации лесных ресурсных видов растений.
Работа выполнена при частичной поддержке гранта РФФИ № 07-04-96032.
Материалы и методы
В качестве объектов исследований были избраны редкие лекарственные и декоративные виды растений Пермского края из семейства Ranunculaceae Juss.: Adonis vemalis L. и Adonis sibirica Patrin ex Ledeb. с категорией угрожаемого состояния 3 (R) — редкие виды [5, 9]. Сбор материала проведен в 20032007 гг.; молекулярно-генетический анализ — в 2006-2007 гг. Исследования проводили на уровне ценопопуля-ций, т. е. конкретных популяций, расположенных в пределах данного фитоценоза. Исследованы три ценопо-пуляции A. vemalis : первая (Avl) расположена в Октябрском районе в 2,5 км к северо-западу от с. Богородск на суходольном лугу около оз. Карасье, вторая (Av2) — в 2,5 км к востоку от д. Иштеряки Октябрского района, на правом берегу р. Сухой Телес, третья (Av3) — в березовом редколесье в Кунгурском районе на Спасской горе в 4 км от с. Плеханово. Изучение це-нопопуляций A. sibirica проводили на территории Добрянского и Кишерт-ского районов. Первая ценопопуляция A. sibirica (Asl) расположена в травянистом ельнике около п. Полазна, вторая — в мелколиственном лесу на территории УНБ «Предуралье» (As2).
Для анализа молекулярно-генетичес-кого полиморфизма ДНК двух видов рода Adonis были собраны листья с 30 случайно выбранных растений, в каждой ценопопуляции на расстоянии от 30 до 50 м друг от друга. В дальнейшем выборку уменьшили до 24 особей.
Для выделения ДНК использовали методику [20] с незначительными модификациями. При выделении ДНК из проростков брали навески по 50, а из свежесобранных листьев — по 100 мг. Выявление генетического полимор-.физма ДНК проводили ISSR- (Inter Simple Sequence Repeats) методом [21]. Реакционная смесь для полимеразной цепной реакции объемом 25 мкл содер-
жала: 2 единицы Taq-полимеразы («Силекс М»), 2,5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР (Силекс М), 25 пМ праймера, 2,5 мМ Mg2+, 0,25 мМ dNTP. На смесь наслаивали 2 капли минерального масла. Амплификацию ДНК двух видов адонисов весеннего проводили с использованием 5 ISSR-прай-меров, синтезированных в ЗАО «Син-тол» и «Евроген» (Москва).
Амплификацию проводили в термо-циклере «Терцик» (НПФ «ДНК-Технология», Москва) для ISSR-анализа по следующей программе: предварительная денатурация 94°С, 2 мин; первые пять циклов 94"С, 20 с; t° отжига, 10 с; 72°С, 10 с; в последующих тридцати пяти циклах 94°С, 5 с; t отжига, 5 с; 72°С, 5 с. Последний цикл элонгации длился 2 мин при 72°С. Температура отжига в зависимости от G/С состава праймеров варьировала от 46 до 56°С [3]. В качестве отрицательного контроля (К-) в реакционную смесь для проверки чистоты реактивов добавляли вместо ДНК 5 мкл деионизированной воды. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 2%-м ага-розном геле в 1х ТВЕ буфере, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100 bp +1.5 + 3 КЬ DNA Ladder) («ООО-СибЭнзим-М», Москва),' определение длин фрагментов проводили с использованием программы Photoshop 8.0.
Для проведения молекулярно-гене-тического анализа была выделена ДНК из 120 образцов листьев и проростков. Фрагменты листьев и семена для проращивания были собраны в пяти цено-популяциях двух редких ресурсных видов растений. Анализ полиморфизма ДНК проведен у 624 проб ДНК посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием ISSR-метода.
Для количественной оценки степени полиморфизма и определения уров-
ня дивергенции между изученными ценопопуляциями полученные данные были представлены в виде матрицы бинарных признаков, в которой наличие или отсутствие в ISSR-спектре одинаковых по размеру фрагментов рассматривалось соответственно как состояние 1 или 0. При этом учитывали только воспроизводимые в повторных экспериментах фрагменты, полиморфизм по интенсивности не брали в расчет.
Проведен компьютерный анализ молекулярно-генетического полиморфизма ДНК с помощью компьютерной программы PopGen32 и с помощью специализированного макроса GenAlEx6 для MS-Excel [2,11] с определением: доли полиморфных локусов (при р0,95) [13], общего числа аллелей (па), эффективного числа аллелей (пе) [16], ожидаемой гетерозиготности (Не) [18]. Для оценки генетического разнообразия внутри и между популяциями была выбрана информационная мера Шеннона [14], традиционно применяемая для оценки генетического разнообразия редких видов растений на популя-ционном уровне [1]. Индекс разнообразия Шеннона рассчитывали для каждой ценопопуляции (Н0), среднее значение — для популяций (Нрор) и для
суммарной выборки (Н.р), на основе этих значений определяли долю внутри- и межпопуляционного разнообразия.
В качестве показателей оценки генного разнообразия мы использовали следующие параметры: общее генное разнообразие в суммарной выборке (Нт), среднее выборочное генное разнообразие по всем локусам (Н.) и показатель подразделенности популяций ^т) [17, 18]. Генетическое расстояние между ценопопуляциями определяли по формуле М. Nei [17, 19].
Статистическая обработка данных проведена по методикам [7, 10].
Результаты и их обсуждение
У двух редких лекарственных видов (А. vemalis и А. sibirica) изучено генетическое разнообразие в пяти це-нопопуляциях. Выявление полиморфизма длин амплификационных фрагментов ДНК, получаемых в результате ПЦР, проведено с использованием полиморфизма межмикросателлитной ДНК (ISSR-метод). В трех изученных ценопопуляциях А. vemalis выявлено 72 амплифицированных фрагмента ДНК, 67 из которых были полиморфными (табл. 1). Число амплифициро-ванных фрагментов ДНК в суммарной
Таблица 1
Характеристика фрагментов ДНК двух видов рода Adonis
ISSR-прай-мер Нуклео-тидная последовательность (5'® 3') Размеры фрагментов, ПН Число полиморфных фрагментов в популяциях (их частота) Число фрагментов
Av1 Av2 Av3 учитываемых полиморфных
Adonis vemalis
М1 (АС)в Св 400-1900 12 (0,8571) 13(0,9286) 9 (0,6429) 14 13(0,9286)
М2 (АС)вСС 360-1650 8 (0,7273) 8 (0,7273) 7 (0,6364) 11 9(0,8182)
МЗ (АС)вСТ 400-1700 9 (0,6923) 10(0,7692) 9 (0,6923) 13 12 (0,9231)
М9 (вАС)4 320-1550 14(1,0000) 13(0,9286) 10 (0,7143) 14 14(1,0000)
М12 (СА)еО 400-1750 14 (0,7000) 16 (0,8000) 14 (0,7000) 20 19(0,9500)
Всего 57 (0,7916) 60 (0,8333) 49 (6,6806) 72 67 (0,9306)
Adonis sibirica
As1 As2
М1 (АС)8 СО> 320-1550 4 (0,4000) 6 (0,6000) 10 6 (0,6000)
М12 (СА)бв 450-1750 7(0,4118) 9 (0,5294) 17 14 (0,8235)
Всего 11 (0,4059) 15 (0,5647) 27 21 (0,7117)
выборке растений варьировало в зависимости от праймера от 7 (М2) до 16 (М12). В среднем при ISSR-анали-зе один праймер инициировал синтез 14 фрагментов ДНК (рис. 1). Число полиморфных фрагментов в суммарной выборке растений A. vemalis варьировало от 9 до 19, а их размеры — от 320 до 1900 пн. Уровень полиморфизма в суммарной выборке в зависимости от ISSR-праймера колебался от 81,82 до 100% и в среднем составил 93,06%.
Уровень полиморфизма амплифи-цированных фрагментов ДНК A. ver-
nalis, полученных в результате ПЦР со всеми ISSR-праймерами, в Avl составил 79,16%, в Av2 — 83,33% и в Av3 — 68,06%. Праймер М3 выявил самые низкие значения полиморфизма в популяциях, а праймер М9 — самые высокие. Уровень полиморфизма в суммарной выборке в зависимости от ISSR-праймера колебался от 81,82 до 100% и в среднем составил 93,06% (см. табл. 1).
В двух изученных ценопопуляциях A. sibirica ISSR-праймеры инициировали синтез 27 фрагментов ДНК, 21
Рис. 1. ISSR-спектр ценопопуляции A. vemalis (Av3), A. sibirica (As2) с праймером М12: цифрами обозначены номера проб, М — молекулярный маркер, с фрагментами размером сверху вниз 2000 пн, 1500 пн., 1000 пн, 900 пн, 800 пн и т.д.; стрелками указаны некоторые полиморфные фрагменты ДНК
из которых были полиморфными, доля полиморфных локусов составила 71,17% (см. табл. 1). Размеры фрагментов варьировали от 230 до 1750 пн. Доля полиморфных локусов в первой ценопопуляции А. vemalis (Л.1) составила 40,59, во второй ценопопуляции (ЛБ2) — 56,47%.
Самой распространенной мерой генетической изменчивости в популяции является гетерозиготность. Теоретически гетерозиготность распределяется в популяции сложным образом, а величины гетерозиготности не слишком зависят от количества аллелей [13]. Эффективное число аллелей (пе) является функцией от доли полиморфных локусов, числа аллелей на локус и выравненности частот аллелей и, таким образом, мерой генетического разнообразия популяции или вида. Эффективное число аллелей оценивает величину, обратную гомозиготнос-ти, и представляет собой такое число аллелей, при одинаковой частоте которых в популяции гетерозиготность будет равна фактической. Абсолютное число аллелей на локус (в нашем случае на фрагмент ДНК) на общую выборку Л. vemalis составило 1,93. Этот параметр выше в Av2, ниже его значение в Av1 и в Av3. Эффективное число аллелей на локус (пе) на общую выборку по ISSR-праймерам равно 1,56. Больше значение пе в Av2. Ожидаемая гетерозиготность по локусам в общей выборке Л. vemalis по ISSR-
праймерам составила 0,332, в Av1 — 0,276, в Av2 — 0,337 ив Лv3 — 0,260 (табл. 2). У А. sibirica абсолютное число аллелей на локус ниже и составило 1,74, а эффективное число аллелей на локус отличается незначительно — 1,51 (см. табл. 2). Ожидаемая гетерозиготность на общую выборку А. sibirica также ниже и равна 0,286.
М. Ней [18] назвал величину гете-розиготности генным разнообразием и на ее основе ввел понятия: общее генного разнообразия в суммарной выборке (Нт) — гетерозиготность на всю выборку, среднее выборочное генного разнообразия по всем локусам (Н.) — средняя гетерозиготность по популяциям и показатель подразделенное™ популяций ^зт). Показатель общего генного разнообразие на всю выборку Л. vemalis по ISSR-методу составил 0,3317, а среднего генного разнообразия — 0,2913. Таким образом, средняя гетерозиготность А. vemalis в изученных ценопопуляциях ниже, чем в суммарной выборке. Коэффициент подраз-деленности ценопопуляций по
ISSR-методу показывает, что на меж-популяционную компоненту генетического разнообразия А. vemalis приходится 12,19% разнообразия (табл. 3).
Среднее значение гетерозиготнос-ти (Н.) в изученных ценопопуляциях А^Лтса ниже, чем у А. vemalis и составило 0,1736 (см. табл. 3). Показатель генетической подразделенности популяций ^зт) А^Лтса трижды пре-
Таблица 2
Абсолютное и эффективное число аллелей, ожидаемая гетерозиготность
Ценопопуляция
Па
Пе
Не
Av1 Av2 Av3
На общую выборку
As1
As2
На общую выборку
1,7917(0,4090) 1,8333(0,3753) 1,6667(0,4747) 1,9306(0,2560) 1,4074(0,5007) 1,5556(0,5064) 1,7407(0,4466)
1,4916(0,3382) 1,6061(0,3651) 1,4677(0,4091) 1,5658(0,3194) 1,2403(0,3390) 1,3485(0,3792) 1,5097(0,4037)
0,276(0,021) 0,337(0,021) 0,260(0,025) 0,332(0,023) 0,130(0,037) 0,204(0,039) 0,286(0,041)
Примечание. па — абсолютное число аллелей на локус; п, — эффективное число аллелей на локус; Не — ожидаемая гетерозиготность; в скобках даны стандартные отклонения.
Параметры генного разнообразия [18]
Таблица 3
ISSR-праймер
Нт
Hs
GsT
М1 М2 МЗ М9 М12
На общую выборку
М1 М12
На общую выборку
Adonis vemalis 0,3623(0,0217) 0,3052(0,0164)
0,2774(0,0404) 0,2567(0,0369)
0,3265(0,0207) 0,2823(0,0195)
0,3303(0,0165) 0,2952(0,0154)
0,3452(0,0208) 0,3040(0,0192)
0,3317(0,0225) 0,2913(0,0198)
Adonis sibirica
0,2433(0,0529) 0,3116(0,0348) 0,2863(0,0409)
0,1901(0,0447) 0,1639(0,0231) 0,1736(0,0299)
0,1575 0,0746 0,1352 0,1063 0,1192 0,1219
0,2185 0,4739 0,3935
Примечание. Нт — общее генное разнообразие в суммарной выборке; Н8 — среднее выборочное генное разнообразие по всем локусам; С8т — показатель подразделенности популяций; в скобках даны стандартные отклонения.
вышает аналогичный показатель A.vemаlis (см. табл. 3). На межпопуля-ционную изменчивость у данного вида приходится 39,35%.
Оценка внутри- и межпопуляцион-ного разнообразия была проведена также на основе информационного индекса Шеннона [14], традиционно применяемого для оценки генетического разнообразия редких видов растений [1]. Среднее значение индексов разно-
образия Шеннона в изученных цено-популяциях А. vemalis, рассчитанное по ISSR-праймерам, составило 42,52% (табл. 4). Выше этот показатель в Av2. Индекс Шеннона, рассчитанный на общую выборку А. vemalis, равен 49,13%. На долю внутрипопуляционно-го генетического разнообразия А. ver-nalis приходится 86,71, а на долю меж-популяционного — 13,28%. Среднее значение индексов разнообразия Шен-
Таблица 4
Генное разнообразие внутри и между ценопопуляциями (по индексу Шеннона)
ПраймерISSR
Н„
Av1
Av2
Av3
На
Нрор/ Нч
(Hjp-Hpop)/ Hsp
Adonis vemalis
М1 0,4628 0,5263
M2 0,4055 0,4152
МЗ 0,3540 0,4561
М9 0,4341 0,5622
М12 0,4147 0,4797
Среднее для вида 0,4142 0,4879
As1 As2
М1 0,2433 0,316
М12 0,1980 0,2952
Среднее для вида 0,2206 0,3056
0,3583 0,3132 0,4313 0,3321 0,4325 0,3734
0,5323 0,4148 0,4917 0,5034 0,5145 0,4913
Adonis sibirica
0,3532 0,4599 0,4065
0,4491 0,3779 0,4138 0,4428 0,4423 0,4252
0,2796 0,2466 0,2631
0,8437 0,9112 0,8415 0,8796 0,8596 0,8671
0,7917 0,5362 0,6639
0,1562 0,0887 0,1584 0,1203 0,1403 0,1328
0,2082 0,4637 0,3360
Примечание. Н0— индекс разнообразия Шеннона для ценопопуляции; Н,р — индекс разнообразия Шеннона для суммарной выборки; Нр^ — среднее значение индекса разнообразия Шеннона для цено-популяций; Нрор/ Н«, — внутрипопуляционное разнообразие; (Нц,- Нрор)/ Н«, — межпопуляционное разнообразие.
нона в изученных ценопопуляциях А^Лтса, рассчитанное по ISSR-прай-мерам, составило 26,31%. Индекс разнообразия для суммарной выборки (Н5р) значительно выше, чем индекс разнообразия каждой отдельной ценопо-пуляции (Н0) (см. табл. 4). Доля межпо-пуляционного разнообразия А^Ш-пса составила 33,60%.
Таким образом, оба подхода к определению генетического разнообразия, т. е. определение показателя под-разделенности популяций (GST) и коэффициента Шеннона, дали близкие результаты у изученных видов. При изучении лесных ресурсных видов растений можно рекомендовать оба подхода, но, на наш взгляд, метод определения показателя подразделенности популяций ^т), предложенный [18], более приемлем для видов, имеющих большую численность популяций, а определение индекса Шеннона — для редких видов растений с минимальной численностью популяций.
Наименьшее генетическое расстояние между исследуемыми ценопопу-ляциями а А. vemalis, рассчитанное по [17], отмечено между у Av1 и Av2 (0,0624). Ценопопуляции Лv2 и Лv3 характеризуются средним генетическим расстоянием — 0,3009. Наиболее генетически удаленными являются ценопопуляции Av1 и Лv3 (0,1111), что соответствует географическим расстояниям между ними. Генетическое расстояние между исследуемыми ценопо-пуляциями A.sibirica (As1 и Лs2) составило 0,3178, что также находится в соответствии с географическим расстоянием между этими ценопопуля-циями.
Таким образом, самые низкие показатели генетического разнообразия отмечены в первой ценопопуляции A.sibirica (As1), расположенной на Лунежских горах Добрянского района Пермского края (Р = 40,59%; Н0 = 0,22; Не = 0,13). Среди изученных ценопо-пуляций А. vemalis ниже уровень генетического разнообразия в третьей
ценопопуляции (Av3), расположенной на Спасской горе Кунгурского района (Р = 68,06%; Н0= 0,37; Не = 0,26). Именно эти ценопопуляции характеризуются резко сокращающейся и минимальной общей численностью.
При проведении молекулярно-ге-нетического анализа ценопопуляций A. vemalis и A.sibirica с помощью ISSR-метода нами были выявлены уникальные фрагменты ДНК, отмечены четкие мономорфные и полиморфные фрагменты ДНК, присутствующие в спектрах электрофореза ценопопуля-ций и суммарных выборок. Предлагаем на основе результатов, полученных при анализе генетического разнообразия ценопопуляций двух видов рода Adonis, проведение генетической паспортизации лекарственных видов растений с применением ISSR-метода, как более информативного и дающего воспроизводимые результаты. Данный молекулярно-генетический метод позволит в общей массе растительного сырья идентифицировать A. vemalis, обладающий значительно большим фармацевтическим потенциалом для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, нежели A.sibirica.
Заключение
Предлагаемый подход определения уровня генетического разнообразия, как основы популяционно-генетического мониторинга генофондов редких и ресурсных видов растений, был нами сформулирован и проверен при изучении шести ресурсных редких видов растений Пермского края, имеющих декоративное и лекарственное значение. Среди изученных ценопопуляций двух видов рода Adonis самые низкие показатели генетического разнообразия нами отмечены в первой ценопопуляции A.sibirica (Asl), расположенной на Лунежских горах Добрянского района Пермского края (Р = 40,59%; Н0 = 0,22; Не = 0,13). У A. vemalis ниже уровень генетического разнообразия в третьей ценопопуляции (Av3), расположенной на Спасской горе Кунгурского района (Р = 68,06%; Н0 =
= 0,37; Не = 0,26). Именно эти ценопо-пуляции характеризуются резко сокращающейся или минимальной общей численностью.
Для популяционно-генетического мониторинга генофондов редких ресурсных видов растений рекомендуется проводить количественные оценки популяционно-генетических параметров, полученных с помощью молекулярно-генетических маркеров. Анализ молекулярно-генети-ческого полиморфизма ДНК на популя-ционном уровне следует проводить с помощью разных поколений молекуляр-но-генетических маркеров, таких как ISSR- и ГОАР-маркеры [21, 15, 8, 6, 4, 3]. Уровень генетического разнообразия рекомендуем определять на основе следующих показателей [2]: процента полиморфных локусов (Р), ожидаемой ге-терозиготности (Не), индекса разнообразия Шеннона и доли внутри- и межпопуляционного разнообразия [17, 18, 19, 14]. Компьютерный анализ генетической изменчивости ДНК в различных популяциях в связи с массовым характером оценки параметров следует проводить с помощью компьютерной программы PopGen32 и с помощью специализированного макроса GenЛ1Ex6 для MS-Exce1 [2], с определением: доли полиморфных локусов (при Ро.эб) [13], общего числа аллелей (па), эффективного числа аллелей (пе) [16], ожидаемой ге-терозиготности (Не) [18]. Для оценки генетического разнообразия внутри и между популяциями редких видов растений рекомендуется информационная мера Шеннона [14, 1]. Индекс разнообразия Шеннона рекомендуется рассчитывать для каждой ценопопуляции (Н0), среднее значение — для популяций (Нрор) и для суммарной выборки (Н.р), на основе этих значений определять долю внутри-и межпопуляционного разнообразия.
В качестве показателей оценки генного разнообразия популяций рекомендуется использовать следующие параметры: общее генное разнообразие в суммарной выборке (Нт), среднее выборочное генное разнообразие по всем локусам (Н.) и показатель подразделен-ности популяций [17, 18]. Генети-
ческое расстояние между популяциями рекомендуется определять по формулам М. Nei [17, 19].
В связи с большей емкостью генетического разнообразия в лесных экосистемах рекомендуется разработку и апробацию стратегии сохранения и рационального использования растительных ресурсов проводить на примере как травянистых, так и древесных лесных ресурсных видов растений.
Таким образом, разработанный нами на примере редких ресурсных видов растений Пермского края новый подход определения уровня генетического разнообразия является методологической основой популяционно-генетического мониторинга генофондов редких и ресурсных видов растений, позволяющей определить закономерности динамики генофондов в норме и при антропогенных воздействиях.
ЛИТЕРАТУРА
1. Артюкова Е.В, Холина А.Б., Козы-ренко М.М. Анализ генетической изменчивости редкого эндемичного вида Oxytropis chankaensis Jurtz. (Fabaceae) на основе RAPD-маркеров // Генетика, 2004. Т. 40. № 7. С. 877-884. — 2. Борон-никова С.В. Популяционно-генетический мониторинг генофондов редких ресурсных видов растений Пермского края // Флора Урала в пределах бывшей Пермской губернии и ее охрана. Пермь, 2007. — 3. Боронникова С.В., Кокаева З.Г., Дрибнохофова О.П. и др. Анализ ДНК-полиморфизма реликтового вида Урала наперстянки крупноцветковой (Digitalis grandiflora grandiflora Mill.) с помощью RAPD- и ISSR-маркеров // Генетика, 2007.Т. 43. № 5. С. 1-7. — 4. Глазко Т.Т., Глазко В.И. Молекулярно-генетические подходы в селекции зерновых // Изв. ТСХА, 2006. № 4. С. 100-107. — 5. Гор-чаковский П.Л., Шурова Е.А. Редкие и исчезающие растения Урала и Преду-ралья. М.: Наука, 1982. — 6. Гостим-ский С. А., Кокаева 3. Г., Коновалов Ф.А. Изучение организации и изменчивости генома растений с помощью молекулярных маркеров // Генетика, 2005. Т. 41. № 4. С. 1-15. — 7. Животовский Л.А.
Статистические методы анализа частот генов в природных популяциях // Итоги науки и техники. Общая генетика. М.: ВИНИТИ АН СССР, 1983. Т. 8. С. 76104. — 8. Календарь Р.Н., Глазко В.И. Типы молекулярно-генетических маркеров и их применение // Физиология и биохимия культурных растений, 2002. Т. 34. №. 4. С. 141-156. — 9. Красная книга Среднего Урала (Свердловская и Пермская области): Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды животных и растений. Екатеринбург: Изд-во Урал, ун-та, 1996. — 10. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов. 4-е изд., перераб. и доп. М.: Высш. шк., 1990. — 11. Молекулярная генетика: учеб.-метод. пособие / Под. ред. С.В. Боронниковой; Перм. ун-т. Пермь, 2007. — 12. Писаренко А.И. Лесовосста-новление и лесоразведение — основа решения глобальных проблем изменения климата // Лесное хозяйство России:
начало третьего тысячелетия. М.: ВНИ-ИЛМ, 2003. С. 31-47. — 13. Хедрик Ф. Мир биологии: генетика популяций / Ф. Хедрик / Пер. с англ. А.А. Лушни-ковой, Н.В. Петровой. М.: Техносфера, 2003. — 14. Chalmers K.J., Waugh R., Sprent J.I. et al. // Heredity, 1992. V. 69. P. 465-472. — 15. Kalendar R., Grob T„ Regina M. et al. // Theor. Appl. Genet. 1999. V. 98. P. 704-711. — 16. Kimura M. The number of alleles that can be maintained in a finite population / Kimura М., Crow J.F // Genetics (US), 1964. Vol. 49. P. 725-738. — 17. Nei M. // Amtr. Natur, 1972. Vol. 106. P. 283-292. — 18. Nei M. // Columbia Univ. press, 1987. P. 176— 187. — 19. Nei M„ Li W.-H. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979. V. 76. P. 52695273. — 20. Torres A.M., Weeden N.F, Martin A. II Theor. Appl. Genet, 1993. V. 5. P. 937-945. — 21. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. // Genomics. 1994. V. 20. P. 176-183.
Рецензент — д. c.-x. н., проф. В.И. Глазко
SUMMARY
Genetic polymorphism DNA of 2 rare forest plant species was examined using ISSR techniques. Parameters of polymorphism and genetic diversity were determined. The data on expressied differentiation between species on combination of amplification products with different length of DNA fragments of 2 species Adonis were obtained. The principle of determining level of genetic diversity to monitoring of genetics of forest rare species has been offered.
