CC BY
16
Original articles
Оригинальные статьи
Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet Инфекция и иммунитет
2020, vol. 10, no. 2, pp. 315-328 2020, Т. 10, № 2, с. 315-328
АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ АПОПТОЗА И ВЫЖИВАНИЯ В ЛЕЙКОЦИТАХ КРОВИ ДЕТЕЙ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ ТЕЧЕНИЯ ВГЧ-6-ИНФЕКЦИИ
Н.А. Сахарнов1, О.В. Уткин1, Е.Н. Филатова1, Д.И. Князев1, Е.А. Кулова2, Н.Б. Преснякова1
1ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, Нижний Новгород, Россия
2 ФГБОУВО Приволжский исследовательский медицинский университет Минздрава России, Нижний Новгород, Россия
Резюме. Несмотря на исключительную распространенность вируса герпеса человека 6 типа (ВГЧ-6), молекулярные механизмы патогенеза ВГЧ-6 инфекции остаются во многом неизученными. В настоящее время не выявлено специфичных молекулярных факторов неблагоприятного течения ВГЧ-6 инфекции, которые позволили бы облегчить выбор адекватной терапии и предупредить развитие осложнений. Целью настоящей работы является анализ экспрессии генов сигнальных путей апоптоза и выживания в лейкоцитах крови детей 7—17 лет при различных формах течения ВГЧ-6-инфекции. Анализ проводился с помощью разработанных нами ДНК-микрочипов, позволяющих оценивать изменения уровней экспрессии как отдельных мРНК, так и суммарных уровней экспрессии генов (-X). В острой фазе ВГЧ-6 инфекции баланс уровней экспрессии исследуемых мРНК и генов смещался в сторону проапоптотических факторов, что может оказывать существенное влияние на чувствительность лейкоцитов к апоптозу. В фазе реконвалесценции большинство альтерированных уровней экспрессии мРНК и генов нормализовалось. Нами выявлен ряд мРНК и генов, уровни экспрессии которых значительно изменялись в острой фазе заболевания. По данным литературы такие факторы играют важную функциональную роль в регуляции исследуемых сигнальных путей. С целью поиска ВГЧ-6-ассоциированных факторов, влияющих на формирование клинической картины течения тяжелой герпесвирусной микст-инфекции, был проведен анализ выявленных нами значимых изменений уровней экспрессии мРНК и генов у пациентов с тяжелой ВГЧ-6+ВЭБ+ЦМВ микст-инфекцией и ВЭБ+ЦМВ микст-инфекцией средней тяжести по сравнению со здоровыми донорами. Обнаружены 5 мРНК (FAF1-NM_007051, DAPK2-NM_014326, CASP8AP2-NM_001137667, CASP8-NM_033356, BTK-NM_001287345) и 3 гена (FAS-X, Puma/BBC3-X, ITCH-X), уровни экспрессии которых значительно повышались при ВГЧ-6+ВЭБ+ЦМВ микст-инфекции и оставались неизменными при ВЭБ+ЦМВ микст-инфекции. Данные мРНК могут служить канди-датными прогностическими факторами риска развития тяжелых форм герпесвирусной инфекции с участием ВГЧ-6. Настоящая работа значительно расширяет существующие представления о молекулярных механизмах
Адрес для переписки:
Сахарнов Николай Александрович 603950, Россия, Нижний Новгород, ул. Малая Ямская, 71, ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной.
Тел.: 8 (831) 469-79-46 (служебн.); 8 950 624-87-12 (моб.). Факс: 8 (831) 469-79-20.
E-mail: [email protected]; [email protected]
Библиографическое описание:
Сахарнов Н.А., Уткин О.В., Филатова Е.Н., Князев Д.И., Кулова Е.А., Преснякова Н.Б. Анализ экспрессии генов сигнальных путейапоптоза и выживания в лейкоцитах крови детей при различных формах течения ВГЧ-6-инфекции // Инфекция и иммунитет. 2020. Т. 10, № 2. С. 315-328. Со1: 10.15789/2220-7619-ЕАО-1335
© Сахарнов Н.А. и соавт., 2020
Contacts:
Nikolai A. Sakharnov
603950, Russian Federation, Nizhny Novgorod, Malaya Yamskaya str., 71, Blokhina Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology.
Phone: +7 (831) 469-79-46 (office); +7 950 624-87-12 (mobile). Fax: +7 (831) 469-79-20.
E-mail: [email protected]; [email protected]
Citation:
Sakharnov N.A., Utkin O.V., Filatova E.N., Knyazev D.I., Kulova E.A., Presnyakova N.B. Expression analysis of apoptotic and survival genes in blood leukocytes of children with various forms of HHV-6 infection // Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet, 2020, vol. 10, no. 2, pp. 315-328. doi: 10.15789/2220-7619-EA0-1335
DOI: http://dx.doi.org/10.15789/2220-7619-EAQ-1335
патогенеза ВГЧ-6 инфекции с участием сигнальных путей апоптоза и выживания. Выявленные нами значимые изменения уровней экспрессии мРНК и генов с наибольшей вероятностью вносят вклад в патогенез ВГЧ-6 инфекции и тяжелой ВГЧ-6+ВЭБ+ЦМВ микст-инфекции.
Ключевые слова: ВГЧ-6 инфекция, тяжелая ВГЧ-6+ВЭБ+ЦМВ микст-инфекция, лейкоциты, экспрессия мРНК, сигнальные пути, апоптоз, ДНК-микрочипы.
EXPRESSION ANALYSIS OF APOPTOTIC AND SURVIVAL GENES IN BLOOD LEUKOCYTES OF CHILDREN WITH VARIOUS FORMS OF HHV-6 INFECTION
Sakharnov N.A.a, Utkin O.V.a, Filatova E.N.a, Knyazev D.I.a, Kulova E.A.b, Presnyakova N.B.a
a Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Nizhny Novgorod, Russian Federation bPrivolzhsky Research Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation, Nizhny Novgorod, Russian Federation
Abstract. Despite that human herpes virus type 6 (HHV-6) is extremely spread worldwide, molecular mechanisms of behind HHV-6 infection pathogenesis remain largely unexplored. No molecular markers were found linked to unfavorable course of HHV-6 infection which could allow to ease up selecting proper therapy and preventing development of complications. The aim of the study was to analyze expression of apoptosis and survival-related genes in blood leukocytes from 7-17-year-old children upon various forms of HHV-6 infection. The analysis was carried out by using DNA microarrays developed by us allowing to assess changes in expression level both of individual mRNAs and total gene set (-X). It was shown that during the acute phase of HHV-6 infection mRNA level was shifted toward pro-apoptotic factors. In the convalescence phase, most altered mRNA levels returned to normal. We have identified a set of mRNAs and genes whose expression level was significantly changed in acute disease phase. According to available data, these factors play an important role in regulation of studied signaling pathways. In order to search for HHV-6-associated factors, which markedly affect disease pattern of severe herpesvirus mixed infection, we analyzed significant changes of mRNA and genes expression levels in patients with severe HHV-6+EBV+CMV mixed infection and EBV+CMV mixed infection of moderate severity compared with healthy donors. The levels of 5 mRNAs (FAF1-NM_007051, DAPK2-NM_014326, CAS-P8AP2-NM_001137667, CASP8-NM_033356, BTK-NM_001287345) and 3 genes (FAS-X, Puma/BBC3-X, ITCH-X) were significantly increased in severe mixed infection comorbid with HHV-6 (EBV+CMV+HHV-6) but without HHV-6 (EBV+CMV) compared with healthy donors. Most of detected factors belong to Fas-mediated apoptosis pathway, and may be considered as candidate prognostic development factors of severe herpes virus infection involving HHV-6. This study profoundly extends existing understanding on molecular pathogenesis of HHV-6 infection involving apoptosis and pro-survival signaling pathways. Marked changes of mRNA and gene levels most likely contributed to the pathogenesis of HHV-6 as well as severe HHV-6+EBV+CMV mixed infection.
Key words: HHV- 6 infection, severe HHV- 6+EBV+CMV mixed infection, leukocytes, mRNA expression, signaling pathways, apoptosis.
Введение
Вирус герпеса человека 6 типа (ВГЧ-6) отличается исключительно широким распространением, его носителями является до 95% мирового населения. Инфицирование происходит преимущественно в раннем возрасте и сохраняется пожизненно [6, 7, 9]. ВГЧ-6 является этиологическим агентом внезапной экзантемы (розеолы) у детей [7, 25, 29], а также участвует в развитии инфекционного мононуклеоза [2, 3]. Реактивация ВГЧ-6 инфекции часто возникает у иммунокомпрометированных больных и может приводить к серьезным осложнениям, в том числе гепатиту, энцефалиту и пневмонии вплоть до летального исхода [6, 10]. При микст-инфекции ВГЧ-6 с другими герпесвирусами (ВЭБ — вирусом Эпштейна—Барр и ЦМВ — ци-томегаловирусом) усиливается степень выраженности и длительность клинических симптомов заболевания, повышается риск развития осложнений [12].
В настоящее время не выявлено специфических молекулярных факторов неблагоприятного течения ВГЧ-6 инфекции, которые позволили бы облегчить выбор адекватной терапии и предупредить возникновение осложнений. Это связано с недостаточной изученностью молекулярных механизмов патогенеза данного заболевания. По данным литературы ВГЧ-6 инфицирует широкий спектр клеток иммунной системы, проявляя выраженный тропизм к СВ4+ Т-лимфоцитам, моноцитам и ограниченно реплицируясь в СВ8+ Т-клетках, В-лимфоцитах, НК-клетках и макрофагах [2, 5]. Хорошо известно, что другие лимфотропные герпесвирусы (ВЭБ, ЦМВ) эффективно модулируют иммунные реакции путем изменения экспрессии генов, регулирующих активацию, пролиферацию и апоптоз в клетках иммунной системы [4, 11, 14, 15, 16, 17, 24]. Выраженное изменение экспрессии генов (в том числе на уровне мРНК), участвующих в регуляции сигнальных путей апоптоза и выживания в иммунных клет-
ках, может отражать молекулярные механизмы иммунопатогенеза ВГЧ-6 инфекции. Для комплексного анализа экспрессии большого количества мРНК традиционные методы исследования (ОТ-ПЦР и его различные варианты) являются трудоемкими и финансово затратными. Одним из возможных инструментов для решения таких задач являются ДНК-микрочипы, которые позволяют провести одновременную детекцию и полуколичественный анализ нескольких тысяч мРНК [1].
Целью настоящей работы является анализ экспрессии генов сигнальных путей апоптоза и выживания в лейкоцитах крови детей, инфицированных ВГЧ-6, при различных формах течения инфекции.
Материалы и методы
Материалом исследования явились образцы периферической крови, полученные от детей и подростков 7—17 лет в острой фазе ВГЧ-6 инфекции средней тяжести (К = 21), в острой фазе ВЭБ+ЦМВ-микст-инфекции средней тяжести (К = 9) и в острой фазе тяжелой ВГЧ-6+ ВЭБ+ЦМВ микст-инфекции (К = 9). Далее производили повторное взятие образцов крови у тех же пациентов в фазе реконвалесцен-ции при отсутствии клинических и лабораторных признаков заболевания в среднем через 2 2—2,5 месяца от начала манифестации заболе- ^ вания. В качестве группы сравнения использо- ® вались образцы периферической крови практически здоровых доноров сопоставимого пола и возраста (К = 23) (табл. 1).
В работе использовались остаточные коли- ф ~
чества образцов, полученных для проведения ^
гс я
стандартных диагностических исследований с а.
в клинической практике. Информированное £ а.
согласие родителей или опекунов на проведе- ф 2
ние исследовательской работы в соответствии ;§
с Хельсинской декларацией было получено ле- ^ т§
чащими врачами клиники. ф -2
Характеристика пациентов. Набор груп- 2 о
пы пациентов проводился на базе ГБУЗ НО ^ 2
ДГКБ № 27 «Айболит» г. Нижнего Новгорода. £ ш
Клинические симптомы герпесвирусной ин- о я
фекции оценивались на основании физикаль- ^
ного исследования и лабораторных данных. ^ ^
Ведущими клиническими симптомами паци- ® -2
ентов были острый тонзиллит, тонзиллофарин- ^ о
гит, лимфаденопатия, гепатоспленомегалия, ® ®
лихорадка, фебрильный судорожный приступ, 1 с
реже — инфекционная экзантема. Из лабора- 1 ^
торных анализов пациентам проводился общий ^ (определение доли атипичных мононуклеарных о клеток) и биохимический (определение уров-
> а
х 2
оа о
ней ферментов печени — АсАТ и АлАТ) анализ \о :§ крови (табл. 1). Выявление этиологических аген-
s ^
о _ ,гс я
Размеры поднижнечелюстных, околоушных и заднешейных лимфатических узлов, см Dimensions of sub-mandibular, parotid and posterior cervical lymphatic nodes, cm 1,5-2,5 1,5-2,5 2,0-6,5 1
Кратность повышения уровней AcAT и АлАТ по сравнению с нормой Increase AST, ALT levels compared with normal values АсАТ, АлАТ в 1-3 раза AST and ALT 1-3 normal values АсАТ, АлАТ в 2-3 раза AST and ALT 2-3 normal values АсАТ в 2-6 раз, АлАТ 1-5 раз AST 2-6 normal values, ALT 1-5 normal values 1
% атипичных мононуклеарных клеток % atypical mononuclear cells 8-15 9-10 13-25 1
Наличие ДНК ВГЧ-6, ВЭБ, ЦМВ Presence of DNA HHV-6, EBV, CMV ВГЧ-6+ HHV-6+ ВЭБ+ЦМВ+ EBV+CMV+ ВГЧ-6+ ВЭБ+ ЦМВ+ HHV-6+ EBV+ CMV+ 1
Наличие антител против ВГЧ-6, ВЭБ, ЦМВ Presence of antibody against HHV-6, EBV, CMV IgG (ВГЧ-6)+ IgG (HHV-6)+ IgM (ВЭБ)+ IgM (ЦМВ)+ IgM (EBV)+ IgM (CMV)+ IgM (ВЭБ)+ IgM (ЦМВ) + IgG (ВГЧ6)+ IgM (EBV)+ IgM (CMV)+ IgG (HHV-6)+ 1
Тяжесть заболевания Severity of disease средняя moderate средняя moderate тяжелая severe 1
Средний возраст, лет Average age, years old 10,5 12,5 13,5 CNI
Диагноз, количество образцов Diagnosis, number of samples Острая ВГЧ-6 инфекция Acute HHV-6 Infection N = 21 Острая ВЭБ+ЦМВ микст-инфекция Acute EBV+CMV mixed infection N = 9 Острая ВГЧ-6+ВЭБ+ЦМВ микст-инфекция Acute HHV-6+EBV+CMV mixed infection N = 9 Здоровые доноры Healthy donors N = 23
тов инфекции (ВЭБ, ЦМВ, ВГЧ-6) проводили на основании методов ИФА и ПЦР в реальном времени. С помощью наборов «Вектор-Бест» (Россия) определяли наличие антител классов ^М и ДО к антигенам ВГЧ-6, ВЭБ и ЦМВ в сыворотке крови пациентов. С помощью наборов «АмплиСенс® БВУ-СМУ-ННУ6-скрин^» методом ПЦР в реальном времени выявляли наличие ДНК ЦМВ, ВЭБ и ВГЧ-6 в образцах периферической крови пациентов. ВГЧ-6 инфекция диагностировалась при наличии в крови ДНК ВГЧ-6 и антител IgG к антигенам ВГЧ-6, а микст-инфекция при наличии в крови ДНК и антител IgM/IgG к антигенам ВЭБ, ЦМВ и ВГЧ-6 в разных сочетаниях. Тяжесть заболевания определялась по комплексным клиническим и лабораторным критериям. Большинство пациентов поступали в стационар в состоянии средней степени тяжести. Тяжелые случаи течения заболевания были выявлены при микст-инфекции ВЭБ+ЦМВ+ВГЧ-6. На основании полученных данных были сформированы группы исследования. Критериями включения пациентов в группы явились: возраст от 7 до 17 лет, установленные диагнозы «ВГЧ-6-инфекция средней тяжести», «ВЭБ+ЦМВ микст-инфекция средней тяжести», «тяжелая ВГЧ-6+ВЭБ+ЦМВ микст-инфекция». Критериями невключения явились: возраст младше 7 и старше 17 лет; наличие сопутствующей хронической патологии, влияющей на течение ВГЧ-6-инфекции (туберкулез, ВИЧ-инфекция, сахарный диабет, иммунодефицит). Характеристика клинических и лабораторных параметров пациентов исследуемых групп отражена в таблице 1. Все дети получали симптоматическое лечение герпесвирусной инфекции. В качестве этиотропной терапии ВГЧ-6 инфекции пациентам назначались противовирусные средства (ацикловир, рекомбинантный человеческий интерферон альфа-2 бета с таури-ном (рч1БНа2Р), ганцикловир с 12 лет) по показаниям.
В качестве группы сравнения были взяты образцы крови 23 клинически здоровых детей. Набор группы здоровых детей осуществлялся на базе поликлинического отделения ГБУЗ НО ДГКБ № 27 «Айболит» г. Нижнего Новгорода. В исследование включались пациенты, приходившие на плановый прием врача-педиатра и/или диспансеризацию. Критериями включения в группу здоровых детей были: возраст от 7 до 17 лет, отсутствие признаков хронической соматической патологии на момент осмотра, отсутствие установленных проявлений герпесвирусной инфекции (инфекционный мононуклеоз, внезапная экзантема, герпетический стоматит) в течение года до осмотра. Критериями невключения в группу здоровых детей были возраст младше 7 и старше 17 лет,
наличие эпизодов герпесвирусной инфекции в течение 3 месяцев до осмотра, наличие хронической соматической патологии.
Дизайн ДНК-микрочипа. С помощью разработанного нами ранее алгоритма «Splice variants microarray design pipeline» [27] были выбраны последовательности ДНК-зондов, специфичных для мРНК 201 гена сигнальных путей апо-птоза и выживания.
Дизайн ДНК-микрочипа моделировали на основе кодирующих (NM_Protein-coding) и некодирующих (NR_Non-protein-coding) последовательностей мРНК, аннотированных в базе данных Ref Seq NCBI (https://www.ncbi. nlm.nih.gov/refseq/). Разработанный микрочип содержал 316 ДНК-зондов для оценки уровней экспрессии сплайсированных изоформ мРНК разных генов (далее — уровни экспрессии мРНК), и 138 ДНК-зондов для оценки суммарных уровней экспрессии мРНК, являющихся продуктами одного гена (далее — уровни экспрессии гена, отмечены знаком X). Синтез ДНК-зондов проводили на слайдах 12K microarray in situ с помощью аппарата «B3 Synthesizer» (CustomArray Inc., США) в соответствии с рекомендациями производителя.
Пробопод готовка и гибридизация РНК. Образцы крови обрабатывали раствором «Гемо-литик» (ЦНИИЭ, Россия) для удаления эритроцитов. Из полученной фракции лейкоцитов выделяли тотальную РНК с помощью набора «Магно-сорб» (ЦНИИЭ, Россия) с последующей очисткой и концентрацией с помощью фенол-хлороформа. Тотальную мРНК (1,5—2 мкг) подвергали обратной транскрипции с помощью набора «Mint cDNA synthesis kit» (Евроген, Россия). Полученную кДНК амплифицировали в ходе ПЦР с помощью набора Encyclo («Евроген», Россия) по программе (95°С 25 с — 60°С 25 с — 72°С 6 мин). Амплифицированную кДНК (2 мкг) подвергали транскрипции с помощью набора «T7 RNA-polimerase» (Thermo Scientific, EU). Половина количества уридинтрифосфатов (UTP) в реакционной смеси была заменена на биотини-лированные уридинтрифосфаты (ДНК-синтез, Россия), в результате получали пул биотин-мече-ной РНК, обратно комплементарной мРНК исследуемого образца. Фрагментированную био-тин-меченую РНК (2 мкг) гибридизовали на микрочипы при 40°C в течение 18—20 ч. Процессинг микрочипов (блокирование, мечение, отмывка и внесение субстрата) выполняли с помощью набора «ElectraSense Detection Kit» (CustomArray Inc., США) в соответствии с протоколами производителя. Считывание сигналов гибридизации проводили амперометрическим методом с помощью прибора «ElectraSense Reader» и программы «ElectraSense application software» (CustomArray Inc., США).
Проточная цитофлуориметрия. В образцах исследуемых групп и в группе здоровых доноров был проведен анализ содержания субпопуляций лейкоцитов (CD45+), T-клеток (CD3+), T-киллеров (CD3+ CD8+), T-хелперов (CD3+ CD4+), дубль-позитивных T-клеток (CD3+ CD4+ CD8+), В-клеток (CD19+) и NK-клеток (CD16+ CD56+) (табл. 4). Подсчет количества клеток различных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови проводили методом 6-цветной проточной цитофлуориметрии. Использовали проточный цитофлуориметр «BD FACS Canto II» (Becton, Dickinson and Company, США). Для настройки напряжения на фотоумножителях и коэффициентов компенсации применяли калибровочные частицы «BD FACS™ 6-Color Setup Beads» (BD Biosciences, США). Расчет абсолютного и относительного содержания субпопуляций лимфоцитов периферической крови проводили с применением 6-цветной панели реагентов «BD Multitest™» (BD Biosciences, США) и программного обеспечения «BD FACS Canto clinical software» (BD Biosciences, США).
Алгоритм анализа данных. Расчет изменений относительных уровней экспрессии мРНК проводили по следующему алгоритму: полученные сигналы гибридизации в виде .ecd-файлов экспортировали в .csv-файлы с помощью программы «ElectraSense Analysis 3.4.2» (CustomArray Inc., США). Далее все расчеты проводили в свободно распространяемой среде программирования R версии 3.6.1 (The R Foundation for Statistical Computing, Inc.). Данные нормализовали с помощью алгоритма квантильной нормализации [28].
Полученные значения рассматривали в качестве относительных уровней экспрессии изучаемых мРНК (далее — уровней экспрессии мРНК). Для расчета изменений уровней экспрессии мРНК (FC/fold-change) использовали средние значения уровней экспрессии мРНК и генов в группах ВГЧ-6остр., ВГЧ-6рек., ВЭБ+ЦМВостр., ВЭБ+ЦМВрек., ВГЧ-6+ВЭБ+ ЦМВостр., ВГЧ-6+ВЭБ+ЦМВрек. и НОРМ. Показатель FC по отношению к норме рассчитывали по формуле: FC X (%) = (Хсред. х 100/ НОРМсред.) — 100, где X — название исследуемой группы.
Далее оценивалась статистическая значимость изменений уровней экспрессии мРНК. Для этого средние значения уровней экспрессии мРНК в группах исследования и у здоровых доноров сравнивали с помощью T-теста с поправкой на ожидаемую долю ложных отклонений (FDR/False discovery rate test) с расчетом показателя статистической значимости q. При q < 0,05 различия между средними значениями считали статистически значимыми.
Нами были сформулированы два основных критерия отбора значимых изменений уровней
экспрессии мРНК при ВГЧ-6 инфекции — значения q < 0,05 и |FC| > 20%. При |FC| < 20% изменения считались не значимыми и далее не рассматривались.
Анализ различий количества клеток субпопуляций лимфоцитов в исследуемых группах по сравнению со здоровыми донорами проводили с помощью непараметрического критерия Манна—Уитни—Вилкоксона при пороговом значении уровня значимости р < 0,05. Расчет корреляций уровней экспрессии мРНК с абсолютным содержанием субпопуляций лимфоцитов проводили с помощью критерия Спирмена при пороговом значении уровня значимости р < 0,05.
Результаты
Изменения уровней экспрессии мРНК при ВГЧ-6 инфекции
Нами проведен анализ уровней экспрессии мРНК и генов апоптоза и выживания в лейкоцитах крови детей в группе пациентов с острой ВГЧ-6 инфекцией средней тяжести и в фазе ре-конвалесценции по сравнению со здоровыми донорами. Анализируемые мРНК и гены были сгруппированы по функциональной роли в сигнальных каскадах. В результате анализа нами выявлен ряд значимых изменений уровней экспрессии мРНК и генов, описанных далее.
Из проапоптотических факторов внешнего пути апоптоза в острой фазе заболевания выявлялось повышение уровней экспрессии мРНК и генов, кодирующих лиганды рецепторов смерти (TRAIL/TNFSF10-X, HVEM-L/ TNFSF14-X), рецепторы смерти (FAS-X, DR3/ TNFRSF25-X, DR4/TNFRSF10A-NM_003844 и DR5/TNFRSF10B-X), медиаторы апоптоза (FADD-NM_003824 и FAF1-NM_007051, DAPK2-NM_014326, FLASH/CASP8AP2-NM_001137667), инициаторные каспазы (CASP8-NM_033356, CASP2-X) и Fas-активируемую киназу FASTK-X. В фазе реконвалесценции уровни экспрессии всех перечисленных мРНК нормализовались (табл. 2).
Среди проапоптотических факторов мито-хондриального пути апоптоза в острой фазе заболевания выявлялось повышение уровней экспрессии генов PUMA/BBC3-X и BAX-X. Из других проапоптотических факторов наблюдалось резкое повышение уровня экспрессии гена OMI/HTRA2-X, а также уровней экспрессии мРНК и генов элементов апоптосомы (CYCS-NM_018947, APAF-1-X, CASP-9-X). Из антиапо-птотических факторов в острой фазе заболевания детектировалось значительное повышение уровней экспрессии генов BCL2-X и BclXL/ BCL2L1-X, ITCH-X, а также уровня экспрессии мРНК ITCH-NM_001257138. В фазе реконва-
Таблица 2. Изменения уровней экспрессии мРНК (FC) в острой фазе ВГЧ-6 инфекции и в фазе реконвалесценции по сравнению со здоровыми донорами
Table 2. Changes of mRNA expression levels (FC) in acute phase of HHV-6 infection and in recovery phase compared to healthy donors
Название гена и номер мРНК в GenBank Gene name and mRNA number in GenBank FC (%) в острой фазе, значениеq FC% in acute phase, qVal FC (%) в фазе реконвалесценции, значениеq FC% in recovery phase, qVal Название гена номер мРНК в GenBank Gene name and mRNA number in GenBank FC (%) в острой фазе, значениеq FC% in acute phase, qVal FC (%) в фазе реконвалесценции, значениеq FC% in recovery phase, qVal
Лиганды рецепторов смерти Death receptors ligands Медиаторы апоптоза Mediators of apoptosis
TRAIL/TNFRelated Apoptosis Inducing Ligand/TNFSF10-E 39,05, q = 0,01 -4,65, q = 0,69 FAS-Associated Death Domain Protein/FADD-NM_003824 32,39, q = 0,01 5,83, q = 0,57
HVEM-L/Herpesvirus Entry Mediator Ligand/ TNFSF14-E 45,89, q = 0,01 1,80, q = 0,89 FAS-Associated Factor 1/FAF1-NM_007051 31,22, q = 0,01 -4,42, q = 0,65
Рецепторы смерти Death receptors Death Associated Protein Kinase 2/ DAPK2-NM_014326 43,38, q = 0,02 -1,29, q = 0,93
Fas Cell Surface Death Receptor/FAS-E 31,13, q = 0,03 -5,31, q = 0,62 FLASH/Caspase 8 Associated Protein 2/ CASP8AP2-NM_001137667 32,61, q = 0,04 -17,20, q = 0,15
DR3/Death receptor 3/ TNFRSF25-E 57,10, q < 0,01 4,46, q = 0,75 Fas-activated Serine/ Threonine Kinase/ FASTK-E 180,82, q < 0,01 31,43, q = 0,21
DR4/Death receptor 4/ TNFRSF10A-NM_003844 20,90, q = 0,03 -1,88, q = 0,82 Инициаторные каспазы Initiator caspases
DR5/Death receptor 5/ TNFRSF10B-E 42,95, q = 0,03 -9,36, q = 0,48 Caspase 8/CASP8-NM_033356 48,81, q = 0,04 -7,73, q = 0,63
- - - Caspase 2/CASP2-E 51,29, q = 0,01 -2,98, q = 0,81
Проапоптотические митохондриальные факторы Pro-apoptotic mitochondrial factors Антиапоптотические митохондриальные факторы Anti-apoptotic mitochondrial factors
PUMA/Bcl-2-Binding Component 3/BBC3-E 59,84, q = 0,01 4,50, q = 0,78 Apoptosis Regulator Bcl-2/BCL2-E 75,18, q = 0,02 29,27, q = 0,23
BCL2 Associated X, Apoptosis Regulator/ BAX-E 23,08, q = 0,04 -6,8, q = 0,48 BclXL/BCL2 Like 1/ BCL2L1-E 71,26, q < 0,01 7,81, q = 0,69
Элементы апоптосомы Apoptosome elements Itchy E3 Ubiquitin Protein Ligase/ITCH-E 29,65, q = 0,04 -11,60, q = 0,29
Cytochrome C/CYCS-NM_018947 21,63, q = 0,04 4,73, q = 0,64 Itchy E3 Ubiquitin Protein Ligase/ITCH-NM_001257138 42,20, q = 0,04 -15,20, q = 0,27
Apoptotic Protease-Activating Factor-1/ APAF-1 -E 86,19, q < 0,01 -24,4, q = 0,18 Активаторы каспаз Caspase activators
Caspase 9/CASP-9-E 71,46, q = 0,01 21,98, q = 0,31 HtrA Serine Peptidase 2/OMI/ HTRA2-E 127,96, q < 0,01 49,03, q = 0,07
Эффекторные каспазы Effector caspases Ингибиторы каспаз Caspase inhibitors
Caspase 7/CASP7-NM_001267057 22,68, q = 0,04 -7,24, q = 0,44 Baculoviral IAP Repeat Containing 2/BIRC2-E 39,07, q = 0,04 -12,90, q = 0,32
Эффекторы апоптоза Apoptotic effectors NLR Family Apoptosis Inhibitory Protein/ NAIP-E 135,38, q = 0,01 48,49, q = 0,14
Endonuclease G/ END0G-NM_004435 24,99, q = 0,02 1,95, q = 0,83 Baculoviral IAP Repeat Containing 2/BIRC3-E -34,94, q = 0,01 -23,60, q = 0,02
Название гена и номер мРНК в GenBank Gene name and mRNA number in GenBank FC (%) в острой фазе, значениеq FC% in acute phase, qVal FC (%) в фазе реконвалесценции, значениеq FC% in recovery phase, qVal Название гена номер мРНК в GenBank Gene name and mRNA number in GenBank FC (%) в острой фазе, значениеq FC% in acute phase, qVal FC (%) в фазе реконвалесценции, значениеq FC% in recovery phase, qVal
Элементы NF-кВ-сигнального пути NF-kB signaling elements Элементы JNK-сигнального пути JNK signaling elements
Bruton Tyrosine Kinase/BTK-NM_001287345 43,34, q = 0,04 -11,5, q = 0,47 TGF-Beta Activated Kinase 1 (MAP3K7) Binding Protein 1/ TAB1-2 34,72, q = 0,02 -10,5, q = 0,31
TNFR-associated Protein 1/TRAP-1-E 63,98, -1,1, q = 0,93 MAPK/ERK Kinase Kinase Kinase 4/MAP4K4-NM_001242560 21,11, 1,21, q = 0,9
q < 0,01 q = 0,04
TNFR-associated Protein 5/TRAF-5-2 48,61, q = 0,01 5,101, q = 0,7 MAP Kinase Kinase 4/ MAP2K4-2 69,20, q < 0,01 7,71, q = 0,61
NFKB Inhibitor Beta/ NFKBIB-2 39,55, q = 0,01 3,287, q = 0,78 Mitogen-Activated Protein Kinase 14/ MAPK14-2 118,02, q < 0,01 2,33, q = 0,9
Nuclear Factor Kappa B Subunit 1/ NFKB1-2 30,27, q = 0,07 2,708, q = 0,84 Mitogen-Activated Protein Kinase 14/ MAPK14-NM_001315 33,68, q = 0,02 0,73, q = 0,95
Nuclear Factor Kappa B Subunit 2/ NFKB2-2 0,996, q = 0,91 -13,8, q = 0,11 C-Jun N-Terminal Kinase 1/JNK1/ MAPK8-2 38,19, q = 0,04 -4,26, q = 0,77
- - - C-Jun N-Terminal Kinase 2/JNK2/ MAPK9-2 41,76, q = 0,02 20,43, q = 0,22
- - - Jun Proto-Oncogene/ JUN-NM_002228 7,08, q = 0,56 -14,3, q = 0,17
Примечания. Положительные значения FC — повышение уровня экспрессии мРНК по сравнению с донорами. Отрицательные значения FC — снижение уровня экспрессии мРНК по сравнению с донорами. Е — суммарный уровень экспрессии гена. Серым отмечены статистически значимые различия при q < 0,05.
Notes. Positive FC values indicate an increase in the level of mRNA expression compared to donors. Negative FC values Indicate a decrease in the level of mRNA expression compared to donors. Е — is the total level of gene expression. Gray indicates statistically significant differences at q < 0,05.
лесценции уровни экспрессии всех перечисленных мРНК и генов нормализовались (табл. 2).
Из эффекторных каспаз в острой фазе заболевания наблюдалось повышение уровня экспрессии мРНК СЛ8Р7-КМ_001267057, который нормализовался в фазе реконвалесценции. Среди ингибиторов каспаз в острой фазе инфекции выявлялось повышение уровней экспрессии генов Б1ЯС2-Х (с1ЛР-1) и НЛ1Р-Х (Б1ЯС-1). В то же время уровень экспрессии гена Б1ЯС3 -X (с1ЛР-2) снижался и оставался пониженным в фазе ре-конвалесценции, уровни экспрессии других перечисленных мРНК нормализовались. Из эффекторов апоптоза в острой фазе инфекции отмечалось повышение уровня экспрессии мРНК ENDOG-NM_004435, который нормализовался в фазе реконвалесценции (табл. 2).
Среди активаторов NF-кB-сигналинга в острой фазе заболевания выявлялось повышение уровня экспрессии мРНК БТК-NM_001287345 и уровней экспрессии генов-медиаторов ТЯЛР-1-Х и TRAF-5-X. С другой стороны наблюдалось повышение уровня экспрессии гена NFKBIB-X — ингибитора NF-кB. В фазе реконвалесценции уровни перечислен-
ных мРНК нормализовались. Уровни экспрессии генов эффекторного звена NF-кБ-сигна-линга (NF-кB1-X и NF-кB2-X) оставались неизменными как в острой фазе заболевания, так и в фазе реконвалесценции (табл. 2).
Из активаторов и медиаторов JNK-сигналин-га в острой фазе заболевания повышались уровни экспрессии генов TAB1-X, МЛР2К4^, MAPK14-X, JNK1/MAPK8-X и JNK2/MAPK9-X, а также уровни экспрессии мРНК MAP4K4-NM_001242560, MAPK14-NM_001315 (табл. 2). В фазе реконвалесценции экспрессия перечисленных факторов нормализовалась. Необходимо отметить, что уровень экспрессии мРНК JUN-NM_002228 (эффектор JNK-сигналинга) не изменялся как в острой фазе заболевания, так и в фазе реконвалесценции (табл. 2).
Изменения уровней экспрессии мРНК у пациентов с тяжелой (ВГЧ-6+ВЭБ+ЦМВ) микст-инфекцией
Был проведен анализ уровней экспрессии мРНК ключевых участников сигнальных каскадов апоптоза и выживания у пациентов с тяжелой микст-инфекцией с участием ВГЧ-6 (ВГЧ-6+
Таблица 3. Изменения уровней экспрессии мРНК (FC) в острой фазе ВГЧ-6 инфекции, тяжелой ВГЧ-6+ВЭБ+ЦМВ микст-инфекции, ВЭБ+ЦМВ микст-инфекции и в фазе реконвалесценции по сравнению со здоровыми донорами
Table 3. Changes of mRNA expression levels (FC) in acute phase of HHV-6 infection, severe HHV-6 + EBV + CMV mixed infection, EBV + CMV mixed infection and in recovery phase compared to healthy donors
Название гена и номер мРНК BGenBank Gene name and mRNA number in Gen Bank ВГЧ-6 инфекция средней тяжести HHV-6 infection moderate severity ВГЧ-6+ВЭБ+ЦМВ микст-инфекция тяжелая HHV-6+EBV+CMV mixt infection severe ВЭБ+ЦМВ микст-инфекция средней тяжести EBV+CMV mixt infection moderate severity
FC (%) в острой фазе, значениеq FC% in acute phase, qVal FC (%) в фазе реконвалесценции, значениеq FC% in recovery phase, qVal FC (%) в острой фазе, значениеq FC% in acute phase, qVal FC (%) в фазе реконвалесценции, значениеq FC% in recovery phase, qVal FC (%) в острой фазе, значениеq FC% in acute phase, qVal FC (%) в фазе реконвалесценции, значениеq FC% in recovery phase, qVal
Fas Cell Surface Death Receptor/ FAS-2 31,13 q = 0,03 -5,31 q = 0,62 67,78 q = 0,04 3,40 q = 0,77 -6,55 q = 0,67 -16,35 q = 0,33
FAS-Associated Factor 1/FAF1-NM_007051 31,22 q = 0,02 -4,42 q = 0,66 55,14 q = 0,04 5,60 q = 0,61 -1,84 q = 0,90 -23,16 q = 0,11
Death Associated Protein Kinase 2/DAPK2-NM 014326 43,38 q = 0,02 -1,29 q = 0,93 91,56 q = 0,04 34,90 q = 0,057 -9,87 q = 0,59 -27,86 q = 0,129
Caspase 8 Associated Protein 2/ CASP8AP2-NM_001137667 32,61 -17,22 q = 0,15 76,95 45,88 23,62 q = 0,30 -11,47 q = 0,57
q = 0,04 q = 0,04 q = 0,015
Caspase 8/CASP8-NM_033356 48,81 q = 0,05 -7,73 q = 0,63 182,81 q = 0,03 5,99 q = 0,76 -28,99 q = 0,13 -33,42 q = 0,16
Bcl-2-Binding Components/ Puma/ВВСЗ-Е 59,84 4,50 q = 0,78 115,87 43,26 -21,41 q = 0,21 -25,91 q = 0,20
q = 0,01 q = 0,04 q = 0,04
Itchy E3 Ubiquitin Protein Ligase/ ITCH-2 29,65 q = 0,04 -11,63 q = 0,29 75,74 q = 0,04 22,73 q = 0,12 12,90 q = 0,519 -16,20 q = 0,37
Bruton Tyrosine Kinase/BTK-NM 001287345 43,34 q = 0,04 -11,51 q = 0,47 129,95 q = 0,04 37,45 q = 0,09 -18,56 q = 0,377 0,93 q = 0,97
Примечания. Положительные значения FC — повышение уровня экспрессии мРНКпо сравнению с донорами. Отрицательные значения FC — снижение уровня экспрессии мРНКпо сравнению с донорами. Е — суммарный уровень экспрессии гена. Серым отмечены статистически значимые различия при q < 0,05.
Notes. Positive FC values indicate an increase in the level of mRNA expression compared to donors. Negative FC values Indicate a decrease In the level of mRNA expression compared to donors. E — is the total level of gene expression. Gray Indicates statistically significant differences at q < 0,05.
ВЭБ+ЦМВ), и микст-инфекцией средней тяжести без участия ВГЧ-6 (ВЭБ+ЦМВ) по сравнению со здоровыми донорами. В результате выявлено 5 мРНК (FAF1-NM_007051, DЛPK2-NM_014326, CЛSP8ЛP2-NM_001137667, СЛБР8-NM_033356, БTK-NM_001287345) и 3 гена(FAS-X, PUMЛ/ББC3-X, ITCH-X,) уровни экспрессии которых были значительно повышены в острой фазе тяжелой ВГЧ-6+ВЭБ+ЦМВ микст-инфекции по сравнению со здоровыми донорами. При этом у пациентов в острой фазе ВЭБ+ЦМВ микст-инфекции изменения уровней экспрессии данных мРНК и генов не были статистически значимыми. В фазе реконва-лесценции после тяжелой ВГЧ-6+ВЭБ+ЦМВ микст-инфекции уровень экспрессии мРНК CASP8AP2-NM_001137667 и уровень экспрессии гена PUMA/BBC3-X оставались повышенными по сравнению со здоровыми донорами (табл. 3).
Содержание субпопуляций лимфоцитов в образцах исследуемых групп
В острой фазе ВГЧ-6 инфекции по сравнению со здоровыми донорами было выявлено повышение содержания CD45+ лейкоцитов (в 1,3 раза), CD3+ ^клеток (в 1,3 раза) и CD3+CD4+ ^хелперов (в 1,5 раза). В фазе реконвалесценции количество клеток нормализовалось (табл. 4). В острой фазе ВЭБ+ЦМВ микст-инфекции отмечалось снижение количества Б-клеток (CD19+) (в 1,8 раза), которое оставалось сниженным в фазе реконвалесцен-ции (в 1,9 раза) (табл. 4). В ходе тяжелой ВГЧ-6+ ВЭБ+ЦМВ микст-инфекции не было выявлено статистически значимых изменений количества клеток по сравнению с нормой (табл. 4).
Взаимосвязь между уровнями экспрессии мРНК и содержанием субпопуляций лимфоцитов в острой фазе ВГЧ-6 инфекции
Проведен корреляционный анализ уровней экспрессии 5 мРНК и 3 генов — кандидат-ных факторов риска развития тяжелых форм заболевания — с представленностью субпопуляций лимфоцитов в острой фазе ВГЧ-6 инфекции и в острой фазе тяжелой микст-инфекции. В острой фазе ВГЧ-6 инфекции уровень экспрессии мРНК FLЛSH/CЛSP8ЛP2-NM_001137667 коррелировал с содержанием CD3+ ^клеток (0,456, р = 0,038) и CD3+CD4+ ^хелперов (0,543, р = 0,011), а уровень экспрессии мРНК FAF1-NM_007051 коррелировал с содержанием CD45+ лейкоцитов (0,558, р = 0,009) и CD3+CD4+ Т-хелперов (0,468, р = 0,032). В острой фазе тяжелой микст-инфекции (а также и в других группах исследования) корреляций между уровнями экспрессии данных мРНК и содержанием перечисленных субпопуляций лимфоцитов не выявлялось.
Обсуждение
Особенности экспрессии генов апоптоза и выживания при ВГЧ-6 инфекции на уровне транскрипции практически не изучены. По немногим литературным данным исследования чувствительности различных типов ВГЧ-6-инфицированных клеток к апоптозу проводились на клеточном и белковом уровне. Было показано, что ВГЧ-6 инициирует апоптоз различных субпопуляций T-клеток in vitro и in vivo [18, 21, 30]. В отдельных случаях добавление антител против рецептора смерти Fas усиливало данный эффект [21]. По данным Gupta и со-авт. ВГЧ-6-индуцированный апоптоз T-клеток ассоциировался с активацией каспаз 3, 8 и 9, что свидетельствовало об активности внешнего и внутреннего (митохондриального) сигнальных путей апоптоза [18].
Наши данные подтверждают активацию многих факторов внешнего пути апоптоза, в том числе участвующих в Fas-опосредованном сигнальном пути в лейкоцитах крови в острой фазе ВГЧ-6 инфекции. Показано, что в острой фазе ВГЧ-6 инфекции по сравнению со здоровыми донорами баланс уровней экспрессии мРНК и генов смещается в сторону про-апоптотических факторов. Был выявлен ряд мРНК и генов, изменения уровней экспрессии которых были значимыми согласно ранее установленным нами критериям. В фазе реконвалесценции большинство альтерированных уровней мРНК нормализовалось. Нами впервые показано, что в лейкоцитах периферической крови выявляется значительное повышение уровней экспрессии мРНК и генов-участников внешнего пути апоптоза: лигандов (TRAIL/TNFSF10-X), рецепторов (FAS-X, DR3/TNFRSF25-X, DR4/TNFRSF10A-NM_003844, DR5/TNFRSF10B-X), медиаторов (FADD-NM_003824, FAF1-NM_007051, FLASH/CASP8AP2-NM_001137667), киназы (FASTK-X) и инициаторной каспазы-8 (CASP8-NM_033356). Полученные данные указывают на активацию внешнего пути апоптоза, которая может одновременно индуцироваться несколькими рецепторами смерти и проапо-птотическими медиаторами. FAF-1 и FLASH являются менее изученными проапоптоти-ческими медиаторами по сравнению с FADD. Показано, что оба из них входят в состав комплекса DISC и ассоциированы с активацией Fas-опосредованного апоптоза [13, 20, 23, 26]. Отметим, что для острой фазы ВГЧ-6 инфекции было также характерно существенное повышение уровня экспрессии гена тирозин-кина-зы FASTK-X, которая, по данным литературы, является важным индуктором апоптоза лимфоцитов. Показано, что FASTK активируется
Таблица 4. Количество клеток субпопуляций лимфоцитов в группах исследования
Table 4. The number of cells in leukocyte subpopulations in study groups
Лейкоциты CD45+ кл/мкл, значение p Leukocytes CD45+ се11/ц1, pVal Т-клетки CD3+ кл/мкл, значение p T-cells CD3+ cell/nl, pVal Т-киллеры CD3+CD8 кл/мкл, значение p T-killers CD3+CD8 cell/nl, pVal Т-хелперы CD3+CD4+ кл/мкл, значение p T-helpers CD3+CD4+ cell/nl, pVal ДП-Т-клетки CD3+CD4+CD8+ кл/мкл, значение p Double positive T-cells CD3+CD4+CD8+ cell/nl, pVal NK-клетки CD16+CD56+ кл/мкл, значениеp NK-cells CD16+CD56+ cell/nl, pVal В-клетки CD19+ кл/мкл, значениеp В cells CD19+ cell/nl, pVal
ВГЧ-6 в острой фазе HHV-6 in acute phase 3280,0 (3145,3; 3389,5) 2347,5 (1988,6; 2502,9) 793,7 (715,3; 942,2) p = 0,107 1317,4 (1043,1; 1462,4) 16,6 (10,7; 20,86) p = 0,962 436,9 (344,6; 549,7) p = 0,288 420,0 (284,6; 456,7) p = 0,962
p = 0,006 p = 0,010 p = 0,010
ВГЧ-6 в фазе реконв. HHV-6 in recovery phase 3212,8 (2669,3; 3426,1) p = 0,055 2336,6 (1732,3; 2508,4) p = 0,077 701,1 (545,2; 956,1) p = 0,666 1215,9 (946,1; 1327,7) p = 0,083 17,5 (9,0; 39,3) p = 0,701 403,2 (324,4; 544,5) p = 0,310 426,7 (378,6; 542,2) p = 0,310
ВЭБ+ЦМВ в острой фазе EBV+CMV in acute phase 2601,3 (2359,2; 2859,4) p = 0,821 1690,3 (1519,4; 2182,7) p = 0,88 871,9 (616,5; 1075,5) p = 0,415 830,2 (774,3; 866,3) p = 0,312 10,3 (8,2; 20,4) p = 0,541 473,6 (444,7; 585,0) p = 0,134 193,9 (106,6; 233,7) p = 0,041
ВЭБ+ЦМВ в фазе реконв. EBV+CMV in recovery phase 2313,9 (2308,6; 2319,3) p = 0,427 1705,5 (1676,7; 1734,2) p = 0,88 656,6 (541,1; 772,1) p = 0,99 986,0 (924,0; 1048,0) p = 0,54 23,2 (16,2; 30,1) p = 0,88 401,1 (395,2; 407,2) p = 0,6 182,3 (161,0; 203,7) p = 0,027
ВГЧ-6+ВЭБ+ЦМВ в острой фазе HHV-6+EBV+CMV in acute phase 2249,7 (2014,0; 2842,4) p = 0,88 1475,6 (1354,1; 1977,3) p = 0,821 544,3 (474,8; 838,2) p = 0,88 853,6 (746,8; 1040,2) p = 0,821 10,0 (8,7; 12,1) p = 0,113 335,8 (301,1; 509,1) p = 0,704 250,0 (242,2; 331,8) p = 0,395
ВГЧ-6+ВЭБ+ЦМВ в фазе реконв. HHV-6+EBV+CMV in recovery phase 3049,8 (2578,4; 3330,8) p = 0,352 1696,4 (1547,4; 2174,0) p = 0,821 812,0 (667,9; 988,6) p = 0,352 808,2 (759,2; 1098,0) p = 0,762 13,5 (12,7; 14,1) p = 0,275 628,5 (440,6; 704,9) p = 0,182 437,4 (369,6; 492,7) p = 0,541
Здоровые доноры Healthy donors 2504,2 (2161,2; 2745,1) 1759 (1493,7; 1958,2) 718,2 (525,3; 809,1) 902,1 (824,6; 1039,1) 15,5 (13,9; 19,7) 354,1 (240,0; 461,5) 341,3 (259,6; 493,2)
Примечания. Значения количества клеток представлены в виде медианы, 25 и 75 процентилей, р — уровень статистической значимости различий значений пациентов и здоровых доноров. Серым отмечены значения р < 0,05.
Notes. Numbers of cells are presented as medians, 25 and 75 percentiles, p Is the level of statistical significance of differences In values of patients and healthy donors. Gray Indicates p < 0,05.
в ходе Fas-опосредованного апоптоза и фосфо-рилирует ядерный регулятор TIA-1, который изменяет баланс сплайсинга в сторону образования полноразмерной мРНК, кодирующей проапоптотическую форму Fas [22].
Нами показано, что в острой фазе ВГЧ-6 инфекции баланс уровней экспрессии мРНК и генов также смещался в сторону проапопто-тических митохондриальных факторов (BAX-X, PUMA/BBC3-X) и элементов апоптосомы (CYCS-NM_018947, APAF-1-X, CASP-9-X), что указывает на активацию некоторых звеньев митохондриального пути апоптоза. Однако, наряду с этим, повышались и уровни экспрессии генов антиапоптотических митохондри-альных факторов (BCL2-X, BCLXL/BCL2L1-X, ITCH-X), вносящих свой вклад в сложную картину межмолекулярных взаимоотношений в структуре апоптоз-ассоциированного сигна-линга. В период реконвалесценции альтерированные уровни экспрессии мРНК большинства факторов нормализовались. Известно, что фактор BCL-XL является специфическим антагонистом проапоптотического фактора PUMA/ BBC3-X [31]. Возможно, выявленное нами синхронное повышение уровней экспрессии генов BCLXL-X и PUMA/BBC3-X взаимно нейтрализует их апоптоз-ассоциированную активность. Также известно, что убиквитин-лигаза ITCH опосредует протеасомную деградацию про-апоптотического митохондриального фактора BID [8] и, таким образом, блокирует активацию митохондриального пути апоптоза.
Согласно полученным нами данным, в острой фазе ВГЧ-6 инфекции значительно повышались уровни экспрессии мРНК и генов кас-пазы CASP7-NM_001267057, активатора каспаз OMI/HTRA2-X и эндонуклеазы G ENDOG-NM_004435, что свидетельствует об активации факторов, участвующих в реализации эффек-торной фазы апоптоза. В пользу этого также говорит снижение уровня экспрессии гена cIAP-2/ BIRC3-X, являющегося ингибитором эффек-торных каспаз. С другой стороны в острой фазе ВГЧ-6 инфекции детектировалось повышение уровней экспрессии двух генов cIAP-1/BIRC2-X и BIRC-1/NAIP-X, взаимодействующих с эф-фекторными каспазами, и проявляющих анти-апоптотические свойства.
Таким образом, нами показано, что в лейкоцитах периферической крови в острой фазе ВГЧ-6 инфекции баланс уровней экспрессии мРНК смещается в сторону проапоптотических факторов, связанных с реализацией как внешнего, так и митохондриального путей апоптоза, а также активацией его эффекторных элементов. Полученные результаты согласуются с данными литературы, согласно которым ВГЧ-6 может инициировать апоптоз различных субпо-
пуляций лимфоцитов в условиях in vitro и in vivo [18, 19, 30]; в отношении суммарной фракции лейкоцитов периферической крови данные получены нами впервые. С другой стороны мы обнаружили повышение экспрессии ряда мРНК с антиапоптотическими функциями, что может являться отражением антагонистических взаимодействий между проапоптотическим влиянием ВГЧ-6, направленным на апоптоз лимфоцитов, как факторов адаптивного иммунитета, так и иммунными факторами, направленными на выживание клеток в ходе антивирусного иммунного ответа.
Нами показано, что в острой фазе ВГЧ-6 инфекции в лейкоцитах периферической крови на фоне повышения уровней экспрессии мРНК и генов активаторов и медиаторов NF-kB- и JNK-опосредованных сигнальных путей, уровни экспрессии мРНК и генов эффектор-ного звена (NF-kB1, NF-kB2, cJun) оставались неизменными по сравнению со здоровыми донорами, что может свидетельствовать об отсутствии выраженного иммунного ответа на инфекцию, а также косвенно объяснять менее острые клинические проявления ВГЧ-6 инфекции по сравнению с ВЭБ и ЦМВ инфекциями.
С целью поиска ВГЧ-6-ассоциированных факторов, влияющих на утяжеление клинической картины микст-инфекции, проведен анализ выявленных нами изменений уровней экспрессии мРНК и генов у пациентов с тяжелой микст-инфекцией с участием ВГЧ-6 (ВГЧ-6+ ВЭБ+ЦМВ), и микст-инфекцией средней тяжести без участия ВГЧ-6 (ВЭБ+ЦМВ) по сравнению со здоровыми донорами. В результате обнаружено 5 мРНК (FAF1-NM_007051, DAPK2-NM_014326, CASP8AP2-NM_001137667, CASP8-NM_033356, BTK-NM_001287345), и 3 гена (FAS-X, Puma/BBC3-X, ITCH-X) уровни экспрессии которых были значительно повышены в острой фазе ВГЧ-6+ВЭБ+ЦМВ микст-инфекции и не изменялись в группе ВЭБ+ЦМВ микст-инфекции (табл. 3), что указывает на ВГЧ-6-ассоциированный характер изменений данных факторов. По функциональной роли в сигнальных путях к антиапоп-тотическим относятся 2 фактора — BTK-NM_001287345 активатор B-клеточного иммунного ответа, и ITCH-X — ингибитор митохондриального апоптоза. Большинство выявленных нами факторов относятся к про-апоптотическим участникам сигнального пути Fas-опосредованного апоптоза (FAS-X, CASP8-NM_033356, CASP8AP2-NM_001137667, FAF1-NM_007051, DAPK2-NM_014326). Кроме того, PUMA/BBC3-X принадлежит к функциональной группе проапоптотических факторов мито-ходриального апоптоза. Необходимо отметить, что в фазе реконвалесценции после тяжелой
ВГЧ-6+ВЭБ+ЦМВ микст-инфекции уровни экспрессии мРНК CASP8AP2-NM_001137667 и гена PUMA/BBC3-E оставались повышенными по сравнению со здоровыми донорами, в отличие от ВГЧ-6 инфекции в фазе реконвалес-ценции, где данные уровни нормализовались (табл. 3), что отражает пролонгированное воздействие данных факторов в условиях тяжелой микст-инфекции и, возможно, связано с длительностью ее клинических проявлений.
Таким образом, специфическое влияние ВГЧ-6 на утяжеление клинической картины ВГЧ-6+ВЭБ+ЦМВ микст-инфекции может быть связано с изменением уровней экспрессии мРНК ряда проапоптотических факторов и активацией внешнего Fas-опосредованного пути апоптоза клеток. Выявленные нами мРНК могут служить кандидатными прогностическими факторами риска развития тяжелых форм гер-песвирусной инфекции с участием ВГЧ-6.
Нами было показано, что в острой фазе ВГЧ-6 инфекции уровень экспрессии мРНК FLASH/ CASP8AP2-NM_001137667 коррелировал с содержанием CD3+ T-клеток и CD3+CD4+ T-хелперов, а уровень экспрессии мРНК FAF1-NM_007051 коррелировал с содержанием CD45+ лейкоцитов и CD3+CD4+ Т-хелперов. Выявленные нами взаимосвязи соответствовали изменениям содержания субпопуляций (CD3+) T-клеток, (CD3+CD4+) T-хелперов и (CD45+) лейкоцитов в острой фазе ВГЧ-6 инфекции по сравнению со здоровыми донорами. Мы предполагаем, что клетки данных субпопуляций вносят основной вклад в экспрессию мРНК FLASH/CASP8AP2-NM_001137667 и FAF1-NM_007051. Данные мРНК могут играть существенную роль в функционировании и регуляции содержания перечисленных субпопуляций лимфоцитов в ходе противовирусного иммунного ответа. В острой фазе тяжелой микст-инфекции (а также в других группах исследования) корреляций между уровнями экспрессии данных мРНК и содержанием перечисленных субпопуляций не выявлялось, что соответствовало факту отсутствия различий в содержании субпопуляций лимфоцитов в острой фазе тяжелой микст-инфекции по сравнению со здоровыми донорами. Для оценки непосредственного влияния обнаруженных нами изменений уровней мРНК на содержание и функциональные свойства клеток перечисленных субпопуляций в ходе ВГЧ-6 инфекции необходимы дальнейшие исследования.
Список литературы/References
Заключение
С помощью ДНК-микрочипов проведен полуколичественный анализ уровней экспрессии мРНК и генов апоптоза и выживания в лейкоцитах крови детей с ВГЧ-6 инфекцией в острой фазе заболевания и в фазе реконвалесценции по сравнению со здоровыми донорами. Показано, что в острой фазе инфекции баланс уровней экспрессии мРНК и генов смещался в сторону проапоп-тотических факторов, что может оказывать существенное влияние на чувствительность лейкоцитов к апоптозу. В фазе реконвалесценции большинство уровней экспрессии мРНК и генов нормализовалось. Нами выявлен ряд мРНК и генов, экспрессия которых значительно изменялась в острой фазе заболевания. Данные факторы по литературным данным играют важную функциональную роль в регуляции исследуемых сигнальных путей. С целью поиска ВГЧ-6-ассоциированных факторов, влияющих на утяжеление клинической картины течения герпесвирусной микст-инфекции, проведен анализ выявленных нами изменений уровней экспрессии мРНК и генов у пациентов с тяжелой ВГЧ-6+ВЭБ+ЦМВ микст-инфекцией и ВЭБ+ЦМВ микст-инфекцией средней тяжести по сравнению со здоровыми донорами. Обнаружены 5 мРНК и 3 гена, уровни экспрессии которых были существенно повышены при ВГЧ-6+ ВЭБ+ЦМВ микст-инфекции и оставались неизменными при ВЭБ+ЦМВ микст-инфекции. С точки зрения функциональной принадлежности большинство таких мРНК и генов являются ключевыми участниками сигнального пути Fas-опосредованного апоптоза. Таким образом, вклад ВГЧ-6 в утяжеление клинической картины тяжелой микст-инфекции предположительно связан с активацией данного сигнального пути и выявленные мРНК могут служить кандидатными прогностическими факторами риска развития тяжелых форм герпесвирусной инфекции с участием ВГЧ-6.
Настоящая работа значительно расширяет существующие представления о молекулярных механизмах патогенеза ВГЧ-6 инфекции, в реализации которых задействованы сигнальные пути апоптоза и выживания. Выявленные нами изменения уровней экспрессии мРНК и генов сигнальных путей апоптоза и выживания с наибольшей вероятностью вносят вклад в патогенез ВГЧ-6 инфекции и тяжелой ВГЧ-6+ ВЭБ+ЦМВ микст-инфекции.
1. Князев Д.И., Старикова В.Д., Уткин О.В., Солнцев Л.А., Сахарнов Н.А., Ефимов Е.И. Особенности сплайсинг-ориентированных ДНК-микрочипов и их применение в биомедицинских исследованиях (обзор) // Современные технологии в медицине. 2015. Т. 7, № 4. С. 162-173. [Knyazev D.I., Starikova V.D., Utkin O.V., Solntsev L.A., Sakharnov N.A., Efimov E.I. Features of splicing-oriented DNA microarrays and their application in biomedical research (review). Sovremennye tekhnologii v meditsine = Modern Technologies in Medicine, 2015, vol. 7, no. 4. pp. 162—173. doi: 10.17691/stm2015.7.4.23 (In Russ.)]
2. Новосад Е.В., Шамшева О.В., Львов Н.Д., Мельниченко А.В., Егорова Н.Ю., Михайловская Г.В., Никитина А.А., Зоненшайн Т.П. Инфекционный мононуклеоз, ассоциированный с вирусом герпеса 6 типа // Детские инфекции. 2008. Т. 7, № 1. С. 36-38. [Novosad E.V., Shamsheva O.V., Lvov N.D., Melnichenko A.V., Egorova N.Yu., Mikhailovskaya G.V. Infectious mononucleosis associated with herpes simplex virus type 6. Detskie Infektsii = Children Infections, 2008, vol. 7, no. 1, pp. 36-38. (In Russ.)]
3. Тимченко В.Н., Хмилевская С.А. Болезни цивилизации (корь, ВЭБ-мононуклеоз) в практике педиатра: руководство для врачей. СПб.: Специальная Литература, 2017. 527 с. [Timchenko V.N., Khmilevskaya S.A. Diseases of civilization (measles, EBV-mononucleosis) in the practice of a pediatrician: a guide for doctors. St. Petersburg: Special Literature, 2017. 527p. (In Russ.)]
4. Филатова Е.Н., Уткин О.В., Анисенкова Е.В., Преснякова Н.Б., Сычева Т.Д., Краснов В.В., Сенягина Н.Е., Кулова Е.А., Ефимов Е.И. Оценка уровня апоптоза наивных CD8+ T-лимфоцитов у детей с острым инфекционным мононуклеозом при активации рецепторов CD95 и DR3 // Современные технологии в медицине. 2015. Т. 7, № 3. С. 109— 118. [Filatova E.N., Utkin O.V., Anisenkova E.V., Presnyakova N.B., Sycheva T.D., Krasnov V.V., Senyagina N.E., Kulova E.A., Efimov E.I. Assessment of apoptosis level of naive CD8+ T-lymphocytes in children with acute infectious mononucleosis upon activation of CD95 and DR3 receptors. Sovremennye tekhnologii v meditsine = Modern Technologies in Medicine, 2015, vol. 7, no. 3, pp. 109-118. doi: 10.17691/stm2015.7.3.16(In Russ.)]
5. Филатова Е.Н., Уткин О.В. Современные подходы к моделированию герпесвирусной инфекции // Медталь, 2014. С. 172—197. [Filatova E.N., Utkin O.V., Modern approaches to the modeling of herpes infection. MediAl. 2014, vol. 2, no. 12, pp. 172-197. (In Russ.)]
6. Agut H., Bonnafous P., Gautheret-Dejean A. Laboratory and clinical aspects of human herpesvirus 6 infections. Clin. Microbiol. Rev., 2015, vol. 28, no. 2,pp. 313-335. doi: 10.1128/CMR.00122-14.
7. Akashi K., Eizuru Y., Sumiyoshi Y., Minematsu T., Hara S., Harada M., Kikuchi M., Niho Y., Minamishima Y. Brief report: severe infectious mononucleosis-like syndrome and primary human herpesvirus 6 infection in an adult. N. Engl. J. Med., 1993, vol. 329, pp. 168-171. doi: 10.1056/NEJM199307153290304
8. Azakir B.A., Desrochers G., Angers A. The ubiquitin ligase Itch mediates the antiapoptotic activity of epidermal growth factor by promoting the ubiquitylation and degradation of the truncated C-terminal portion of Bid. FEBS J., 2010, vol. 277, no. 5, pp. 1319-1330. doi: 10.1111/j.1742-4658.2010.07562.x
9. Balachandra K., Ayuthaya P., Auwanit W., Jayavasu C., Okuno T., Yamanishi K., Takahashi M. Prevalence of antibody to human, herpesvirus 6 in women and children. Microbiol. Immunol, 1989, vol. 33, pp. 515-518. doi: 10.1111/j.1348-0421.1989.tb02001.x
10. Beovic B., Pecaric-Meglic N., Marin J., Bedernjak J., Muzlovic I., Cizman M. Fatal human herpesvirus 6-associ-ated multifocal meningoencephalitis in an adult female patient. Scand. J. Infect. Dis., 2001, vol. 33, no. 12, pp. 942-944. doi: 10.1080/00365540110076570
11. Brune W. Inhibition of programmed cell death by cytomegaloviruses. Virus Res., 2011, vol. 15, pp. 144-150. doi: 10.1016/j.virus-res.2010.10.012
12. Cavallo M.L., Castrovilli A., D'Introno A., Perrone A., Polito A., Lenato G.M., Sabba C.A. A systemic and severe infection via cytomegalovirus and other herpesviruses in a young apparently immunocompetent patient: a case report. J. Med. Cases, 2017, vol. 8, no. 9, pp. 265-268. doi: https://doi.org/10.14740/jmc2865w
13. Chu K., Niu X., Williams L.T. A Fas-associated protein factor, FAF1, potentiates Fas-mediated apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci., 1995, vol. 92, pp. 11894-11898
14. Fliss P.M., Brune W. Prevention of cellular suicide by cytomegaloviruses. Viruses, 2012, vol. 4, pp. 1928-1949. doi: 10.3390/ v4101928
15. Floettmann J.E., Rowe M. Epstein—Barr virus latent membrane protein-1 (LMP1) C-terminus activation region 2 (CTAR2) maps to the far C-terminus and requires oligomerisation for NF-kB activation. Oncogene, 1997, vol. 15, pp. 1851-1858. doi: 10.1038/ sj.onc.1201359
16. Fu Q., He C., Mao Z.R. Epstein—Barr virus interactions with the Bcl-2 protein family and apoptosis in human tumor cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B, 2013, vol. 14, no. 1, pp. 8-24. doi: 10.1631/jzus.B1200189
17. Goldmacher V.S., Bartle L.M., Skaletskaya A., Dionne C.A., Kedersha N.L., Vater C.A., Han J.W., Lutz R.J., Watanabe S., Cahir McFarland E.D., Kieff E.D., Mocarski E.S., Chittenden T. A cytomegalovirus-encoded mitochondria-localized inhibitor of apoptosis structurally unrelated to Bcl-2. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1999, vol. 96, pp.12536-12541. doi: 10.1073/pnas.96.22.12536
18. Gupta S., Agrawal S., Gollapudi S. Differential effect of human herpesvirus 6A on cell division and apoptosis among naive and central and effector memory CD4 and CD8 T-cell subsets. J. Virol., 2009,pp. 5442-5450. doi: 10.1128/JVI.00106-09
19. Ichimi, R., Jin-no T., Ito M. Induction of apoptosis in cord blood lymphocytes by HHV-6. J. Med. Virol., 1999, vol. 58, pp. 63-68. doi: 10.1002/(sici)1096-9071(199905)58:1<63::aid-jmv10>3.0.co;2-c
20. Imai Y., Kimura T., Murakami A., Yajima N., Sakamaki K., Yonehara S. The CED-4-homologous protein FLASH is involved in Fas-mediated activation of caspase-8 during apoptosis. Nature, 1999, vol. 398, pp. 777-785. doi: 10.1038/19709
21. Inoue Y., Yasukawa M., Fujita S. Induction of T-cell apoptosis by human herpesvirus 6. J. Virology, 1997, vol. 71, pp. 3751-3759.
22. Izquierdo J.M., Valcarcel J. Fas-activated serine/threonine kinase (FASTK) synergizes with TIA-1/TIAR proteins to regulate Fas alternative splicing. J. Biol. Chem., 2007, vol. 282, no. 3, pp. 1539-1543. doi: 10.1074/jbc.C600198200
23. Milovic-Holm K., Krieghoff E., Jensen K., Will H., Hofmann T.G. FLASH links the CD95 signaling pathway to the cell nucleus and nuclear bodies. EMBO J, 2007, vol. 26,pp. 391-401. doi: 10.1038/sj.emboj.7601504
24. O'Brien V. Viruses and apoptosis. J. Gen. Virol., 1998, vol. 79, pp. 1833-1845. doi: 10.1099/0022-1317-79-8-1833
25. Pruksananonda P., Hall C.B., Insel R.A., McIntyre K., Pellett P.E., Long C.E., Schnabel K.C., Pincus P.H., Stamey F.R., Dambaugh T.R., Stewart J.A. Primary human herpesvirus infection in young children. New Engl. J. Med., 1992, vol. 326, no. 22, pp. 1445-1452. doi: 10.1056/NEJM199205283262201
26. Ryu S.W., Lee S.J., Park M.Y., Jun J.I., Jung Y.K., Kim E. Fas-associated factor 1, FAF1, is a member of Fas death-inducing Signaling Complex. J. Biol. Chem., 2003, vol. 278, pp. 24003-24010. doi: 10.1074/jbc.M302200200
27. Solntsev L.A., Starikova V.D., Sakharnov N.A., Knyazev D.I., Utkin O.V. Strategy of probe selection for studying mRNAs that participate in receptor-mediated apoptosis signaling. Mol. Biol., 2015, vol. 49, no. 3,pp. 457-465. doi: 10.1134/S0026893315030164
28. Wu Z., Aryee M. J. Subset quantile normalization using negative control feature. J. Comput. Biol., 2010, vol. 17, no. 10, pp. 13851395. doi: 10.1089/cmb.2010.0049
29. Yamanishi K., Okuno T., Shiraki K., Takahashi M., Kondo T., Asano Y., Kurata T. Identification of human herpesvirus-6 as a causal agent for exanthema subitum. Lancet, 1988, vol. 1,pp. 1065-1067. doi: 10.1016/s0140-6736(88)91893-4
30. Yasukawa M., Inoue Y., Ohminami H., Terada K., Fujita S. Apoptosis of CD4 T lymphocytes in human herpesvirus-6 infection. J. Gen. Virol., 1998, vol. 79, pp. 143-147. doi: 10.1099/0022-1317-79-1-143
31. Yu J., Zhang L., Hwang P. M., Kinzler K.W., Vogelstein B. PUMA induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cells. Mol. Cell, 2001, vol. 7, no. 3, pp. 673-682.
Авторы:
Сахарнов Н.А., научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, Нижний Новгород, Россия; Уткин О.В., к.б.н., зав. лабораторией молекулярной биологии и биотехнологии ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, Нижний Новгород, Россия;
Филатова Е.Н., к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, Нижний Новгород, Россия;
Князев Д.И., к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, Нижний Новгород, Россия; Кулова Е.А., к.м.н., доцент кафедры инфекционных болезней Приволжского исследовательского медицинского университета, Нижний Новгород, Россия; Преснякова Н.Б., научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, Нижний Новгород, Россия.
Поступила в редакцию 16.12.2019 Отправлена на доработку 16.01.2020 Принята к печати 11.03.2020
Authors:
Sakharnov N.A., Researcher, Laboratory of Molecular Biology and
Biotechnology, Blokhina Research Institute of Epidemiology and
Microbiology, Nizhny Novgorod, Russian Federation;
Utkin O.V., PhD (Biology), Head of the Laboratory of Molecular
Biology and Biotechnology, Blokhina Research Institute
of Epidemiology and Microbiology, Nizhny Novgorod, Russian
Federation;
Filatova E.N., PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology, Blokhina Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Nizhny Novgorod, Russian Federation;
Knyazev D.I., PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology, Blokhina Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Nizhny Novgorod, Russian Federation;
Kulova E.A., PhD (Medicine), Associate Professor, Infectious Diseases Department, Privolzhsky Research Medical University, Nizhny Novgorod, Russian Federation;
Presnyakova N.B., Researcher, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology, Blokhina Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Nizhny Novgorod, Russian Federation.
Received 16.12.2019 Revision received 16.01.2020 Accepted 11.03.2020
