CC BY
34
1^<3/7ребёнка
КёУчна пед1атр1я / Clinical Pediatrics
УДК 616.248-02:616.23-002-053.2]:575.113.2
БЕЗРУКОВЛ.О., КОЛОСКОВА O.K., Б1ЛОУС Т.М, БОГУЦЬКА Н.К. Буковинський державний медичний ун/верситет МОЗ Укра'/ни, кафедра педатрп та дитячихiнфекцйних хвороб, м. Чернвщ
W __■ _ ■ ■ V
алельнии пол1морф13м гена eNOS у д1теи, як! страждають в!д бронжально'' астми, за ео3иноф1льного та пауцигранулоцитарного субтипу запалення бронх|в
Резюме. Метоюроботи було вивчити вплив алельного nолiморфiзму гена eNOS, що кодуе активтсть ен-дотелiальноïNO-синтази та синтез монооксиду нтрогену в дихальних шляхах, на окремi клтчно-пара-клжчш показники бронхiальноï астми в дтей шкльного вку за еозинофиьного i пауцигранулоцитарного запального фенотипу.
Обстежет 22 хворi на бронхiальну астму з еозинофиьним характером запалення дихальних шляхiв та 15 пацiентiв — ш пауцигранулоцитарним. Проведено iмунологiчнi, строметричт до^дження, геноти-пування ендотелiальноï NOS.
Тяжтсть бронхiальноï астми у хворих 1з рШим типом запалення бронхiв суттево не залежить вгд алельного полiморфiзму гена eNOS. Вiдсутнiсть мутацш гена eNOS у виглядi генотипу GG виявилася характерншою для хворих 1з пауцигранулоцитарним характером запалення бронхiв, алельний полiмор-фгзм GT/TT — для дтей з еозинофиьним запаленням. За наявностi алельного полiморфiзму гена eNOS за генотипу GT/TTдтям ie пауцигранулоцитарним характером запалення бронхiв були притамант час-тiшi ^шчт прояви атотчного дерматиту й алергiчногоришту, быьший тдекс лабiльностi бронхiв та нижча концентращя метаболiтiв NO в конденсатi повтря, що видихаеться. Ключовi слова: бронхiальна астма, дти, тип запалення, генотип eNOS.
Вступ
Бронхiальна астма (БА) нараз1 розглядаеться як гетерогенне захворювання, за якого, зокрема, мо-жуть визначатися р1зномаштн1 субтипи запалення бронх1в [1, 2]. Пом1ж них найбшьш вивченим е еозинофшьний характер запалення, а наймен-ше — пауцигранулоцитарний [3, 4]. Р1зноманггний патерн запалення дихальних шлях1в у хворих на БА виникае внаслщок взаемоди спадкових фактор1в 1 р1зномаштних патогенних стимул1в навколишнього середовища. Серед численних спадкових характеристик, що е факторами схильносп до хротчного запалення бронхiв та 1х гшерреактивносп, особливу щкавють викликае пол1морф1зм гешв, що кодують синтез монооксиду нирогену в дихальних шляхах. Найменш вивченим 1з цього погляду слщ вважати вплив мутацп гена eNOS, який кодуе актившсть ен-дотел1ально! МО-синтази, на таю характеристики БА, як тяжшсть захворювання, характер запалення бронх1в та гх гшерреактившсть, а також вмют моно-
оксиду нирогену в повир1, що видихаеться, як непрямого показника функцюнального стану дано! основно! 1зоформи МО-синтази [5—8]. Враховуючи важлив1сть даних показниюв переб1гу БА для об-Грунтування 1ндив1дуал1зованого л1кування, ви-вчення мутац1йного пол1морф1зму eNOS у хворих 1з гетерогенним запаленням бронх1в можна вважати актуальним 1 перспективним [9—10].
Мета роботи: для покращення шдив1дуал1зовано! терапп БА в д1тей шкшьного в1ку за еозиноф1льного й пауцигранулоцитарного запального фенотипу ви-
Адреса для листування з авторами:
Безруков Леонщ Олексшович E-mail: pediatry_inf@bsmu.edu.ua
© Безруков Л.О., Колоскова O.K., Бшоус Т.М.,
Богуцька Н.К., 2015 © «Здоров'я дитини», 2015 © Заславський О.Ю., 2015
Kaíhímhq neAiorpifl / Clinical Pediatrics
вчити вплив алельного полiморфiзму гена eNOS на OKpeMi кишчно-параклíhí4hí показники захворю-вання.
MaTepiaA i методи
У пульмонологiчному вiддiленнi обласноï дитя-чоï клiнiчноï лiкарнi м. Чершвщ у позанападному перiодi БА проведене комплексне обстеження 37 дь тей шкiльного вiку. Серед них у 22 хворих встанов-лено еозинофшьний характер запалення дихальних шляхiв (I клiнiчна група), а у 15 пащенпв — пауци-гранулоцитарний субтип запалення (II клiнiчна група). За основними клшчними характеристиками групи були порiвняннi. Так, у I груш хлопчиюв було 60,7 %, а середнiй вiк представниюв даноï групи сягав 11,9 року. У груш порiвняння хлопчикiв було 67,1 %, а середнiй вж становив 11,0 року (Р > 0,05). Першi прояви БА в ранньому ввд в дiтей з еозино-фiльним запаленням бронхiв вiдмiченi у 55,4 % ви-падюв, а у групi порiвняння — у 46,7 % спостере-жень (Р > 0,05).
Поряд iз клiнiчним обстеженням дiагностичний комплекс передбачав: оцшку генеалогiчного iндексу за атошчними захворюваннями, визначення вмiсту в сироватщ кровi загального IgE, а в конденсат по-вiтря, що видихаеться, — метаболiтiв монооксиду нiтрогену [11]. О^м того, в обстежених дггей ви-значено бронхоспазм фiзичноï напруги в пробi з до-зованим бтом (iндекс бронхоспазму) та показник лабшьносп бронхiв з урахуванням бронхомоторноï реакцИ пiсля iнгаляцïï сальбутамолу.
Характер запалення бронхiв визначали на тд-ставi цитологiчного аналiзу iндукованого мокро -тиння, одержаного шляхом шгаляцп гшертошчних (3, 5, 7%) розчинiв натрш хлориду [12]. За наяв-ност в мокротиннi 3 % та бшьше еозинофiльних лейкоцитiв робили висновок про еозинофшьний характер запальних (ЕХЗ) змш дихальних шляхiв, а за наявност менше 59 % нейтрофшьних та 2 % i менше еозинофшьних гранулоцитiв встановлю-вали пауцигранулоцитарний запальний варiант (ПХЗ) [4, 13].
Генетичш дослiдження проводилися на кафедрi молекулярноï генетики та бiотехнологïï Чершвець-кого нацiонального унiверситету iм. Ю. Федькови-ча. Загальну геномну ДНК видшяли з кровi згщно зi стандартним протоколом [14]. Для генотипування ендотелiальноï NOS за однонуклеотидною замшою G894T (Glu298^Asp) отриманi продукти полiмераз-но-ланцюговоï реакцïï (ПЛР) (очiкувана довжина 250 нп) обробляли рестриктазою Есо24 I (=Вап1). При цьому за наявносп алелi G дикого типу ре-стриктаза розщеплювала ПЛР-продукт на два фрагменти довжиною 90 та 160 нп, а за наявносп мутантноï алелi Т ПЛР-продукт залишався нероз-щепленим. Обробку ПЛР-продукту рестриктазою проводили зпдно з рекомендацiями виробника ферменту (Fermentas). Отримаш рестриктнi фрагмента аналiзували методом електрофорезу у 2% ага-розному гелi.
Одержат результати дослщження аналiзували з використанням непараметричних методiв. Пра-вильнiсть нульово! гiпотези визначали з урахуванням рiвня значущостi Р (за Стьюдентом): для вiдносних величин — методом кутового перетво-рення Фiшера (Рф), а для абсолютних величин — за методом Вглкоксона — Манна (Ри). Дослiджен-ня проведене з урахуванням основних положень 1СН ОСР та Хельсшсько! декларацп щодо бю-медичних дослiджень, у яких людина виступае !х об'ектом.
Результати та Тх обговорення
Показано, що в дггей за еозинофгльного характеру запалення бронхiв легка персистуюча БА ви-значалася у 8,7 % спостережень, середньотяжка — у 32,6 % i тяжка — у 58,7 % випадюв. У групi поргв-няння хворих iз легким персистуванням БА не тра-плялося, середньотяжкий перебiг вiдмiчено у 40,0 % дггей, а тяжкий — у 60,0 % хворих (Р > 0,05).
Маргшальш значення маси тгла при народженнi як один iз показникiв схильностi до розвитку БА у дггей груп порiвняння мали певш розбiжностi. Так, у I клшчнш групi маса тiла при народженш понад 3400 г визначалася у 71,0 % дггей, а менше 2500 г — в 11,0 % хворих. У груш порГвняння наведет показники маси тгла при народженш визначалися вщпо-вщно в 60,0 % випадюв (Р > 0,05) та 40,0 % спостережень (Р < 0,05).
Частота грудного вигодовування на першому рощ життя у представниюв I клшчног групи стано-вила 63,0 % випадюв, а в дггей II групи — 46,7 % спостережень (Р > 0,05).
Генеалопчний шдекс за атошчними захворюваннями у дгтей з ЕХЗ бронхГв сягав у середньому 0,06 ум.од., а у хворих ¡з ПХЗ дихальних шляхГв — 0,09 ум.од. (Р < 0,05).
Не встановлено суттевих розбгжностей за частотою присутносп потенцшно сенсибшзуючих факторГв в оточенш дгтей груп порГвняння. Так, у хворих I клшчног групи хрошчна експозицгя тютю-нового диму вГдмГчена у 18,4 % випадюв, наявшсть домашшх тварин — у 6,0 %, а таких акумуляторГв домашнього пилу, як килими в юмнап, де спить ди-тина, — у 19,0 % спостережень. У представниюв II клшчног групи наведеш потенцшно сенсибшзуючГ фактори траплялися вщповщно у 13,3; 13,3 та 20,0 % спостережень.
У табл. 1 наведена частота алельного полГморфГз-му гена eNOS у дггей за рГзного характеру запального процесу в бронхах.
Наведет дат дають тдстави вважати, що вщ-сутнють мутацш гена eNOS у виглядГ генотипу ОО виявилася характершшою для хворих ¡з пауцигра-нулоцитарним характером запалення бронх1в, на-томють алельний полГморфГзм ОТ/ТТ — для дггей I групи поргвняння.
У табл. 2 наведена особливють розподглу тяжко-сп перебяу БА у дггей груп пор1вняння за наявност чи вщсутносп алельного пол1морфгзму гена eNOS.
KAiHiHHa пед1атр1я / Clinical Pediatrics
Таблиця 1. Частота генотип1в еЫОЭ у дтей ¡з р1зним характером запалення бронх'в
КШШЧШ групи Кшьшсть хворих, n Розподт генотипiв eNOS
GG GT ТТ
Абс. % Абс. % Абс. %
Еозинофтьний субтип 22 9 40,9 9 40,9 4 18,2
Пауцигранулоцитарний субтип 15 9 60,0 5 33,3 1 6,7
Р > 0,05 < 0,05 > 0,05
Таблиця 2. Частота розподлу тяжкост БА за р'зного характеру запалення бронх'в та алельного
пол'морф'зму гена еЫОЭ
№шчш групи Ктьмсть хворих, n Розподш генотишв eNOS
GG GT/TT
Легка БА Середньо-тяжка БА Тяжка БА Легка БА Середньо-тяжка БА Тяжка БА
Еозинофтьний субтип 22 - 33,3 66,7 10,8 32,4 56,8
Пауцигранулоцитарний субтип 15 - 33,3 66,7 7,14 50,0 42,9
Р > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05
Отримат дат в цглому збтаються з думкою Б.Ь. ШсаагёоЬ [15] про те, що алельний полiмор-фiзм гена eNOS е фактором схильностi до БА, проте суттево не впливае на тяжшсть 11 перебiгу.
Водночас слщ вiдмiтити, що за наявностi алельного полiморфiзму гена eNOS у дггей iз пауциграну-лоцитарним характером запалення бронхiв частiше визначалися супутш алергiчнi захворювання порiв-няно з групою порiвняння за даного генотипу. Так, клтчт прояви атопiчного дерматиту й алерпчного ринiту в дггей I клшчно! групи за генотипу ОТ/ТТ визначалися в 11,1 % спостережень, а у хворих групи порiвняння з указаним генотипом — вщповщно у 21,4 та 28,6 % випадюв.
Поряд iз частшим виявленням у хворих iз ПХЗ бронхiв та при генотип ОТ/ТТ супутнгх алергiчних захворювань у них траплялися виразнiшi ознаки не-специфiчноI гiперреактивностi бронхiв, атотчно'1 реактивност органiзму при зменшеннi вмiсту мета-болiтiв монооксиду нiтрогену у видихуваному по-вiтрi. Так, у даних хворих iндекс лабiльностi брон-хiв становив у середньому 46,7 %, середнш вмiст у сироватцi кровi загального iмуноглобулiну Е — 766,0 МО/мл, а концентрац1я метаболiтiв N0 в конденсат повиря, що видихаеться, — 22,6 мкмоль/мл. У дггей з ЕХЗ бронхiв за даного алельного полiмор-фiзму гена eNOS щ показники вщповщно стано-вили 16,8 % (Р < 0,05), 550,2 МО/мл (Р > 0,05) та 39,2 мкмоль/мл (Р < 0,05).
Розглядаючи зниження вмюту метаболтв монооксиду нiгрогену в повир^ що видихаеться, як непрямий показник функцюнального стану eNOS, можна зробити висновок про те, що наявнють алельного полiморфiзму даного гена сприяе розвитку алергiчного запалення та формуванню гшерреак-тивностi бронх1в, що узгоджуеться в цiлому з результатами, отриманими iншими дослщниками [7, 8].
Таким чином, наведет результата з вивчення особливостей переб^ БА за алельного полiморфiз-му гена eNOS у дггей та рiзного характеру запального процесу в бронхах дають тдстави вважати, що таю характеры особливостi захворювання, як гшерре-активнiсть бронхiв, атопiчна реактивнють оргашз-му та вираженiсть мюцевого запального процесу (за даними вмюту метаболiтiв монооксиду нiгрогену в конденсат повиря, що видихаеться), визначаються як мутацiями гену eNOS, так i характером запальних змiн у дихальних шляхах.
Висновки
1. Алельний полiморфiзм гена eNOS у виглядi генотипу ОТ/ТТ в^чено у хворих на бронхiальну астму з еозинофгльним характером запалення брон-хiв у 59,1 % випадюв, а при пауцигранулоцитарному субтипi запалення — у 40,0 % спостережень.
2. Тяжшсть бронх1ально! астми у хворих за еози-нофiльного та пауцигранулоцитарного варiантiв запалення бронхiв суттево не залежить вiд алельного полiморфiзму гена eNOS.
3. При алельному полiморфiзмi гена eNOS у да-тей iз пауцигранулоцитарним характером запалення бронх1в частiше вiдмiченi прояви атошчно! реактивносп оргашзму, н1ж за еозинофшьного субтипу запалення. Зокрема, вдвiчi бгльшою е частота супутнгх алерпчних захворювань, а вмiст загального 1§Б у сироватцi кровi становить 766,0 проти 550,2 МО/мл у груш порiвняння.
4. У дггей за алельного полiморфiзму гена eNOS при пауцигранулоцитарному варiантi запалення бронхiв шдекс лабiльностi бронх1в е суттево вищим, н1ж за алергiчного характеру запальних змш (46,7 проти 16,8 %), а вмют у конденсатi видихуваного по-вiгря метаболiтiв монооксиду штрогену — вiрогiдно меншим (22,6 проти 39,2 мкмоль/мл).
KëiHi4Ha neAiorpifl / Clinical Pediatrics
Список л1тератури
1. Pedersen S.F. Global strategy for the diagnosis and management ofasthma in children 5years and younger/ S.E. Pederson, S.S. Hurd, R.F. Lemanske [et al.]//Pediatr. Pulmonol. — 2011. — Vol. 46(l). — P. 1-17.
2. Bacharier L.B. Diagnosis and treatment ofasthma in childhood: a PRACTALL consensus report / L.B. Bacharier, A. Boner, K.H. Carlsen et al]//Allergy. — 2008. — Vol. 63(1). — P. 5-34.
3. Бабаджан Н.Д. 1муно-патогенетичт дiагностичнi аспек-ти запальних фенотитв бронхiальноi астми / Н.Д. Бабаджан, Л.В. Кузнецова, Г.1. Назаренко, I.A. Асика // 1мунологЯ та алергологЯ: наука i практика. — 2011. — № 3. — С. 51-60.
4. Simpson J.L. Inflammatory subtypes in asthma: assessment and identification using induced sputum / J.L. Simpson, R. Scott, M.J. Boyle, P.G. Gibson // Respirology. — 2006. — Vol. 11(1). — P. 54-61.
5. Broeke R.L. Overexpression of endothelial nitric oxide synthase suppresses features of allergic in mice / R.T. Broeke, R. De Crom, R. Van Haperen [et al.] // Respir. Res. — 2006. — Vol. 7(1). — P. 7-58.
6. Yanamandra K. Novel allele of endothelial nitric oxide synthase gene polymorphism in Caucasian asthmatics / K. Yanamandra, P.B. Boggs, T.F. Thurmon [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2005. — Vol. 335 (2). — P. 545-549.
7. Meurs H. Airway hyperresponsiveness in asthma: lessons from in vitro model systems and animal models / H. Meurs, R. Gosens, J. Zaagsma//Eur. Respir. J. — 2008. — Vol. 32 (2). — P. 487-502.
8. Kabayashi K. The effect of overexpression of endothelial nitric oxide synthase on eosinophilic lung inflammation in a murine
Безруков A.A., Колоскова A.K., Билоус T.M., Богуцкая H.K. Буковинский государственный медицинский университет M3 Украины, кафедра педиатрии и детских инфекционных болезней, г. Черновцы
АЛЛЕЛЬНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА eNOS У ДЕТЕЙ, СТРАДАЮЩИХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ, ПРИ ЭОЗИНОФИЛЬНОМ И ПАУЦИГРАНУЛОЦИТАРНОМ СУБТИПАХ ВОСПАЛЕНИЯ БРОНХОВ
Резюме. Целью работы было изучить влияние аллель-ного полиморфизма гена eNOS, кодирующего активность эндотелиальной NO-синтазы и синтез монооксида ни-трогена в дыхательных путях, на отдельные клинико-па-раклинические показатели бронхиальной астмы у детей школьного возраста с эозинофильным и пауцигранулоци-тарным воспалительным фенотипом.
Обследовано 22 больных бронхиальной астмой с эози-нофильным характером воспаления дыхательных путей и 15 пациентов — с пауцигранулоцитарным. Проведены иммунологические, спирометрические исследования, ге-нотипирование эндотелиальной NOS.
Тяжесть бронхиальной астмы у больных с различным типом воспаления бронхов существенно не зависит от аллельного полиморфизма гена eNOS. Отсутствие мутаций гена eNOS в виде генотипа GG было характерным для больных с пауцигранулоцитарным характером воспаления бронхов, аллельный полиморфизм GT/TT — для детей с эозинофильным воспалением. При наличии аллельного полиморфизма гена eNOS с генотипом GT/TT у детей с пауцигранулоцитарным характером воспаления бронхов были характерными более частые клинические проявления атопического дерматита и аллергического ринита, больший индекс лабильности бронхов и более низкая концентрация метаболитов NO в конденсате выдыхаемого воздуха.
Ключевые слова: бронхиальная астма, дети, тип воспаления, генотип eNOS.
model / K. Kabayashi, Y. Nishimura, T. Yamashita [et al.] // Int. Immunopharmacol. — 2006. — Vol. 6(7). — P. 1040-1052.
9. Курбачева О.М. Современный подход к выбору терапии бронхиальной астмы: от понимания клинических фенотипов к практическим аспектам / О.М. Курбачева, К. С. Павлова, И.Е. Козулина// РМЖ. Болезни дыхательных путей. — 2013. — Т. 21, № 29. — С. 1452-1460.
10. Перцева Т.А. Диагностическая трактовка понятия «бронхиальная астма». Фенотипы и уровень контроля над заболеванием [Электронный ресурс]/ Т.А. Перцева. — Режим доступа: http://www.likar.info/biblioteka/50056/
11. Емченко Н.Л. Универсальный метод определения нитратов в биосредах организма / Н.Л. Емченко, О.И. Цыганенко, Т.В. Ковальская//Клиническая и лабораторная диагностика. — 1994. — № 6. — С. 19-20.
12. Pavord I.D. The use of induced sputum to investigate airway inflammation /I.D. Pavord, M.M. Pizzichini, E. Pizzichini [et al.]// Thorax. — 1997. — Vol. 52(6). — P. 498-501.
13. Lex C. Sputum induction in children with difficult asthma: safety, feasibility and inflammatory cell patterns / C. Lex, D.N.R. Rayne, A. Zacharasiewich [et al.] // Pediatr. Pulmon. — 2005. — Vol. 39(4). — P. 318-324.
14. Выделение ДНК из крови / Практическая молекулярная биология [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://molbiol. edu.ru/map.html
15. Ricciardolo F.L. Multiple roles of nitric oxide in the airways/ F.L. Ricciardolo //Thorax. — 2003. — Vol. 58(2). — P. 175-182.
Отримано 10.01.15 ■
Bezrukov L.O., Koloskova O.K., Bilous T.M., Bohutska N.K. Bukovinian State Medical University of Ministry of Healthcare of Ukraine, Department of Pediatrics and Pediatric Infectious Diseases, Chernivtsi, Ukraine
ALLELIC POLYMORPHISM OF eNOS GENE IN CHILDREN
WHO SUFFER FROM BRONCHIAL ASTHMA, WITH EOSINOPHILIC AND PAUCIGRANULOCYTIC SUBTYPES OF BRONCHIAL INFLAMMATION
Summary. The objective of the research was to study the effect of allelic polymorphism of eNOS gene, encoding the activity of endothelial NO-synthase and synthesis of nitrogen monoxide in the airways, on some clinical and paraclinical parameters of bronchial asthma in school-age children with eosinophilic and paucigranulocytic inflammatory subtypes.
We have examined 22 patients with bronchial asthma with eosinophilic nature of the airway inflammation and 15 patients — with paucigranulocytic one. The immunological, spirometric studies, genotyping of endothelial NOS were carried out.
The severity of bronchial asthma in patients with different types of bronchial inflammation doesn't depend on allelic polymorphism of the eNOS gene. The absence ofeNOS gene mutations as GG genotype was characteristic of patients with paucigranulocytic bronchial inflammation, allelic polymorphism GT/TT — of children with eosinophilic inflammation. In the presence of allelic polymorphism of eNOS gene as GT/TT genotype, children with paucigranulocytic bronchial inflammation were characterized by more frequent clinical manifestations of atopic dermatitis and allergic rhinitis, higher bronchial lability index and lower concentrations of NO metabolites in the exhaled breath condensate.
Key words: bronchial asthma, children, type of inflammation, eNOS genotype.
