CC BY
11УДК 619:616.981.42.615.371 DOI 10.33632/1998-698Х.2021-5-49-54
АКТИВНОСТЬ НИТРОКСИДЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ИММУНИЗАЦИИ КРОЛИКОВ ВАКЦИНОЙ ИЗ ШТАММА B. ABORTUS 82
Л.А. Тухватуллина1, Р.Г. Каримова1 - доктор биологических наук, М.А. Косарев2 - кандидат биологических наук, Г.М. Сафина2 - кандидат ветеринарных наук, Я.А. Богова2, Р.Ю. Насибуллин2
хФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» 420029, г. Казань, Сибирский тракт, 35, e-mail: uch.zap1883@mail.ru
2ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», 420075, г. Казань, Научный городок - 2, e-mail: vnivi@mail.ru
В настоящее время в науке и практике большое внимание уделяется изучению такой особо опасной инфекции как бруцеллез. При распространении бруцеллеза среди животных допускается потенциальная возможность заболевания людей. В данной работе целью проведенных исследований было изучить роль нитроксидергической системы в патогенезе бруцеллеза. Установлена динамика образования Б антител крови в РБП (роз бенгал проба), РСК (реакция связывания комплемента) и РА (реакция агглютинации) - через 15, 30 и 45 суток после иммунизации в опытной группе была одинакова, без увеличения. Однако в РСК с Я-антигеном через два месяца титры Я антител заметно увеличились и составили в среднем по группе 1:80. После вакцинации, несмотря на то, что антитела повышались, активность оксида азота снизилась.
Ключевые слова: бруцеллез, оксид азота (NO), РСК, РА, РБП, нитрат- и нитрит- анионы, вакцинация.
Введение. Оксид азота (II) впервые привлек интерес биологов, когда было обнаружено, что эта неорганическая молекула активирует цитозольную гуанилатциклазу и стимулирует образование циклического гуано-зинмонофосфата ^МР) в клетках млекопитающих [12].
В середине 1980-х годов химическая идентичность фактора сосудистой релаксации, происходящего из эндотелия (первоначально описанного как EDRF) [7], была обнаружена как N0, свободный радикал. Оксид азота (II), будучи небольшой, нейтральной и гидрофобной молекулой, способен проникать через клеточные мембраны и перемещаться через клеточные компоненты для осуществления паракринных функций. Диффузия N0 между тканями обусловлена его быстрой реакцией с оксигемоглобином и действия N0 в основном локальные в тканях; биологические периоды полураспада и диффузии составляют порядка от 1 до 10 секунд. Большая часть биологического образования оксида азота (II) является результатом жестко контролируемой фермен-
тативнои реакцией, катализируемои синтезами оксида азота (II) (NOS), которые присутствуют в трех изоформах (эндотелиальной NOS, индуцибельный NOS (INOS) и нейрональной NOS) [13].
В настоящее время на территории Российской Федерации регистрируются инфекционные болезни животных, которые наносят экономический ущерб. Они представляют опасность для здоровья людей. Среди этих заболеваний также находится и бруцеллез. Сложность борьбы с этой инфекцией обусловлена особенностями биологии ее возбудителя, наличием большого числа штаммов [1, 2].
Исследования показали, что CD4+T-клетки, продуцирующие ИФН-у и дендритные клетки, продуцирующие индуцибельную синтезу оксида азота (iNOS/NOS2) являются главными компонентами протективного иммунного ответа против возбудителя бруцеллеза. Показано, что B. melitensis активирует TLR9/MyD88 сигнальные пути и вызывает продукцию NO инфицированными провос-палительными дендритными клетками. NO
проявляет токсичность, как в отношении тканей хозяина, так и патогенов, и его регуляция является важной в подавлении цитотоксичности хозяина. Увеличение Argl через экспрессию TLR/MyD88-зависимый путь в ответ на обнаружение бактерий может считаться ответным механизмом, который ограничивает токсичность для иммунной системы во время хронической инфекции. Но этот механизм может также способствовать внутриклеточному сохранению бактерии в активном состоянии, путем ограничения продукции NO и представляет собой механизм уклонения внутриклеточных патогенов от действия иммунной системы [3].
Исходя из сказанного, изучение механизмов патогенеза бруцеллеза на клеточном уровне является актуальной задачей на сегодняшний день.
Целью проведенных исследований было изучить роль NO в патогенезе бруцеллеза.
Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:
- изучить уровень NO (стабильных метаболитов оксида азота) в сыворотке крови вакцинированных кроликов;
- изучить титр антител после вакцинации.
Материалы и методы. Эксперименты были проведены в условиях лаборатории бактериальных зооантропонозов в ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» на кроликах. Животных разделили на 2 группы:
- первая группа - контрольная: (n=5);
- вторая группа - опытная: (n=5).
У первой группы изучили количество нитрит- и нитрат-анионов в сыворотке крови до иммунизации. Вторую группу животных иммунизировали вакциной штамма B. abortus 82в дозе 10 млрд. микробных клеток и на 15, 30, 45 день изучили количество нитрит- и нитрат-анионов в сыворотке крови, и образовавшиеся количество антител.
Кровь у кроликов брали при помощи иглы из ушной вены.
Серологическая диагностика. Для серологической диагностики и изучения динамики образования антител у кроликов
проводили реакции РСК, РА, РБП с использованием S- и R- антигенов в различные сроки после иммунизации в условиях лаборатории бактериальных инфекций ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».
Определение уровня конечных метаболитов оксида азота (II). Об интенсивности образования NO в организме судили по содержанию в сыворотке крови продуктов его превращения - нитрит- и нитрат-анионов, которые определяли путём восстановления нитратов до нитритов однократной навеской цинковой пыли, обработанной аммиачным комплексом сульфата меди с последующим фотометрическим определением нитритов с помощью реактива Грисса при длине волны 520,0 нм на КФК - 3 - 01 [9, 10].
Все результаты были подвергнуты статистической обработке с использованием критерия Стьюдента.
Результаты исследований. У вакцинированных кроликов образование оксида азота (II) происходит интенсивнее в сравнении с кроликами контрольной группы до вакцинации.
Так, в контрольной группе уровень метаболитов NO составил (16,0±2,35) мкмоль/ л. У второй группы животных на 15 день уровень метаболитов NO составил (15,45 ±1,02) мкмоль/л, на 30 день (15,27±1,02) мкмоль/л (р < 0,05), на 45 день (15,16±1,02) мкмоль/л (р < 0,01).
Сравнивая средние значения NOх кроликов контрольной группы и опытной, можно сделать вывод: в контрольной группе наибольшая активность NO по сравнению с групп-пой после вакцинации (рисунок 1).
Исследования в РБП через 15, 30 и 45 суток во всех группах после введения культуры из штамма B.abortus-82 в количестве 10 млрд. микробных клеток показали одинаковые результаты «+++».
В РА положительно реагировали все животные, титры антител в опытной группе составил 1:80.
В РСК с S-антигеном средний титр антител был одинаковым - 1:10.
Рисунок 1 - Уровень нитрат - и нитрит - анионов в сыворотки крови, мкмоль/л
Таблица 1 - Титры антител в сыворотках крови кроликов, привитых вакциной из штамма B. аbortus 82, в различные сроки после вакцинации
СО а Й к ^ Кол- На 15 сутки На 30 сутки На 45 сутки
во живо РСК РСК РСК
Я н ^ и й Р га т-ных РБП РА S-аг R-аг РБП РА S-аг R-аг РБП РА S-аг R-аг
1 +++ 1:80 1:10 1:10 +++ 1:80 1:10 1:20 +++ 1:80 1:10 1:40
00 2 +++ 1:80 1:10 1:10 +++ 1:80 1:10 1:40 +++ 1:80 1:10 1:80
£ о „о 3 +++ 1:80 1:10 1:20 +++ 1:80 1:10 1:40 +++ 1:80 1:10 1:80
й т 4 +++ 1:80 1:10 1:20 +++ 1:80 1:10 1:40 +++ 1:80 1:10 1:80
5 +++ 1:80 1:10 1:10 +++ 1:80 1:10 1:40 +++ 1:80 1:10 1:80
й к К & 1 отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр.
2 отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр.
« й К л 3 отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр.
о & о и 4 отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр.
5 отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр.
Примечание - отр. - отрицательное
С R-антигеном уровень антител в среднем по группе составил 1:10, на 30 день увеличился и составил в среднем по группе 1:40 и на 45 день также отмечено увеличение антител в среднем по группе 1:80. Резуль-таты серологического исследования пред-ставлены в таблице 1
Заключение. Динамика образова-ния S антител крови в РБП, РСК и РА с единым антигеном через 15, 30 и 45 суток после иммунизации была одинакова, без увеличения.
В то время как в РСК с R-антигеном титры R антител заметно увели-чились на 45 день и составили в среднем по группе 1:80. Активность нитроксидер-гической системы уменьшается на 3,43 % к 15 дню после вакцинации, на 4,55 % (р<0,05) к 30 дню после вакцинации и на 5, 25 % (р<0,01) к 45 дню после вакцинации. Установлено, что активность нитроксидергической системы после вакцинации уменьшается, несмотря на то, что антитела после вакцинации повышаются.
Литература
1. Гордиенко, Л.Н. Возможность предотвращения рисков заноса и распространения инфекционных болезней животных на трансграничных территориях стран Евразийского экономического союза / Л.Н Гордиенко, Е.В. Куликова, А.Л. Воробьёв, З.С. Кельдибекова // Сборник научных статей международной научно-практической конференции «Научно-технологическое развитие АПК как драйвер экономического роста ЕАЭС» 9-10 октября 2017 г. - М.: Науч. консультант, 2018. - 295 с. - 500 экз
2. Гордиенко, Л.Н. Оценка иммунного ответа статуса импортного крупного рогатого скота, оздоравливаемого от бруцеллеза / Л.Н. Гордиенко, Е.В. Куликова, Г.М. Гайдуцкая, Н.Б. Еланцева, Т.И. Волкова, Т.В. Гуськова // Ветеринария.- 2017.- № 2. - С. 19-22.
3. Дубровина, В.И. Механизмы клеточного иммунного ответа при бруцеллезе /
B.И Дубровина, Ж.А Коновалова, К.Ю. Ястремская, Н.Л. Баранникова, Л.Е. Токарева, С.В. Балахонов // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. - 2016. - № 6. - С 80-87.
4. Зенкина, В.Г. Участие оксида в овариальном цикле / В.Г. Зенкина, О.А. Солодкова // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - №6. - С.10.
5. Каримова, Р.Г. Полезный приспособительный эффект нитроксидергической системы / Р.Г. Каримова, Т.В. Гарипов // Известия Самарской сельскохозяйственной академии. - 2011. - № 1. -
C. 42 - 46.
6. Королева, Л. Средства и способы борьбы с туберкулезом и бруцеллезом / Л. Королева // Журнал практикующего специалиста. - 2002. - № 1. - С. 32-36.
7. Кузнецова, В.Л. Оксид азота: свойства, биологическая роль, механизмы действия /
B.Л. Кузнецова, А.Г. Соловьева // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - № 4. -
C. 24-29.
8. Новиков, В.Е. Роль митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала и его модуляторов в адаптации клетки к гипоксии / В.Е. Новиков, О.С. Левченкова, Е.В. Пожилова // Вестник Смоленской государственной медицинской академии. - 2014. - Т.13(2). - С. 48-54.
9. Рецкий, М.И. Методические рекомендации по определению стабильных метаболитов оксида азота в плазме (сыворотке) крови / М.И. Рецкий, Г.Н. Близнецова // Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины. - М.: РАСХН, 2007. - С. 119-123.
10. Фотометрический метод определения нитратов и нитритов в биологических жидкостях: инструкция по применению № 91-0008; утв. 19.03.2001 / А.П. Солодков, И.С. Веремей // Современные методы диагностики, лечения и профилактики заболеваний. - Минск: Витебс. гос. мед. унив-т, 1999. - Т. 2(3). - С. 274-277.
11. Blantz, R.C. The complex role of nitric oxide in the regulation of glomerular ultrafiltration / R.C Blantz, A. Deng, M. Lortie, K. Munger, V. Vallon, F.B. Gabbai, S.C. Thomson // Kidney Int. - 2002. -Vol. 61. - P. 782-785.
12. Ignarro, L. J. A Novel Signal Transduction Mechanism for Transcellular Communication / L. J. Ignarro // Hypertension. - 1990. - Vol 16. - P. 477-483.
13. Radi, R Oxygen radicals, nitricoxide, and peroxynitrite: Redox pathways in molecular medicine / R. Radi // PNAS. - 2018. - Vol 5.- P. 5839-5848.
ACTIVITY OF THE NITROXYDERGIC SYSTEM DURING IMMUNIZATION OF RABBITS WITH A VACCINE FROM THE B. ABORTUS 82 STRAIN
L.A. Tukhvatullina1, R.G. Karimova1 - Doctor of Biological Sciences, Professor,
M.A. Kosarev2- Candidate of Biological Sciences, G.M. Safina2 - Candidate of Veterinary Sciences,
Y.A. Bogova2, R.Y. Nasibullin2
1Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Education «Kazan State Academy of Veterinary Medicine named after N.Bauman» 420029, Kazan, Sibirskiy trakt, 35, e-mail: uch.zap1883@mail.ru
2FSBSI «Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety», 420075, Kazan, Nauchny gorodok-2, e-mail: vnivi@mail.ru
In science and practice, much attention is currently given to the study of such a particularly dangerous infection as brucellosis. With the worldwide spread of brucellosis among animals, the potential for human disease is allowed. The aim of the research was to study the role of the nitroxydergic system in the pathogenesis of brucellosis; to study the level of NO (stable metabolites of nitric oxide) in the blood serum of vaccinated rabbits; to study the antibody titer after vaccination. Thus, the dynamics of the formation of blood S antibodies in RBP, CSC and RA with a single antigen 15, 30, and 45 days after immunization in all groups was the same, without an increase. Two months later, in CSCs with R-antigen, the titer of R antibodies increased markedly and averaged 1:80 for the group. After vaccination, although the antibody titer rises, nitric oxide levels decrease. In the long term, it will be advisable to use donors of nitric oxide, which increase its formation. Presumably, this will significantly increase the nonspecific immunity of the animal's body during vaccination.
Keywords: brucella, nitric oxide (NO), Complement Fixation Test (CFT), Serum (tube) Agglutination Test (SAT), Rose Bengal Test (RBT), nitrate- and nitrite- anions, vaccination.
References
1. Gordienko, L.N. The possibility of preventing the risks of introduction and spread of infectious animal diseases in the transboundary territories of the countries of the Eurasian Economic Union / L. N. Gordienko, E.V. Kulikova, A.L. Vorobyov, Z.S. Keldibekova // Collection of scientific articles of the international scientific and practical conference " Scientific and technological development of agriculture as a driver of economic growth of the EAEU", october 9-10, 2017-M.: LLC «Scientific consultant», 2018. - 282 p. - ISBN 978-5 6040635-2-1.
2. Gordienko, L.N. Assessment of the immune response of the status of imported cattle recovering from brucellosis / L.N. Gordienko, E.V. Kulikova, G.M. Gaidutskaya, N.B. Elantseva, T.I. Volkova, T.V. Guskova // Veterinary medicine. - 2017. - №. 2. - pp. 19-22.
3. Dubrovina, V.I. Mechanisms of cellular immune response in brucellosis / V.I. Dubrovina, Zh.A. Konovalova, K.Yu. Yastremskaya, N.L. Barannikova, L.E. Tokareva, S.V. Balakhonov // Epidemiology and Vaccination prevention. - 2016. - № 6. - From 80-87.
4. Zenkina, V.G. Participation of oxide in the ovarian cycle / V.G. Zenkina, O.A. Solodkova // Modern problems of science and education. - 2015. - № 6. - P.-10.
5. Karimov, R.G. Useful adaptive effect of nitroxidergic system / R.G. Karimov, Garipov, T.V. // Proceedings of the Samara state agricultural Academy. - 2011. - № 1. - P. 42 - 46.
6. Koroleva, L. Means and methods for tuberculosis and brucellosis / L. Koroleva // Journal a health care practitioner. - 2002. - № 1. - P. 32-36.
7. Kuznetsova, V.L. Nitric oxide: properties, biological role, mechanisms of action / V.L. Kuznetsova, A.G. Solovyova // Modern problems of science and education. - 2015. - № 4. - P. 24-29.
ЖУРНАЛ ДЛЯ ПРОФЕССИОНАЛОВ ОТ ПРОФЕССИОНАЛОВ
8. Novikov, V.E. The role of the mitochondrial ATP-dependent potassium channel and its modulators in cell adaptation to hypoxia / V.E. Novikov, O.S. Levchenkova, E.V. Senzherzhova // Bulletin of the Smolensk State Medical Academy. - 2014. - Vol. 13 (2). - pp. 48-54.
9. Retsky, M.I. Methodological recommendations for the determination of stable nitric oxide metabolites in blood plasma (serum) / M.I. Retsky, G.N. Kuznetsova // New methods of research on problems of veterinary medicine. - M.: RASKHN, - 2007. - pp. 119-123.
10. Photometric method for the determination of nitrates and nitrites in biological fluids: instructions for use № 91-0008; approved 19.03.2001 / A.P. Solodkov, I.S. Veremey // Modern methods of diagnosis, treatment and prevention of diseases. - Minsk: Vitebs. State med. univ.-ty, 1999. - T. 2(3). - pp. 274-277.
11. Blantz, R.C. The complex role of nitric oxide in the regulation of glomerular ultrafiltration / R.C. Blantz, A. Deng, M. Lortie, K. Munger, V. Vallon, F.B. Gabbai, S C. Thomson // Kidney Int. - 2002. -Vol. 61. - P. 782-785.
12. Ignarro, L.J. A Novel Signal Transduction Mechanism for Transcellular Communication / L.J. Ignarro // Hypertension. - 1990. - Vol 16.- P.477-483.
13. Radi, R Oxygen radicals, nitricoxide, and peroxynitrite: Redox pathways in molecular medicine / R. Radi // PNAS. - 2018. - Vol 5. -P. 5839-5848.
