CC BY
45
УДК 577.112.7:616
АКТИВАЦІЯ ТРАНСКРИПЦІЇ ГЕНА EGR2 В ГЕНЕТИЧНО МОДИФІКОВАНИХ КЛІТИНАХ З НАДЕКСПРЕСІЄЮ ТРАНСКРИПЦІЙНОГО ФАКТОРА ZXDC
О. В. Галкін1'2 Університет медичного центру Канзасу, м. Канзас, США
О. Г. Мінченко3 2Київський національний університет імені Тараса Шевченка
3Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ
E-mail: [email protected]
Транскрипційний фактор ZXDC бере участь у регуляції експресії гена MHCII в евкаріотів. Раніше за допомогою мікроарей-аналізу та полімеразної ланцюгової реакції було встановлено, що над-експресія фактора ZXDC в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293 спричинює підвищення рівня експресії низки інших генів, зокрема BDNF, CDKN1C, IL5Ra та EGR2. У цьому дослідженні з використанням кількісної полімеразної ланцюгової реакції було визначено, що рівень експресії мРНК EGR2 підвищується у 2,3 раза в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293 та майже у 7 разів — у культурі промієлоцитів лінії HL60 з посиленою експресією ZXDC. Для з’ясування механізмів збільшення рівня експресії гена EGR2 ми клонували промоторну ділянку EGR2 (від -341 до +134) у репортерну плазміду pGL3basic з експресією люциферази. Встановлено, що при котранс-фекції клітин лінії HEK293 плазмідними конструкціями pGL-EGR2-341 та pcDNA3.1-ZXDC експресія люциферази у цих клітинах підвищувалася майже у 2 рази. Крім того, з використанням хроматин-імунопреципітації було показано, що ZXDC зв’язується з промоторною зоною гена EGR2 у клітинах промієлоцитів лінії HL60 in vivo. Отримані дані свідчать про те, що транскрипційний фактор ZXDC бере участь у регуляції транскрипції гена EGR2, зв’язуючись із його промоторною ділянкою.
Ключові слова: транскрипційні фактори, ZXDC, EGR2, надекспресія гена, регуляція транскрипції, клітини промієлоцитів HL60, клітини нирки HEK293.
Відомо, що ZXDC (zinc finger X-linked duplicated family member C) є фактором регуляції транскрипції в евкаріотів, який утворює функціональний комплекс із транскрипційними факторами CIITA та ZXDA, зв’язується з промотором гена головного комплексу гістосумісності MHCII (major histocompatibility complex class II) й активує його, таким чином беручи участь у регуляції рівня його експресії [1, 2]. Крім того, було показано, що домінантно-негативний варіант транскрипційного фактора ZXDC2 здатен блокувати активацію промотору гена MHCII, утворюючи інгібіторний комплекс з ZXDC [3].
Встановлено також, що ZXDC бере участь у регуляції транскрипції не лише гена MHCII, а й низки інших генів. Так, підвищена експресія ZXDC в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293 посилювала рівень експресії генів з мозку нейротропного фактора BDNF (brain-derived neurotrophic fac-
tor), інгібітору 1С циклін-залежної кінази CDKN1C (cyclin-dependent kinase inhibitor 1C), альфа-рецептора інтерлейкіну 5 IL5Ra (interleukin 5 receptor, а), фактора 2 ранніх змін росту EGR2 (early growth response 2) та ряду інших факторів, які беруть участь у регуляції клітинного циклу, міжклітинних взаємодіях і дозріванні та диференціації клітин імунної системи [4].
Протеїновий продукт одного із цих генів, а саме EGR2, належить до родини протеїнів із цинковими пальцями типу Cys2His2, що мають здатність до зв’язування зі специфічними послідовностями промоторних ділянок ДНК, регулюючи таким чином транскрипцію генів [5, 6]. Рівень експресії гена EGR2 підвищувався за надекспресії ZXDC більш ніж утричі [4]. Відомо, що фактор 2 ранніх змін росту EGR2 бере участь у формуванні нервової тканини, активуючи гени, які регулюють синтез мієліну і опосередковують процес мієлінізації периферійної
нервової системи, а також у регуляції диференціації шваннівських клітин [Т, 8]. Більш того, виявлено залежність диференціації адипоцитів і остеокластів від рівня експресії гена EGR2, а також показано, що він є важливим для процесу селекції в тимусі [9-11].
Також було показано, що EGR2 бере участь у диференціації клітин імунної системи мієлоїдного ряду. Так, експресія гена EGR2 суттєво підвищується під час диференціації мієлоїдних клітин у моноцити [12]. Встановлено, що підвищена експресія гена EGR2 супроводжується репресією низки генів, що контролюють диференціацію нейтрофілів. У свою чергу, експресія гена EGR2 перебуває під контролем головного фактора диференціації моноцитів PU.1 та під впливом факторів сироватки і 12-О-тет-радеканоїлфорбол-13-ацетату, що опосередковано наявністю у промоторі гена елемента CArG1, що відповідає за активацію експресії гена EGR2 [13]. Це підтверджено даними досліджень на нокаутних за геном EGR2 мишах [14]. Так, у цих нокаутних мишей виявлено низку дефектів у M-CSF-залежній диференціації мієлоїдних попередників у макрофаги. Нещодавно було встановлено, що транскрипційний фактор EGR2 може зв’язуватися з ділянкою у промоторній зоні гена одного з головних факторів регуляції моноцитів c-fms та індукувати його експресію [15]. Таким чином, наведені вище дані вказують на те, що транскрипційний фактор EGR2 відіграє важливу роль у регуляції диференціації мієлоїдних попередників, схиляючи їх до диференціації у моноцити [14, 16].
Метою цієї роботи було вивчення молекулярних механізмів активації експресії гена транскрипційного фактора EGR2 за над-експресії фактора транскрипції ZXDC шляхом створення і дослідження експресії репортерної конструкції з промоторною зоною гена EGR2.
Матеріали і методи
Плазміди. Для трансфекції клітин Н1,60 та НЕК293 було використано плазміди pcDNA3.1-ZXDC та pCMV-SPORT6-P-gal, описані раніше [4].
Плазміду pGL-EGR2-341 було отримано шляхом клонування промоторної ділянки гена EGR2 від -772 до +134 у плазміду pGL3basic (Promega, США) з подальшим її вкороченням до -341. Спочатку з геномної ДНК було ампліфіковано промоторну ділянку гена EGR2 з використанням таких прай-
мерів: прямого б'-AAGCTGCATTTCTCTCGA AGCTCCC-3' і зворотного б'-GGAAGCTTT GTCTATTTGCCACTGAC-3'. Продукт ампліфікації та плазміду pGL3basic розрізали за сайтами рестрикції NheI і HindlII, продукти рестрикції було виділено, проведено лігазну реакцію та клонування. Виділену з отриманих позитивних клонів плазмідну ДНК розрізали рестрикційними ендонуклеазами NheI та EcoRI, далі липкі кінці отриманого фрагмента плазміди було «затуплено» за допомогою Т4-полімерази, а отриману конструкцію «зшито» за допомогою лігази. Таким чином отримали плазміду pGL-EGR2-341 на основі pGL3basic, що містила промоторну послідовність гена EGR2 з координатами від -341 до +134.
Трансфекція. У роботі використовували клітинні лінії НЕК293 (ембріональні клітини нирки) та HL60 (промієлоцити). Для трансфекції клітини лінії HEK293 було посіяно у 35 мм чашки з використанням середовища DMEM (Cellgro, США) і додаванням глутаміну до 4 mM, ембріональної сироватки телят до 10% та антибіотиків. Культуру клітин вирощували при 37 °С в атмосфері з 5% СО2 протягом 24 год. Трансфекцію плазмідної ДНК проводили, застосовуючи TurboFect (Fermentas, США), причому для кожної трансфекції було використано 4 pg ДНК pcDNA3.1-ZXDC та pCMV-SPORT6-£-gal. Для цього у стерильні полістиренові пробірки вносили по 400 pl середовища OptiMEM (Gibco, США) і додавали 4 pg ДНК та 6 pl TurboFect, інкубували протягом 20 хв при кімнатній температурі і вносили в чашки з культурами клітин, попередньо промитими середовищем OptiMEM. Транс-фековані клітини інкубували упродовж 48 год при 37 °С в атмосфері з 5% СО2.
Для трансфекції клітин лінії HL60 їх було посіяно у 10 см чашку в кількості 25-104 на 10 мл живильного середовища RPMI-1640 (Cellgro), що містило 4 mM глутаміну, 10% ембріональної сироватки телят та антибіотики. Культуру клітин вирощували при 37 °С в атмосфері з 5% СО2 протягом 48 год. Потім клітини знімали з чашки, рахували та розводили у середовищі RPMI-1640 до щільності 1-107/мл. Трансфекцію проводили методом електропорації, для чого суспензію клітин, що містила 500 тис. клітин, вносили в спеціальні кювети для елект-ропорації, додавали 40 pg ДНК плазміди pcDNA3. 1 -ZXDC або pCMV-SPORT6-P-gal. Електропорацію проводили за допомогою електропоратора BioRad (США) при таких характеристиках: 240 В та 960 мкФ. Транс-
фековані клітини інкубували при 4 °С протягом 30 хв, переносили в чашки із середовищем RPMI-1640, що містило 4 mM глу-таміну та 10% ембріональної сироватки телят і вирощували впродовж 48 год при 37 °С в атмосфері з 5% СО2.
Виділення РНК. Тотальну РНК з ембріональних клітин нирки лінії HEК293 та лінії HL60 (промієлоцити) виділяли за допомогою реагента Trizol (Invitrogen, США). Живильне середовище відбирали з чашок, клітини промивали DPBS і додавали до них по 1 мл реагенту Trizol. Лізат клітин переносили у пробірки, додавали по 200 ці хлороформу, перемішували та центрифугували при 16 600 g і +4 °С протягом 15 хв. Відбирали 350 ці супернатанта, змішували з 350 ці ізопропанолу, додавали 5 цg лінійного ак-риламіду, інкубували впродовж 20 хв за -20 °С і центрифугували при 16 600 g та +4 °С 20 хв. До отриманого осаду РНК доливали 600 ці 70%-го етанолу й центрифугували при 16 600 g і +4 °С 5 хв. Супернатант зливали, пробірки інкубували відкритими при кімнатній температурі протягом 2 хв для випаровування залишків етанолу, а висушений осад РНК розчиняли у стерильній воді, вільній від домішок рибонуклеаз (BioRad, США).
Дослідження активності репортерних конструкцій. Активність репортерних конструкцій з промоторною ділянкою гена транскрипційного фактора EGR2 досліджували в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293. Для проведення трансфекції клітини вирощували в середовищі RPMI-1640 (Cellgro) зі вмістом 4 mM глутаміну та 10% ембріональної сироватки телят при 3Т °С в атмосфері з 5% СО2 протягом 24 год, промивали середовищем OptiMEM (Gibco) і додавали до них 400 ці середовища OptiMEM, яке містило 1 цg ДНК плазмід та 2 ці TurboFect.
Для трансфекції було використано такі суміші плазмід:
1) pRLdCMV (0,025 yg), (pGL3-EGR2-341 (0,2 yg) і pCMV-SPORT6-ß-gal (0,8 yg);
2) pRLdCMV (0,025 yg), pGL3-EGR2-341 (0,2 yg), pcDNA3.1-ZXDC (0,3 yg ) та pCMV-SPORT6-ß-gal (0,5 yg);
3) pRLdCMV (0,025 yg), pGL3basic (0,2 yg) та pCMV-SPORT6-ß-gal (0,8 yg);
4) pRLdCMV (0,025 yg), pGL3basic (0,2 yg), pcDNA3.1-ZXDC (0,3 yg ) та pCMV-SPORT6-ß-gal (0,5 yg).
Трансфековані клітини інкубували впродовж 48 год при 3Т °С в атмосфері з 5% СО2. Далі визначали активність люциферази
з використанням Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega, США) відповідно до протоколу виробника. Для визначення люцифе-разної активності Renilla та Firefly брали 5 ці лізату, вимірювання проводили за допомогою люмінометра моделі 20/20 виробництва Turner Biosystems (США). Сигнал вираховували як відношення активності люцифераз-ної активності Renilla до Firefly.
Хроматинімунопреципітація. Хрома-тинімунопреципітацію здійснювали за методикою Гаммера [17], модифікованою для ембріональних клітин нирки лінії HEK293 і лінії промієлоцитів HL60. Для цього готували суспензію клітин обох ліній у середовищі DMEM з 4 mM глутаміну та 10%-ї ембріональної сироватки телят до щільності 1-106 клітин/мл. До 20 мл суспензії клітин додавали 0,54 мл розчину формальдегіду й інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хв. Далі до суспензії клітин додавали 2 мл 1,25 M розчину гліцину та інкубували при кімнатній температурі 10 хв. Після цього суспензію клітин центрифугували при 700g і 4 °С протягом 4 хв, промивали 10 мл буфера DPBS і повторювали центрифугування.
Осад клітин було ресуспендовано в 0,5 мл холодного буфера 1, що містив 25 мM HEPES, pH 8,0; 0,1% ноніденту NP40; 2 мЫ хлориду магнію; 10 мM хлориду калію та розчин інгібіторів протеїназ (Roche, США). Суспензію клітин інкубували при 4 °С протягом 10 хв і центрифугували за 12 000 g упродовж 10 хв для отримання ядерної фракції. Осад клітинних ядер суспендували в 1,2 мл буфера 2, що містив 50 мШ HEPES, pH 8,0; 140 мШ хлориду натрію; 1% SDS; 1% Тритону-Х100; 1 мM EDTA та розчин інгібіторів про-теїназ (Roche), додавали 20 ці 0,5 yg/мл розчину РНКази А (Roche), інкубували протягом 20 хв при 4 °С і заморожували при -80 °С. Потім лізати розморожували при +4 °С та обробляли ультразвуком на апараті Microson за схемою 10 Вт / 10 с / 2 рази; 8 Вт / 10 с / 8 разів і центрифугували при 20 000g та 4 °С протягом 10 хв. До 1,2 мл супернатанта додавали 5,8 мл буфера 3, який містив 50 мЖ HEPES, pH 8,0; 140 мЖ NaCl, 1% Тритону-Х100, розчин інгібіторів протеїназ (Roche) та 1 мM EDTA, а потім по 100 ці магнітних мікрогранул, укритих протеїном G (Dynabeads, Invitrogen, США), відмитих у розчині 3, та інкубували при 4 °С упродовж 1 год. Далі мікрогранули осаджували за допомогою магнітної підставки, супернатанти розділяли на порції по 1 мл. Для кожної іму-нопреципітації брали по 2 порції лізату
(еквівалент генома 5106 клітин). До лізатів додавали антитіла: 4 p,g моноклональних мишачих IgG (Roche), 4 p,g поліклональних кролячих антитіл до ZXDC та інкубували при 4 °С протягом 5 год. Потім до кожної пробірки додавали 15 ці магнітних мікро-гранул, укритих протеїном G, відмитих у розчині 3, та інкубували при 4 °С 2 год.
Мікрогранули осаджували за допомогою магнітної підставки і промивали протягом 5 хв у буферному розчині 4, який містив 20 мМ Tris, pH 8,0; 140 мМ хлориду натрію, 1% Тритону-Х100, 0,1% SDS, 2 мМ EDTA, потім буфером 5 зі вмістом 20 мМ Tris, pH 8,0; 500 мМ хлориду натрію, 1% Тритону-Х100,
0,1% SDS, 2 мМ EDTA, а далі буфером 6 — 10 мМ Tris, pH 8,0; 500 мМ хлориду натрію, 1% ноніденту NP40, 1% дезоксихолату натрію, 1 мМ EDTA, 25 мМ хлориду літію, а наприкінці — буфером, який містив 10 мМ Tris, pH 8,0, і 1 мМ EDTA (ТЕ). Мікрогранули суспендували в 220 ці розчину 1% SDS з 0,1 мМ карбонату натрію та інкубували протягом 15 хв, потім осаджували, відбирали 200 ці супернатанту і повторювали відмивку.
До отриманих 400 ці супернатанта додавали 14 ці 5М хлориду натрію, 14 ці 1 М Tris, pH 6,5; 8 ці 0,5 М EDTA та 5 ці (50 yg) про-теїнази К. Супернатанти інкубували при 65 °С упродовж 14 год, далі з них виділяли ДНК за допомогою CHIP DNA сіеап & concentrator kit (Zymo Research, США) відповідно до інструкцій виробника. Отриману ДНК розчинили в 60 ці буфера для елюції, з яких для проведення полімеразної ланцюгової реакції брали по 1 ці.
Зворотна транскрипція та полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) у реальному часі. Виділену з ембріональних клітин нирки лінії НЕК293 та лінії HL60 тотальну РНК було використано для реакції зворотної транскрипції за допомогою Quantitect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Німеччина) відповідно до протоколу виробника. Для реакції зворотної транскрипції брали 1 цg РНК та використовували оліго-дТ-праймери.
Далі комплементарну ДНК (кДНК) чи ДНК, отриману після хроматинімунопреципітації було ампліфіковано за допомогою кількісної ПЛР. Для реакції брали 8,2 ці води, вільної від нуклеаз, 1 ці кДНК, 0,8 ці 10 мМ суміші праймерів та 10 ці реакційної суміші для ПЛР у режимі реального часу (Fermentas).
Послідовності праймерів, що їх було використано для полімеразної ланцюгової реакції: для кДНК GAPDH — прямий праймер 5/-ATCACTGCCACCCAGAAGACT-3/, зворотний 5'-GATGACCTTGCCCACAGCCTT-3'; для
кДНК EGR2 — прямий праймер 5'-GTAAGC CCTTTCCCTGCCCACTG-3', зворотний — 5'-GGTCCCTCGCTGCCTCCACTG-3'; а для виявлення ДНК промотора гена EGR2 після хро-матинімунопреципітації застосовували такі праймери: прямий — 5'-GCCCAGCCCTGT TCCTCAGTCCATAT-3', зворотний — 5'-GACGGAAAGTGTTGCTCTAAGT-3'. Ампліфікацію проводили в ампліфікаторі Iq5 (BioRad, США) у таких умовах: 94 °С — 15 с; 60 °С — 20 с (для кДНК EGR2 при 70 °С); 72 °С — 20 с; 45 циклів. Результати обробляли за допомогою програмного забезпечення фірми-виробника, а обчислення здійснювали за методом Delta-delta C(t) [18].
Результати та обговорення
ZXDC регулює експресію гена EGR2 на рівні транскрипції
Дослідження експресії гена транскрипційного фактора 2 ранніх змін росту EGR2 (early growth response 2) було проведено на двох лініях клітин: ембріональних епітеліальних клітинах нирки лінії HEK293 та клітинах лінії HL60, що являють собою про-мієлоцити, здатні диференціюватися до гранулоцитів під впливом 5'-трансретиноєвої кислоти та до моноцитів під впливом 12-O-тетрадеканоїлфорбол-13-ацетату, у зв’язку з чим вони є зручною модельною системою для вивчення диференціації клітин імунної системи. Вибір цих двох досить різних ліній клітин зумовлений тим, що в попередніх дослідженнях, які було проведено на клітинах лінії HEK293 за допомогою мікроарей-аналізу, встановлено, що ZXDC бере участь у регуляції транскрипції низки генів, зокрема EGR2, BDNF, CDKN1C, IL5Ra та NEUROD1, а також генів, які беруть участь у диференціації клітин імунної системи [4].
Рівень експресії мРНК EGR2 вивчали за допомогою кількісної ПЛР у клітинах ліній HEK293 та HL60 з надекспресією транскрипційного фактора ZXDC, які отримували шляхом трансфекції плазмідою pcDNA-3.1-ZXDC, як описано у розділі Матеріали і методи. Як контроль використовували клітини, трансфе-ковані плазмідою pCMV-SPORT6-^-gal, що експресує альфа-субодиницю в-галактозида-зи. Надекспресію ZXDC у трансфекованих плазмідою pcDNA-3.1-ZXDC клітинах ліній HEK293 та HL60 було перевірено за допомогою кількісної ПЛР (дані не наведено).
Результати проведених досліджень показали, що надекспресія транскрипційного фактора ZXDC зумовлювала підвищення
рівня експресії мРНК фактора EGR2 у 2,32 раза в ембріональних епітеліальних клітинах нирки лінії НЕК293 (рис. 1) і майже у 7 разів — у клітинах промієлоцитів лінії тв0 (рис. 2).
Отримані дані щодо експресії мРНК фактора EGR2 методом кількісної ПЛР узгоджуються з результатами попередніх досліджень, в яких експресію генів вивчали методом мікроарею та перевіряли ПЛР [4]. Підвищення експресії мРНК фактора EGR2 в ембріональних епітеліальних клітинах нирки лінії НЕК293, у яких не експресуються специфічні для клітин імунної системи транскрипційні фактори, свідчить про те, що за відсутності інших тканинно-специфічних факторів ZXDC здатен до прямої транскрипційної активації EGR2.
Той факт, що в клітинах промієлоцитів лінії Н1,60 під впливом надекспресії ZXDC підвищується рівень експресії мРНК фактора EGR2 значно більшою мірою, ніж в ембріональних епітеліальних клітинах нирки лінії HEK293, можливо пояснюється різним функціональним значенням даного транскрипційного фактора у цих двох лініях клітин. На це вказує і різний рівень експресії мРНК фактора EGR2 у контрольних клітинах нирки лінії HEK293 та в клітинах промієлоцитів лінії Н1,60 (дані не наведено). Низький базальний рівень експресії мРНК фактора EGR2 у клітинах нирки лінії HEK293 може свідчити про його меншу
функціональну роль у цих клітинах порівняно з мієлоїдними клітинами, де фактор EGR2 бере участь у регуляції мієлоїдної диференціації та в інших клітинних процесах. Те, що навіть у неспецифічних умовах та за відсутності мієлоїдспецифічних факторів надекспресія ZXDC призводить до підвищення рівня EGR2 у HEK293, свідчить про можливість прямої регуляції експресії мРНК фактора EGR2 транскрипційним фактором ZXDC шляхом його зв’язування з промоторною ділянкою гена EGR2.
Більш виражений рівень експресії мРНК фактора EGR2 у клітинах лінії HL60 імовірно зумовлений тим, що саме в цих клітинах він відіграє важливу роль під час диференціації, що забезпечується більш вираженою експресією в мієлоїдних клітинах факторів, які беруть участь у регуляції експресії фактора EGR2, а також у мієлоїдній диференціації, зокрема фактора Ри.1, хоча не виключаються й інші, більш тонкі механізми регуляції активності промотора EGR2 під час диференціації.
Надекспресія транскрипційного фактора ZXDC активує промотор EGR2 у складі репортерної плазміди
Щоб визначити, чи впливає транскрипційний фактор ZXDC на активність транскрипції з промотору гена EGR2, було створено репортерну плазміду, яка містила промоторну ділянку гена транскрипційного
300 т
Рис. 1. Вплив надекспресії гена транскрипційного фактора ZXDC на рівень експресії мРНК фактора 2 ранніх змін росту EGR2 в ембріональних клітинах нирки лінії НЕК293 порівняно з контрольними клітинами, трансфекованими плазмідою pCMV-SPORT6-P-gal, що містить кДНК альфа-субодиниці бета-галактозидази під контролем промотору CMV, як і ZXDC, за даними кількісної
полімеразної ланцюгової реакції.
Наведено результати трьох незалежних експериментів
фактора EGR2 від -341 до +134 у плазміді pGL3basic. Дослідження проводили на ембріональних епітеліальних клітинах нирки лінії HEK293, які трансфекували плазмі-дами pGL3basic та pcDNA3.1-ZXDC, а також репортерною конструкцією pGL3-EGR2-341, в яких потім вимірювали продукт експресії репортерної системи — активність люциферази. Як випливає з даних, поданих на рис. 3, надекспресія транскрипційного фактора ZXDC суттєво посилювала функціональну активність промотору гена фактора EGR2 у репортерній конструкції pGL3-EGR2-341, оскільки люциферазна активність збільшувалась під час надекспресії ZXDC майже вдвічі, а це свідчить про здатність транскрипційного фактора ZXDC до активації промотору гена EGR2 у модельній репортерній системі. Можна припустити, що транскрипційний фактор ZXDC здатен до прямої активації промотору гена EGR2, але разом з тим активація транскрипції гена фактора EGR2 in vivo очевидно відбувається у разі залучення до активаційного комплексу ряду інших факторів регуляції транскрипції і є більш складним процесом порівняно з репортерною системою.
Транскрипційний фактор ZXDC зв’язується з промотором гена EGR2 in vivo
Наведені вище дані досліджень експресії репортерної конструкції вказують на можливість транскрипційного фактора ZXDC контролювати транскрипцію з промотору ге-
на EGR2. Однак репортерна система не має природного хроматинового геномного контексту. У зв’язку з цим нами було проведено дослідження, метою яких було показати наявність зв’язування ендогенного ZXDC із промотором гена EGR2 in vivo за допомогою методу хроматинімунопреципітації.
Для цього клітини промієлоцитів лінії HL60 обробляли формальдегідом для «пришивання» усіх ДНК-зв’язувальних протеїнів до ДНК, потім виділяли ядра клітин, лізували їх та обробляли ультразвуком, щоб отримати фрагменти ДНК близько 250 пар нуклеотидних залишків. Лізати ядер клітин інкубували з антитілом до ZXDC чи з контрольними мишачими IgG. Імунні комплекси виділяли за допомогою мікрогранул зі зв’язаним протеїном G, промивали, руйнували зшиті з ДНК протеїни, обробляючи їх протеїназою, та виділяли отримані фрагменти ДНК. Одержану ДНК було проаналізовано за допомогою кількісної ПЛР у режимі реального часу із застосуванням праймерів до промоторної ділянки гена EGR2 та прай-мерів до ділянки, що розташована на відстані 4500 нуклеотидних залишків від місця ініціації транскрипції (неспецифічний контроль). Обчислення проводили за методом дельта-дельта C(t), порівнювали рівень збагачення преципітованого хроматину фрагментами промотору EGR2, використовуючи антитіла до ZXDC та контрольних неспецифічних антитіл. Результати цих досліджень наведено на рис. 4. Вони переконливо свід-
1000 1
P-gal ZXDC
Рис. 2. Вплив надекспресії гена транскрипційного фактора ZXDC на рівень експресії мРНК фактора EGR2 в культурі промієлоцитів лінії НЬ60 порівняно з контрольними клітинами, трансфекованими плазмідою pCMV-SPORT6-P-gal, за даними кількісної полімеразної ланцюгової реакції.
Наведено результати трьох незалежних експериментів
чать про те, що транскрипційний фактор ZXDC може зв’язуватися з промотором гена EGR2 in vivo, оскільки його присутність на промоторі цього гена у недиференційованих клітинах промієлоцитів лінії HL60 виявлено за допомогою методу хроматинімунопреципітації.
Відомо, що транскрипційний фактор бере участь у диференціації гематопое-тичних клітин, пригнічуючи експресію генів, які відповідають за диференціацію мієлоїдних клітин-попередників у гранулоцити та активуючи ті гени, що беруть участь у диференціації гематопоетичних клітин у моноцити [12, 13]. Так, у недиференційо-ваних клітинах промієлоцитів лінії HL60 ген EGR2 експресується на дуже низькому рівні, але в разі диференціації їх у гранулоцити під впливом 5'-трансретиноєвої кислоти рівень експресії цього гена зростає в 4 рази. Водночас, при диференціації у моноцити за допомогою 12-0-тетрадеканоїлфорбол-13-ацетату рівень експресії гена EGR2 зростає майже у 6 000 разів.
Отже, здатність транскрипційного фактора ZXDC до підвищення експресії гена EGR2 і той факт, що в недиференційованих клітинах промієлоцитів ZXDC присутній на промоторній ділянці гена EGR2, свідчить про можливу участь ZXDC у регуляції на-
прямку диференціації клітин лінії HL60 шляхом модуляції експресії гена EGR2 на рівні транскрипції.
Таким чином, встановлено, що надек-спресія транскрипційного фактора ZXDC посилює експресію гена фактора 2 ранніх змін росту EGR2 в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293 значно меншою мірою, ніж у культурі промієлоцитів лінії HL60, що вказує на тканинно-специфічний характер цих змін.
Показано, що в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293 з надекспресією транскрипційного фактора ZXDC істотно посилюється експресія люциферази репортерною конструкцією pGL-EGR2-341, яка містила промоторну ділянку гена EGR2 від -341 до + 134, що вказує на активацію транскрипції ізольованого промотору гена EGR2 за посиленої експресії гена ZXDC.
Стимулювальний ефект надекспресії транскрипційного фактора ZXDC на транскрипцію гена EGR2 у клітинах промієло-цитів лінії HL60 зумовлений зв’язуванням транскрипційного фактора ZXDC з промо-торною зоною гена EGR2, про що свідчать дані хроматинімунопреципітації.
20(1
ß-gal~~ ZXDC ' ß-gal ZXDC
pGL3-EGR2-341 pGL3basic
Рис. З. Вплив надекспресії гена транскрипційного фактора ZXDC на рівень експресії люциферази репортерною конструкцією pGL-EGR2-341, яка містила промоторну ділянку гена EGR2 від —341 до +134 у плазміді pGL3basic в ембріональних клітинах нирки лінії HEK293 з надекспресією гена транскрипційного фактора ZXDC порівняно з контрольними клітинами, трансфекованими
плазмідою pCMV-SPORT6-ß-gal.
Наведено результати трьох незалежних експериментів
250
анти-ZXDC Ig G
Рис. 4. Інтенсивність зв'язування транскрипційного фактора ZXDC з промотором гена EGR2 у клітинах промієлоцитів лінії HL60 за даними хроматинімунопреципітації фактора ZXDC із лізатів цих клітин з використанням антитіл до ZXDC порівняно з контрольними IgG.
Наведено результати трьох незалежних експериментів
ЛІТЕРАТУРА
1. Al-Kandari W., Jambunathan S., Navalgund V. et al. ZXDC, a novel zinc finger protein that binds CIITA and activates MHC gene transcription // Mol. Immunol. — 2007. — V. 44, N 4. — P. 311-321.
2. Al-Kandari W, Koneni R., Navalgund V. et al. The zinc finger proteins ZXDA and ZXDC form a complex that binds CIITA and regulates MHC II gene transcription // J. Mol. Biol. —
2007. — V. 369, N 5. — P. 1175-1187.
3. Aleksandrova A., Galkin O., Koneni R, Fontes J. An N- and C-terminal truncated isoform of zinc finger X-linked duplicated C protein represses MHC class II transcription // Mol. Cell. Biochem. — 2010. — V. 337, N 1-2. — P. 1-7.
4. Галкін О. В., Мінченко О. Г. Зміни в експресії генів, зумовлені надекспресією транскрипційного фактора ZXDC у ембріональних клітинах нирки лінії HEK293 // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 1. — C. 100-107.
5. Joseph L., Le Beau M., Jamieson G. et al. Molecular cloning, sequencing, and mapping of EGR2, a human early growth response gene encoding a protein with «zinc-binding finger» structure // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1988. — V. 85. — P. 7164-7168.
6. Vesque C., Charnay P. Mapping functional regions of the segment-specific transcription factor Krox-20 // Nucl. Acid. Res. — 1992. — V. 20. — P. 2485-2492.
7. Topilko P., Schneider-Maunoury S., Levi G. et al. Krox-20 controls myelination in the peripheral nervous system // Nature. — 1994. — V. 371. — P. 796-799.
8. Zorick T., Syroid D., Arroyo E. et al. The transcription factors SCIP and Krox-20 mark distinct stages and cell fates in Schwann cell differentiation // Mol. Cell. Neurosci. — 1996. — V. 8. — P. 129-145.
9. Chen Z., Torrens J., Anand A. et al. Krox20 stimulates adipogenesis via C/EBPbeta-
dependent and -independent mechanisms // Cell. Metab. — 2005. — V. 1. — P. 93-106.
10. Bradley E, Ruan M., Oursler M. Novel prosurvival functions of the Kruppel-like transcription factor Egr2 in promotion of macrophage colony-stimulating factor-mediated osteoclast survival downstream of the MEK/ERK pathway // J. Biol. Chem. —
2008. — V. 283. — P. 8055-8064.
11. Lauritsen J., Kurella S., Lee S. et al. Egr2 is required for Bcl-2 induction during positive selection // J. Immunol. — 2008. — V. 181. — P. 7778-7785.
12. Kharbanda S., Nakamura T., Stone R. et al. Expression of the early growth response 1 and 2 zinc finger genes during induction of monocytic differentiation // J. Clin. Invest. — 1991. — V. 88. — P. 571-577.
13. Rangnekar V., Aplin A., Sukhatme V. The serum and TPA responsive promoter and intron-exon structure of EGR2, a human early growth response gene encoding a zinc finger protein // Nucl. Acid. Res. — 1990. — V. 18. — 2749-2757.
14. Laslo P., Spooner C., Warmflash A. et al. Multilineage transcriptional priming and determination of alternate hematopoietic cell fates // Cell. — 2006. — V. 126. — P. 755-766.
15. Krysinska H, Hoogenkamp M, Ingram R. et al. A two-step, PU. 1-dependent mechanism for developmentally regulated chromatin remodeling and transcription of the c-fms gene // Mol. Cell. Biol. — 2007. — V. 27. — P. 878-887.
16. Friedman A. Transcriptional control of granulocyte and monocyte development // Oncogene. — 2007. — V. 26. — P. 6816-6828.
17. Winnay J., Hammer G. Adrenocorticotropic hormone-mediated signaling cascades coordinate a cyclic pattern of steroidogenic factor 1-dependent transcriptional activation // Mol. Endocrinol. — 2006. — V. 20. — P. 147-166.
18. Pfaffl M. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR // Nucl. Acid. Res. — 2001. — V. 29. — P. E45.
АКТИВАЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНА ЕОИ2 В ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ СО СВЕРХЭКСПРЕССИЕЙ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА 7ХБС
А. В.Галкин12 А. Г. Минченко3
Университет медицинского центра Канзаса, г. Канзас, США 2Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко 3Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев
E-mail: [email protected]
Транскрипционный фактор ZXDC принимает участие в регуляции экспрессии гена MHCII у эукариот. Ранее с помощью микроар-рей-анализа и полимеразной цепной реакции было установлено, что сверхэкспрессия фактора ZXDC в эмбриональных клетках почки линии HEK293 приводит к повышению уровня экспрессии ряда других генов, в частности BDNF, CDKN1C, IL5Ra и EGR2. В данном исследовании с использованием количественной полимеразной цепной реакции было определено, что уровень экспрессии мРНК EGR2 повышается в 2,3 раза в эмбриональных клетках почки линии HEK293 и почти в 7 раз — в культуре промиелоцитов линии HL60 с усиленной экспрессией транскрипционного фактора ZXDC. Для выяснения механизмов увеличения уровня экспрессии гена EGR2 мы клонировали промоторную область гена EGR2 (от -341 до +134) в репортерную плазмиду pGL3basic с экспрессией люциферазы. Установлено, что при котрансфекции клеток линии HEK293 плазмидными конструкциями pGL-EGR2-341 и pcDNA3.1-ZXDC экспрессия люциферазы в этих клетках увеличивалась почти в 2 раза. Кроме того, с использованием хроматиниммунопреципитации было показано, что транскрипционный фактор ZXDC связывается с промоторной областью гена EGR2 в клетках промиелоцитов линии HL60 in vivo. Полученные данные свидетельствуют о том, что транскрипционный фактор ZXDC принимает участие в регуляции транскрипции гена EGR2, связываясь с его промоторной областью.
Ключевые слова: транскрипционные факторы, ZXDC, EGR2, сверхэкспрессия гена, регуляция транскрипции, клетки промиелоцитов HL60, клетки почки HEK293.
ACTIVATION OF EGR2 GENE TRANSCRIPTION IN GENETICALLY MODIFIED CELLS WITH OVER EXPRESSION OF TRANSCRIPTION FACTOR ZXDC
O. V. Galkin12 O. H. Minchenko3
University of Kansas Medical Center, Kansas City, Kansas, USA 2Kyiv Taras Shevchenko National University 3Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv
E-mail: [email protected]
Transcription factor ZXDC participates in the regulation of MHCII gene expression in eukaryotes. Recently, using micro array and polymerase chain reaction assays, it was shown that overexpression of factor ZXDC in embryonic kidney cell line HEK293 enhances the expression of many genes, among them BDNF, CDKN1C, IL5Ra and EGR2. In this investigation, using quantitative polymerase chain reaction, it was shown that EGR2 mRNA expression is increased 2.3 times in embryonic kidney cell line HEK293 and almost 7 times in culture of myelocytes HL60 line which overexpress transcription factor ZXDC. In order to understand the induction mechanism of EGR2 gene expression, we cloned the promoter region of EGR2 gene (from -341 to +134) into a pGL3basic reporter plasmid with luciferase expression. It was determined that during co-transfection of HEK293 cell line with pGL-EGR2-341 and pcDNA3.1-ZXDC plasmid constructs, the expression of luciferase increased almost twice. Moreover, using chromatin immune precipitation assay, it was shown that the transcription factor ZXDC binds with the promoter region of EGR2 gene in promyelo-cytic leukemia cell line HL60 in vivo. The obtained data show that the transcription factor ZXDC regulates EGR2 gene transcription by binding with its promoter region.
Key words: transcription factors, ZXDC, EGR2, gene overexpression, transcription regulation, promyelocytic cells HL60, kidney cells HEK293.
