CC BY
45Фізика живого, Т. 1S, No 1, 2010. С. 95-103. © Галкін О.В., Мінченко О.Г.
УДК 577.112.7:616
ТРАНСКРИПЦІЙНИЙ ФАКТОР ZXDC ПРИЙМАЄ УЧАСТЬ У РЕГУЛЯЦІЇ ПРОЦЕСІВ МІЄЛОЇДНОЇ ДИФЕРЕНЦІАЦІЇ
1,2Галкін О.В., 3Мінченко О.Г.
1 Університет медичного центру Канзасу, м. Канзас, США;
2Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ;
3Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна Національної академії наук України, Київ; e-mail: [email protected], [email protected]
Надійшла до редакції 13.02.2010
Транскрипційний фактор еукаріот 2Х0С приймає участь у регуляції експресії генів МНСІІ, ВБОТ, СБКШС та ІЬ5Яа, а також контролює транскрипцію гена ЕОЯ2, зв’язуючись з його промотором. У даному дослідженні встановлено, що надекспресія транскрипційного фактора 2X00 в клітинах промієлоцитів НЬ60 призводить до підвищення рівня експресії генів С/ЕВРа, СБ14, С011Ь та ЬЯОІ, але фактор 2X00 не активує промотор гена С/ЕВРа у складі люциферазної репортерної плазміди. При надекспресії факторів ОИІ, С/ЕВРа, С/ЕВРє та РШ у клітинах НЬ60 спостерігалась транскрипційна репресія гена 2Х0С. Отримані дані свідчать про те, що 2ХБС може брати участь у регуляції диференціації гематопоетичних клітин, регулюючи експресію інших факторів диференціації.
Ключові слова: 2Х0С, С/ЕВРа, СБ14, ОИІ, клітини НЬ60, регуляція транскрипції.
ВСТУП
ZXDC (zinc finger X- linked duplicated family member C) - фактор транскрипції еукаріот, що належить до родини ZXD білків. Разом з іншими членами ZXD родини, ZXDA, ZXDC2, та фактором транскрипції CIITa, ZXDC утворює комплекс, що зв’язується з промотором гена головного комплексу гістосумісності MHCII (major histocompatibility complex class II) та активує його транскрипцію [1-3].
Було показано також, що транскрипційний фактор ZXDC може брати участь у регуляції експресії деяких інших генів. За допомогою мікроарей аналізу встановлено, що надекспресія ZXDC в клітинах HEK293 призводить до підвищення рівня транскрипції генів фактора 2 ранніх змін росту EGR2 (early growth response 2), отриманого з мозку нейротропного фактора BDNF (brain-derived neurotrophic factor), інгібітору 1С циклін-залежної кінази CDKN1C (cyclin-dependent kinase inhibitor 1C), альфа рецептора інтерлейкіну 5 IL5Ra (interleukin 5 receptor, а) та інших, що беруть участь у регуляції клітинного циклу, міжклітинних взаємодій, дозріванні
і диференціації нервових клітин та клітин імунної системи [4]. Надекспресія фактора ZXDC призводила до більш сильного підвищення рівня експресії EGR2 у клітинах промієлоцитів лінії HL60 у порівнянні з клітинами лінії HEK293, що свідчить про можливу функціональну роль транскрипційного фактора ZXDC у диференціації клітин мієлоїдного ряду. Також було показано, що фактор ZXDC зв'язується з промотором EGR2, клонованим у репортерну плазміду, та активує
його. За допомогою імунопреципітації хроматину була виявлена здатність транскрипційного фактора ZXDC зв'язуватись in vivo з промотором гена EGR2 в клітинах HL60 та брати участь у регуляції його транскрипції [5].
Відомо, що ген EGR2 задіяний у диференціації клітин імунної системи мієлоїдного ряду і бере участь у регуляції диференціації мієлоїдних попередників у моноцити [б]. Також встановлено, що за надекспресії фактора ZXDC підвищується рівень експресії гена IL5Ra, що бере участь у диференціації еозинофілів [У]. Крім того, було виявлено високі рівні експресії ZXDC у гранулоцитах та у стовбурових клітинах кісткового мозку. Ці факти свідчать про те, що фактор ZXDC може брати участь у транскрипційній регуляції гематопоезу та диференціації клітин-попередників.
Диференціація клітин імунної системи контролюється через посередництво деяких факторів транскрипції, кожний з яких регулює експресію пулу інших регуляторних та структурних генів, що в свою чергу опосередковують запуск та виконання специфічних для даної клітинної субпопуляції програм диференціації [9]. Експресія кожного з цих факторів запускається в певний момент часу і підтримується на певному рівні. Рівень їх експресії в клітині та взаємодія між ними є ключовими чинниками, що визначають майбутнє клітин під час диференціації. Деякі фактори є специфічними лише для певних субпопуляцій клітин і виконують свою функцію лише в певний момент, інші можуть працювати на різних етапах розвитку клітин і рівень їх експресії може змінюватись у широких межах.
Згідно з сучасною моделлю диференціації клітин імунної системи, головними факторами, що опосередковують диференціацію клітин мієлоїдної гілки є PU.1, CCAAT/енхансер зв’язуючі білки C/EBPa та C/EBPe і головний фактор гранулопоезу GFI1 [10]. Відомо, що PU.1 є продуктом гена SPI1, належить до родини ETS факторів транскрипції та експресується в мієлоїдних попередниках і у зрілих мієлоїдних клітинах [11]. Визначальна роль цього фактора у транскрипційній регуляції диференціації мієлоїдних та лімфоїдних клітин опосередковується наявністю PU.1-зв’язуючих послідовностей у регуляторних ділянках більшості мієлоїд-специфічних та частини лімфоїд-специфічних генів. Рівень експресії PU.1 зростає під час монопоезу, виходячи на високий рівень у диференційованих моноцитах, і спадає при диференціації у напрямку еритроїдної та Т-клітинної гілки [12]. У мишей, нокаутних по гена PU.1, не розвиваються моноцити та значно знижується рівень нейтрофілів.
Протягом деякого часу вважалось, що PU. 1 є головним чинником монопоезу, стимулюючи диференціацію CMP (загальні мієлоїдні попередники) у GMP (попередники гранулоцитів/моноцитів) та подальшу диференціацію, але останні дані свідчать, що PU.1 також бере участь у регуляції гранулопоезу, а також на ранніх етапах диференціації мультіпотентних попередників (MPP) у CMP, сприяючи мієлоїдній диференціації і пригнічуючи лімфоїдну. Так, надекспресія PU.1 у плюрипотентних клітинних лініях на низькому рівні призводить до гранулопоезу, а надекспресія на високому рівні - до монопоезу [13]. Крім того, встановлено, що надекспресія PU.1 у В та Т клітинах призводить до їх конверсії у макрофаги.
Аналіз генів, що регулюються через посередництво PU.1, показав, що гени EGR1 та EGR2 активуються за допомогою PU. 1 і сприяють монопоезу на пізніх стадіях диференціації гранулоцитів, що утворюють колонії (CFU-M) у моноцити, в той же час пригнічуючи гени, задіяні в гранулопоезі [14]. EGR фактори містять цинкові пальці, за допомогою яких зв'язуються з промоторами цільових генів. Виключення функції гена EGR2 у мієлоїдних клітинних лініях призводить до індукції генів, специфічних для нейтрофілів, таких як GFI1, а також було показано, що EGR2 здатний до репресії промотору GFI1, інгібуючи гранулопоез.
Таким чином, рівень експресії PU.1 і його взаємодія з іншими факторами є визначальним чинником напрямку диференціації мієлоїдних та лімфоїдних попередників.
C/EBPa та C/EBPe належать до родини CCAAT/енхансер зв’язуючих білків, Фактори C/EBP здатні димеризуватися через посередництво С-кінцевих доменів та зв’язуватися з ДНК промоторних ділянок цільових генів, регулюючи рівень їх транскрипції. C/EBPa експресується на ранніх етапах диференціації стовбурових клітин у мієлоїдних попередниках, а під час гранулопоезу рівень його
експресії суттєво підвищується. Недавно було показано, що у мишей, нокаутних по гену C/EBPa, не розвиваються нейтрофіли та еозинофіли і що C/EBPa регулює експресію багатьох генів, задіяних у мієлоїдній диференціації, зокрема таких як гени рецепторів M- і G-фактора, що стимулює колонії (M-CSF і G-CSF), фактора GFI1 та генів мієло-пероксидази і еластази, але останні є специфічними для зрілих клітин, нейтрофілів [15]. C/EBPa також активно задіяний у гранулопоезі на стадії диференціації GMP (1б), регулюючи транскрипцію генів miR223 та c-myc.
Разом з фактором PU.1 C/EBPa бере участь у виборі між гранулоцитарним та моноцитарним напрямками диференціації. Так, на ранніх стадіях диференціації C/EBPa активує промотор PU.1, сприяючи диференціації СМР у GMP попередники [17]. На більш пізніх етапах баланс рівнів експресії PU.1 та C/EBPa визначає вибір між моноцитарною та гранулоцитарною диференціацією, оскільки C/EBPa здатен зв’язуватися з PU.1 та блокувати його функцію на рівні білок-білкових взаємодій та взаємодій з ДНК [18].
Відомо, що C/EBPe експресується у гранулоцитах на пізніх стадіях диференціації, рівень його експресії є визначальним для диференціації еозинофілів [19].
Транскрипційний регулятор GFI1 є одним із найважливіших факторів мієлоїдної диференціації, оскільки він здатний до репресії транскрипції цілого ряду генів, включаючи EGR2, PU.1 та C/EBPa [14]. Він експресується у мієлоїдних попередниках, нейтрофілах та ранніх Т і В клітинах і відсутній у гранулоцитарних клітинах. У мишей, нокаутних по гену GFI1, не виявляються нейтрофіли і спостерігаються аномально високі рівні експресії моноцитарних генів у інших мієлоїдних попередниках [20]. Транскрипційний фактор GFI1 відіграє важливу роль у підтриманні гранулоцитарного напрямку диференціації CFU-G, репресуючи гени, задіяні у монопоезу, у попередниках гранулоцитів/моноцитів.
Метою даного дослідження було встановити, чи може транскрипційний фактор ZXDC приймати участь у регуляції гематопоезу у клітинах промієлоцитів лінії HL60 з надекспресією ZXDC на рівні експресії генів, що контролюють протікання гематопоезу, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу, вимірюючи рівень експресії генів, що задіяні на різних етапах і ключових напрямках диференціації мієлоїдних клітин (GFI1, PU.1, C/EBPa і C/EBPe), та маркерних генів, що експресуються у диференційованих клітинах (CDllb, CD14, LRG1 і MBP).
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Клітини. В роботі було використано клітини промієлоцитів лінії HL60.
Плазміди. Для трансфекції клітин промієлоцитів HL60 було використано плазміди pcDNA3.1-ZXDC та pCMV-SPORT6-P-gal, описані раніше [1].
Плазміди рсБКА3.1-6хНІ8-С/ЕВРа та рсБКА3.1-6хНІ8-С/ЕВРє було отримано шляхом клонування кДНК С/ЕВРа та С/ЕВРє у плазміду рсБКА3.1-6хНІ8, що була раніше створена у лабораторії Бг. Ро^е8. кДНК С/ЕВРа було отримано за допомогою полімеразної ланцюгової реакції кДНК клітин лінії НЬ60 з використанням праймерів 5’-АААААОААТТСАТСССОООАОААСТСТААСТС -З’- та 5’- АААААТ СТ АвАСТ СвСАСООСТ Св
ввСААв -3’, проведено рестрикцію продукту полімеразної ланцюгової реакції і вектора по сайтам рестрикції ЕсоЫ та ХЬаІ, продукти рестрикції було виділено та проведено лігазну реакцію. кДНК С/ЕВРє було отримано з використанням праймерів 5’-АААААООАТСССАТОТСССАСОООАССТАСТАСО -З’ А та 5’- АААААвААТТ СвТ вСССАСА АТССАССАвССАвССТС -3’, проведено рестрикцію продукту полімеразної ланцюгової реакції і вектора по сайтам рестрикції ЕсоЫ та ВатНІ, продукти рестрикції було виділено та проведено лігазну реакцію.
Плазміди рсБКА3.1 -Мус-вБІІ та рсБКА3.1 -Мус-Ри.І були створені раніше у лабораторії Бг. РоШ:е8.
Плазміду рвЬ-С/ЕВРа-рг було отримано шляхом клонування промоторної ділянки гена С/ЕВРа -263:-2 у репортерну плазміду рвЬ3Ьа8Іс. Промоторну ділянку було ампліфіковано з допомогою полімеразної ланцюгової реакції з використанням праймерів 5’- АААААОСТАОССОСГСОТТСОС СвССССАТ -3’ та 5’- АААААААвСТТвввАв ТТАвАОТТСТСССв -3’, проведено рестрикцію продукту полімеразної ланцюгової реакції і вектора по сайтам рестрикції КЬеІ та НІМІІІ, продукти рестрикції було виділено та проведено лігазну реакцію.
Трансфекція. Клітини промієлоцитів лінії НЬ60 було посіяно у 10 см плашку у кількості 0.25х106 на лунку у 10 мл поживного середовища ИРМІ-1640 (Се11§го) з додаванням 4 тМ глутаміну та 10% бичачої сироватки. Культуру клітин інкубували при 37 °С в атмосфері з 5% СО2 протягом 48 годин. Далі клітини центрифугували, рахували та ресуспендували у поживному середовищі до щільності 1х107/мл. 0.5 мл клітинної суспензії переносили в кювети для електропорації, додавали 40 плазмідної ДНК рсБКА3.1-2ХБС чи рСМУ-8РОЯТ6-р-§а1.
Електропорацію проводили за допомогою електропоратора ВІоИ^ при характеристиках імпульсу 240 В, 960 мкФ. Трансфековані клітини інкубували при 4 °С протягом 30 хв, переносили в поживне середовище КРМІ-1640 з додаванням 4 тМ глутаміну та 20% бичачої сироватки та інкубували при 37 °С в атмосфері з 5% СО2 протягом 48 годин.
Виділення РНК. Тотальну РНК з клітин виділяли за допомогою реагенту Tгizol (Іпуіїго§еп). Культури клітин осаджували центрифугуванням, клітинний осад розчиняли у 1 мл Tгizol, додавали 200 мл хлороформу, перемішували та центрифугували при 16600 § та +4 °С протягом 15 хв. Відбирали 350 мл супернатанту, змішували з 350 мл ізопропанолу,
додавали 5 мг лінійного акриламіду, інкубували протягом 20 хв. при -20 °С та центрифугували при 16600 g та +4 °С протягом 20 хв. До отриманого осаду РНК приливали б00 мл 70% етанолу для відмивки залишків ізопропанолу та центрифугували при 16600 g та +4 °С протягом 5 хв. Далі видаляли супернатант, інкубували пробірки відкритими при кімнатній температурі протягом 2 хв., та розчиняли висушений осад РНК у стерильній воді, вільній від домішок нуклеїнових кислот та нуклеаз (BioRad).
Зворотна транскрипція та полімеразна ланцюгова реакція у режимі реального часу.
Виділену тотальну РНК було використано для реакції зворотної транскрипції за допомогою Quantitect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Німеччина), відповідно протоколу виробника, використовуючи оліго^Т праймер. Для реакції зворотної транскрипції брали 1 мг РНК.
Далі кДНК (чи ДНК, отримана після хроматин-імунопреципітації) була ампліфікована у полімеразній ланцюговій реакції. Для реакції брали 8.2 мл води, вільної від нуклеаз, 1 мл кДНК, 0.8 мл 10 мM суміші праймерів та 10 мл двократної реакційної суміші для полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу (Fermentas).
Послідовності праймерів, що було використано для полімеразної ланцюгової реакції:
Для детекції кДНК C/EBPa: прямий 5’-
CAAGAAGTCGGTGGACAAGAACA -3’; зворотний 5’- CTGGCTCGCACGGCTCGGGCAAG -3’. Ефективність для даної пари праймерів становила 2.
Для детекції кДНК C/EBPe: прямий 5’-
ATCTCTTTGCCGTGAAGCCAG -3’; зворотний 5’-GCCGAAGGTATGTGGAGGGTA -3’. Ефективність для даної пари праймерів становила 2.
Для детекції кДНК CD 11b: прямий 5’-
GAT AGT GAC ATT GCCTT CTT GATT GAT -3’;
зворотний 5’- AGACAAACTCCTTCATCCGCCG AAAGT -3’. Ефективність для даної пари праймерів становила 1.94.
Для детекції кДНК CD 14: прямий 5’-
TCGT GGGCGAC AGGGCGT -3’; зворотний 5’-GGAACTTGTGGGGACAGAGAG -3’. Ефективність для даної пари праймерів становила 2.
Для детекції кДНК GAPDH: прямий 5’-
ATCACTGCCACCCAGAAGACT -3’; зворотний 5’-GAT GACCTT GCCCACAGCCTT -3’. Ефективність для даної пари праймерів становила 1.91.
Для детекції кДНК GFI1: прямий 5’-
TGGGCGGCGGCTCCTACAAGTG -3’; зворотний 5’-GGCTTTGTGCTGCTCCAGGCTC -3’. Ефективність для даної пари праймерів становила 2.
Для детекції кДНК LRG1: прямий 5’-
CCTCTTGGAGCAGACAGCGAC -3’; зворотний 5’-CCTCTTGGAGCAGACAGCGAC -3’. Ефективність для даної пари праймерів становила 1.95.
Для детекції кДНК MBP: прямий 5’-
CTCCCCTTACTTCTGGCTCTTCTA -3’; зворотний 5’-CT CT GGT GTCTCCT CAT CCT CA -3’. Ефективність для даної пари праймерів становила 1.89.
Для детекції кДНК PU.1: прямий 5’-
AGGTGTCTGACGGCGAGGCGGATG -3’; зворотний 5’- GCGGAGCAGGTCCAACAGGAACTG -3’. Ефективність для даної пари праймерів становила 1.85.
Для детекції кДНК ZXDC: прямий 5’-
CAGCAAGAACTGATTACCGAGC -3’; зворотний 5’-GCATGGAAATGGGGAGGACTCA -3’. Ефективність для даної пари праймерів становила 1.84.
Ампліфікацію проводили у наступних умовах: 94 “С - 15 с; 60 “С - 20 с; 72 “С - 20 с; 45 циклів. Для праймерів до кДНК PU.1 та GFI1 гібридизацію проводили при 67 “С, для C/EBPa - при 65 “С, для C/EBPe - при 63 “С.
Реакцію проводили за допомогою ампліфікатора Iq5 (BioRad), результати обробляли за допомогою програмного забезпечення фірми-виробника.
Обчислення проводили за методом Delta-delta C(t) [8].
Люциферазний аналіз. Клітини HEK293 було посіяно в 24-лункову плашку у кількості 1х105 на лунку у 1 мл поживного середовища RPMI-1640 (Cellgro) з 4 mM глутаміну та 10% бичачої сироватки. Культури клітин інкубували при 37 “С в атмосфері з 5% СО2 протягом 24 годин. Використовуючи стерильні полістиренові пробірки, до 400 мл
середовища Optimem (Gibco) додавали 1 мг ДНК та
2 мл TurboFect, інкубували протягом 20 хв. при кімнатній температурі та додавали до культури клітин.
Для трансфекції було використано суміш плазмід:
1) pRLdCMV (0.025 ^g), pGL-C/EBPd-pr (0.2 ^g) та pCMV-SPORT6-b-gal (0.8 ^g)
2) pRLdCMV (0.025 ^g), pGL-C/EBPd-pr (0.2 ^g), pcDNA3.1-ZXDC (0.3 ^g ) та pCMV-SPORT6-b-gal (05 ^g)
3) pRLdCMV (0.025 ^g), pGL3basic (0.2 ^g) та pCMV-SPORT6-b-gal (0.8 ^g)
4) pRLdCMV (0.025 ^g), pGL3basic (0.2 ^g), pcDNA3.1-ZXDC (0.3 ^g ) та pCMV-SPORT6-b-gal (05 ^g)
Трансфековані клітини інкубували протягом 48 годин при 37 “С в атмосфері з 5% СО2. Далі проводили люциферазний аналіз з використанням Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega, США) відповідно до протоколу виробника. Для вимірювання люциферазної активності Renilla та Firefly брали 5 мл лізату, вимірювання проводили за допомогою люменометра моделі 20/20 виробництва Turner Biosystems. Сигнал вираховували як відношення активності люциферазної активності Renilla до Firefly.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Оскільки отримані раніше дані свідчать про те, що транскрипційний фактор ZXDC може впливати на рівень експресії генів EGR2 та IL5Ra, що беруть
участь у процесах диференціації, нашою метою було встановити чи надекспресія ZXDC також може впливати на рівень експресії головних регуляторів диференціації, а саме генів PU.1, C/EBPa, C/EBPe та GFI1. Щоб оцінити загальний вплив надекспресії ZXDC на клітини HL60, визначали також зміни експресії маркерів диференціації, характерних для зрілих та спеціалізованих клітин, а саме CDllb, загального маркера мієлоїдних клітин, CD14 специфічного для моноцитів та макрофагів, LRG, специфічного для нейтрофілів, та MBP1, маркера еозинофілів.
Надекспресія ZXDC в клітинах HL60 призводить до підвищення рівня експресії генів C/EBPa, CD14, CD11b, LRG1.
Для експерименту було використано промієлоїдну лінію клітин HL60. Клітини HL60 було трансфековано плазмідою pCMV-SPORT6-P-gal, що містить заклоновану a-субодиницю Р-галактозидази, чи плазмідою pcDNA-3.1-ZXDC. Надекспресію фактора ZXDC у клітинах було перевірено за допомогою полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу. Для визначення зміни рівня експресії цільових генів було використано дані трьох незалежних експериментів.
Згідно з отриманими даними, рівень експресії C/EBPa зріс у 5.74 разів, CDllb - у 4.33 разів, CD14 -у 6.9 разів, LRG1 - у 2.3 разів (рис. 1). Рівень експресії інших генів суттєвим чином не змінювався.
Підвищення рівня експресії CDllb є загальним свідченням того, що надекспресія фактора ZXDC активувала програми диференціації, характерні для мієлоїдних клітин, причому рівень CDllb підвищується при диференціації клітин HL60 як у гранулоцити, так і у моноцити.
Підвищення рівня експресії маркерних генів C/EBPa та LRG1 відповідає зміні загального профілю експресії генів у напрямку гранулоцитарної диференціації. З іншої сторони, підвищення рівня CD14 та, як було показано раніше, EGR2, свідчить про те, що клітини після надекспресії ZXDC набули ознак, характерних для моноцитів.
Таким чином, зміни профілю експресії генів у клітинах HL60 після надекспресії транскрипційного фактора ZXDC безумовно свідчать про його участь у генній регуляції диференціації клітин мієлоїдної гілки. Фактор C/EBPa задіяний на різних етапах гематопоезу, включаючи самооновлення стовбурових клітин, диференціацію GMP, CFU-G та CFU-M, так що для встановлення функціонального значення впливу фактора ZXDC на експресію гена C/EBPa необхідні додаткові експерименти на клітинних лініях, що моделюють кожний етап диференціації окремо.
Рис. 1. Рівень експресії мРНК C/EBPa, C/EBPє, CD14, CD11b, LRG1, MBP, PU.1, GFI1 (A) в клітинах ИЬ60 з надекспресією ZXDC за допомогою кількісної полімеразної ланцюгової реакції. Клітини ИЬ60 було трансфековано плазмідою pcDNA3.1-ZXDC або контрольною плазмідою pCMV-SPORT6-P-gаl, що містить кДНК ZXDC або бета-галактозидази під контролем промотору CMV.
Рис. 2. Вплив ZXDC на активність промотору C/EBPa у люциферазній репортерній системі в клітинах HL60, які було трансфековано плазмідою з промотором гена C/EBPa (pGL-C/EBPa-pr) та геном люциферази Renilla або контрольною плазмідою pGL3basic з геном люциферази Renilla без промотору. Клітини HL60 було трансфековано також плазмідою pcDNA3.1-ZXDC або контрольною плазмідою pCMV-SPORT6-P-gal, що містить кДНК ZXDC або бета-галактозидази під контролем промотору CMV, а також плазмідою pRL-dCMV, що містить кДНК люциферази Firefly без промотору. Показники люциферазної активності Renilla нормалізували по даним люциферазної активності Firefly.
1,4
1,2
1
0,8 0,6
(3-даІ ЄРИ С/ЕРВа С/ЕРВє РІІ.1
Рис. 3. Вплив надекспресії факторів ОИ1, С/ЕВРа, С/ЕВРє, РИ1 в клітинах ИЬ60, трансфекованих плазмідами рсОКЛ3.1-Мус-ОИІ, рсБЫЛ3.1-Ыус-Ри.1, рсБ1ЧЛ3.1-6Иі8-С/ЕВРа, рсБ]ЧЛ3.1-6Иі8-С/ЕВРє та рСМУ-8РОЯТ6-Р^а1 (контроль), на рівень експресії 2ХБС за даними кількісної полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі.
Рис. 4. Схема транскрипційної регуляції гематопоезу з урахуванням можливої участі 2X00. Позначення: ЬТ-И8С - довго живучі попередники гематопоетичних стовбурових клітин, 8Т-И8С - коротко живучі попередники гематопоетичних стовбурових клітин, МРР - мультіпопентні попередники, МЕР - мегакаріоцито-еритроїдні попередники, СЬР - спільні лімфоїдні попередники, ОМР - попередники гранулоцитів/моноцитів, СРЦ-М - макрофаги, що утворюють колонії, СРИ-О -гранулоцити, що утворюють колонії.
lGl
При надекспресії транскрипційного фактора ZXDC спостерігається підвищення експресії регуляторних та структурних генів, що експресуються як гранулоцитами, так і моноцитами у процесі їх диференціації. Можливо, що фактор ZXDC може брати участь в обох процесах і його надекспресія призводить до одночасної часткової активації обох програм диференціації GMP.
ZXDC не здатний до прямої регуляції клонованого промотору C/EBPa у люциферазній репортерній системі.
Підвищення рівня експресії гена C/EBPa може свідчити про те, що фактор ZXDC регулює його експресію прямо, зв’ язуючись з його промотором, або опосередковано, через посередництво інших факторів. C/EBPa відіграє неоднозначну роль у диференціації мієлоїдних клітин, будучи залученим і у моноцитарній, і у гранулоцитарній диференціації а також на більш ранніх стадіях. Якщо фактор ZXDC здатний до регуляції рівня експресії C/EBPa, то можливо він може бути залучений також до регуляції процесів, що опосередковуються цим фактором, таких як регуляція диференціації попередників гематопоетичних стовбурових клітин (HSC), CMP та GMP.
Нами було поставлено завдання з’ясувати чи активує транскрипційний фактор ZXDC експресію C/EBPa прямо, зв’язуючись з промотором гена, чи опосередковано, через посередництво інших факторів транскрипції. Для цього промоторну ділянку гена C/EBPa -26З:-2 було проклоновано у репортерну плазміду pGL3bаsic. Клітини HEK293 було трансфековано плазмідами pGL3basic, pGL-C/EBPa-pr та pcDNA3.l-ZXDC. Після трансфекції вимірювали люциферазну активність репортерних плазмід. Згідно
з отриманими даними, надекспресія ZXDC не викликала істотних змін люциферазної активності плазміди pGL-C/EBPa-pr, що свідчить про відсутність у транскрипційного фактора ZXDC здатності до активації промотору гена C/EBPa у модельній репортерній системі (рис. 2). Таким чином, активація експресії C/EBPa при надекспресії фактора ZXDC відбувається непрямим шляхом. Можливо, що фактор ZXDC активує інші гени, продукти експресії яких беруть участь у регуляції експресії C/EBPa, або вступає у білок-білкові взаємодії з іншими факторами транскрипції і лише у комплексі з ними може зв'язуватися з промотором C/EBPa.
Вплив надекспресії факторів GFI1, C/EBPa, C/EBPe та PU.1 на рівень експресії транскрипційного фактора ZXDC.
Отримані нами дані свідчать про те, що ZXDC може брати участь у мієлоїдній диференціації, модулюючи активність ключових генів диференціації, таких як C/EBPa та EGR2. Кожен із цих генів диференціації в свою чергу є членом регуляторного каскаду і його рівень експресії контролюється іншими генами. Таким чином, якщо фактор ZXDC задіяний у
процесах диференціації, то можливо що рівень його експресії також може прямо чи опосередковано регулюватися іншими факторами диференціації. Щоб визначити, як надекспресія головних факторів мієлоїдної диференціації впливає на рівень експресії транскрипційного фактору 2ХБС у клітинах ИЬ60, було проведено трансфекцію цих клітин плазмідами рсБШЗ. 1 -Мус-ОБІ 1, рсБШЗ. 1 -Мус-РИ. 1,
рсБКЛ3.1-6ИІ8-С/ЕВРа, рсБКЛ3.1-6ИІ8-С/ЕВРє та контрольною плазмідою рСМУ-БРОЯТ6-Р-§а1 для надекспресії в них факторів ОРІ1, С/ЕВРа, С/ЕВРє та РИ.1. Рівень експресії цільових генів у клітинах ИЬ60 було перевірено за допомогою кількісної полімеразної ланцюгової реакції (рис. 3). Для визначення зміни рівня експресії генів було використано дані трьох незалежних експериментів.
Згідно з отриманими даними, надекспресія РИ.1 привела до часткового (0.52) зниження рівня експресії фактора 2ХБС. При надекспресії С/ЕВРа та С/ЕВРє спостерігали більш сильне зниження рівня експресії 2ХБС (0.31 та 0.14 відповідно), тоді як надекспресія ОРІ1 повністю блокувала його експресію.
Таким чином, головні фактори мієлоїдної диференціації у свою чергу можуть модулювати експресію транскрипційного фактора 2ХБС, а це є свідченням того, що рівень експресії 2ХБС під час процесів диференціації має важливе значення і строго регулюється прямо чи опосередковано факторами С/ЕВРа, С/ЕВРє та ОРІ1. Так як жодний з цих факторів не викликав підвищення експресії 2ХБС, то можливо, що опосередкована ними регуляція рівня експресії транскрипційного фактора 2ХБС носить характер зворотного зв’язку.
Оскільки головний фактор гранулопоезу ОРІ1 повністю репресує транскрипцію фактора 2ХБС, то це може вказувати на те, що транскрипційний фактор 2ХБС задіяний на етапі вибору клітинами ОМР гранулоцитарного чи моноцитарного напрямку диференціації, тобто при переході ОМР у СБИ-О, але не на більш пізніх стадіях диференціації (СБИ-О у зрілі гранулоцити). У зв’язку з тим, що транскрипційний фактор 2ХБС здатний активувати експресію С/ЕВРа та ЕОЯ2 і вступати у білок-білкові взаємодії з ОБИ та РИ.1 (неопубліковані дані БоПе8 1аЬ), то можливо, що він бере участь в обох напрямках диференціації, модулюючи функцію вищезгаданих факторів.
Таким чином, нами було показано, що при надекспресії 2ХБС підвищується рівень експресії генів С/ЕВРа, СБ11Ь, СБ14 та ЬЯО1, а рівень експресії генів МВР, ОБІ1, РИ.1 та С/ЕВРє залишається незмінним і що 2ХБС не здатний до прямої активації промотору гена С/ЕВРа і очевидно його вплив на рівень експресії гена С/ЕВРа є опосередкованим та здійснюється шляхом взаємодії з іншими транскрипційними факторами, причому фактор 2ХБС може регулювати рівень експресії генів С/ЕВРа та ЬЯО1, задіяних на різних стадіях регуляції
диференціації гематопоетичних клітин, і в свою чергу рівень експресії ZXDC регулюється факторами GFIl, C/EBPa, C/EBPe та PU.1. За умов надекспресії фактора ZXDC у клітинах HL60, в них експресуються гени, характерні як для гранулоцитів, так і для моноцитів, що свідчить про участь ZXDC у виборі напрямку диференціації клітин GMP. Беручи до уваги дані про те, що фактори PU.1 та C/EBPa також задіяні на більш ранніх стадіях диференціації гематопоетичних клітин-попередників, то можна припустити, що і транскрипційний фактор ZXDC також може приймати участь у регуляції диференціації і на цих етапах, що заслуговує на подальше дослідження.
ВИСНОВКИ
1. За допомогою кількісної полімеразної ланцюгової реакції було показано, що надекспресія транскрипційного фактора ZXDC у клітинах HL60 призводить до підвищення рівня експресії генів C/EBPa, CD14, CDllb та LRG1, внаслідок чого клітини набувають ознак, характерних як для гранулоцитарної, так і для моноцитарної диференціації.
2. З використанням люциферазного аналізу з репортерною плазмідою, що містить клонований промотор гена C/EBPa, було показано, що фактор ZXDC не здатен до прямої транскрипційної активації ізольованого промотору C/EBPa.
3. Надекспресія факторів GFI1, C/EBPa, C/EBPe та PU1 в клітинах HL60 призводила до часткової чи повної транскрипційної репресії гена ZXDC.
4. Результати даної роботи свідчать про те, що транскрипційний фактор ZXDC здатний непрямим шляхом регулювати рівень транскрипції гена C/EBPa, задіяного у гранулоцитарній диференціації мієлоїдних попередників, і в свою чергу, ZXDC знаходиться під транскрипційним контролем інших факторів мієлоїдної диференціації як GFIl, C/EBPa, C/EBPe та PU1 і може брати участь у регуляції процесів диференціації, що опосередковується цими факторами.
Література
1. Al-Kandari W., Jambunathan S., Navalgund V., Koneni R., Freer M., Parimi N., Mudhasani R., Fontes J.. ZXDC, а novel zinc finger protein thBt binds CIITA а^ аctivаtes MHC gene transcription // Mol. Immunol. - 2007. -Vol. 44, N4. - P. 311-321.
2. Al-Kandari W., Koneni R., Navalgund V., Aleksandrova A., Jambunathan S., Fontes J.. The zinc finger proteins ZXDA а^ ZXDC form а complex thBt binds CIITA 8nd regubtes MHC II gene transcription // J. Mol. Biol. - 2007. -Vol. 369, N 5. - P. 1175-1187.
3. Aleksandrova A., Galkin O., Koneni R., Fontes J. An N-а^ C-termiml trusted isoform of zinc finger X-linked
duplicated C protein represses MHC class II transcription // Mol. Cell. Biochem. - 2010. - Vol. 337, N 1-2. - P. 1-7.
4. Галкін О.В., Мінченко O.r. Зміни в експресії генів, зумовлені надекспресією транскрипційного фактора ZXDC у ембріональних клітинах нирки лінії HEK293 // Укр. біохім. ж. - 2010. - Vol. 82, N 1. - С. 100-107.
5. Галкін О.В., Мінченко О.Г. Активація транскрипції гена EGR2 в генетично модифікованих клітинах з над експресією транскрипційного фактора ZXDC // Біотехнологія. - 2010. - № 5. - С. 57-65.
6. Laslo P., Spooner C., Warmflash A., Lancki D., Lee H., Sciammas R., Gantner B., Dinner A., Singh H. // Multilineage transcriptional priming and determination of alternate hematopoietic cell fates // Cell. - 2006. -Vol. 126. - P. 755-766.
7. Plaetinck G., Van der Heyden J., Tavernier J. et al. // J. Exp. Med. - 1990. - Vol. 172, N 3. - P. 683-691.
8. Pfaffl M. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR // Nucl. Acid. Res. -
2001. - Vol. 29. - P. E45.
9. Friedman A. Transcriptional control of granulocyte and monocyte development // Oncogene. - 2007. - Vol. 26. -P. 6816-6828.
10. Rosenbauer F., Tenen D. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation // Nat. Rev. Immunol. - 2007. - Vol. 7. - P. 105-117.
11. KlemszM., McKercherS., Celada A., et al. The macrophage and B cell-specific transcription factor PU.1 is related to the ets oncogene // Cell. - 1990. - Vol. 61. - P. 113-124.
12. Anderson M., Weiss A., Hernandez-Hoyos G., et al. Constitutive expression of PU.1 in fetal hematopoietic progenitors blocks T cell development at the pro-T cell stage // Immunity. - 2002. - Vol. 16. - P. 285-296.
13. Dahl R., Walsh J., Lancki D., et al. Regulation of macrophage and neutrophil cell fates by the PU.1:C/EBPa ratio and granulocyte colony-stimulating factor // Nat. Immunol. - 2003. - Vol. 4. - P. 1029-1036.
14. Laslo P., Spooner C., Warmflash A., et al. Multilineage transcriptional priming and determination of alternate hematopoietic cell fates // Cell. 2006. - Vol. 126. - P. 755766.
15. Zhang D., Zhang P., Wang N. et al. Absence of granulocyte colony-stimulating factor signaling and neutrophil development in CCAAT enhancer binding protein a-deficient mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2007. -Vol. 94. - P. 569-574.
16. Friedman A. Transcriptional regulation of granulocyte and monocyte development // Oncogene. - 2002. - Vol. 21. -P. 3377-3390.
17. Kummalue T., Friedman A. Cross-talk between regulators of myeloid development: C/EBPa binds and activates the promoter of the PU.1 gene // J. Leuk. Biol. - 2003. -Vol. 72. - P. 464-470.
18. Reddy V., Iwama A., Iotzova G. Granulocyte inducer C/EBPalpha inactivates the myeloid master regulator PU.1: possible role in lineage commitment decisions // Blood. -
2002. - Vol. 100. - P. 483-490.
19. Yamanaka R., Barlow C., Lekstrom-Himes J., et al. Impaired granulopoiesis, myelodysplasia, and early lethality in CCAAT/enhancer binding protein e-deficient mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. - Vol. 94. - P. 13187-13192.
20. Hock H., Hamblen M., Rooke H., et al. Intrinsic requirement for zinc finger transcription factor Gfi-1 in neutrophildifferentiation // Immunity. - 2003. - Vol. 18. -P. 109-120.
ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ФАКТОР ZXDC УЧАСТВУЕТ В ГЕННОЙ РЕГУЛЯЦИИ МИЕЛОИДНОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ
Галкин А. В., Минченко А. Г.
Транскрипционный фактор эукариот ZXDC принимает участие в регуляции экспрессии генов MHCII, BDNF, CDKN1C и IL5Ra, а также контролирует транскрипцию гена EGR2, связываясь с его промотором. В данном исследовании установлено, что надэкспрессия транскрипционного фактора ZXDC в клетках промиелоцитов HL60 приводит к повышению уровня экспрессии генов C/EBPa, CD14, CDllb и LRG1, но ZXDC не активирует промотор гена C/EBPa в составе люциферазной репортерной плазмиды. При надэкспрессии факторов GFI1, C/EBPa, C/EBPe и PU. 1 в клетках HL60 наблюдалась транскрипционная репрессия гена ZXDC. Полученные данные свидетельствуют о том, что фактор ZXDC может брать участие в регуляции дифференциации гематопоетических клеток, регулируя экспрессию других факторов дифференциации.
Ключевые слова: ZXDC, C/EBPa, HL60, HEK293, регуляция транскрипции.
TRANSCRIPTION FACTOR ZXDC IS INVOLVED IN TRANSCRIPTIONAL REGULATION OF MYELOID DIFFERENTIATION
Galkin O.V., Minchenko O.H.
Eukаryotic transcription factor ZXDC participates in the regulation of MHCII, BDNF, CDKN1C and IL5Ra gene expression. It also controls the transcription of EGR2 gene via interaction with its promoter region. In this investigation was shown that overexpression of transcription factor ZXDC in pro-myelocytes cell line HL60 leads to increase of C/EBPa, CD14, CDllb and LRG1 gene expression levels, but ZXDC could not activate C/EBPa promoter in luciferase reporter plasmids. Transcription repression of ZXDC gene was observed in HL60 cells at overexpression of GFI1, C/EBPa, C/EBPe and PU.1 factors. Results of this study demonstrated that ZXDC can participate in the regulation of hematopoietic cells differentiation via control of other differentiation factors expression.
Key words: ZXDC, C/EBPa, HL60, HEK293, regulation of transcription
