CC BY
48
Медицинская Иммунология 2004, Т. 6, № 3-5 © 2004, СПб РО РААКИ
АКТИВАЦИЯ КИСЛОРОДЗАВИСИМОГО МЕТАБОЛИЗМА НЕЙТРОФИЛОВ И ПРОТЕИ НУРИЯ - ЕДИНЫЕ ФАКТОРЫ РИСКА НЕБЛАГОПРИЯТНОГО ИСХОДА ПРИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОМ ИНСУЛЬТЕ И ИНФАРКТЕ МИОКАРДА
Кратнов А.Е., Петрова Н.П.
Ярославская государственная медицинская академия, Ярославль, Россия
Ключевые слова: инсульт, инфаркт миокарда, активные формы кислорода, нейтрофилы, протеинурия.
На сегодняшний день инсульт по-прежнему остается одной из значимых причин смерти, занимая второе место в мире. В некоторых популяциях частота инсульта снизилась, однако отмечается диссоциация между снижением частоты геморрагических инсультов по сравнению с ишемическими [5].
Считается, что тромбоз, развивающийся при атеросклерозе, является основным патологическим процессом, лежащим в основе развития инсульта и ишемической болезни сердца (ИБС). Среди многочисленных факторов риска атеротромбоза (курение, гиперхолестеринемия, сахарный диабет и малоподвижный образ жизни), способных объяснить только 50% распространенности сердечно-сосудистых заболеваний, важное значение принадлежит артериальной гипертонии [22, 24]. Связь инсульта с артериальной гипертонией заключается в единстве важнейших патогенетических механизмов, среди которых активация симпатико-адреналовой системы и процесса перекисного окисления липидов наряду с истощением эндогенного антиоксидантного потенциала [2]. Доказано, что при длительной ишемии у больных ИБС также повышается концентрация катехоламинов в крови и на фоне нейтро-фильной инфильтрации образуются свободные радикалы [9].
Адрес для переписки:
Кратнов Андрей Евгеньевич
Ярославская государственная медицинская
академия,
Тел.: (095) 79-29-05 (р.);
(095) 30-40-84 (д.)
E-mail: duk@prite.ru
Целью данного исследования было сопоставить состояние кислородзависимого метаболизма нейтро-филов и антиоксидантной защиты у больных с различными формами инсульта и инфарктом миокарда.
Материалы и методы
В исследование были включены 75 больных с инсультом или ИБС и 20 здоровых доноров без клинически и инструментально подтверждённой ИБС (средний возраст 58,3 ± 4,3 года). Контрольная (доноры) и основная группы были однородны по возрасту и полу. Группа обследованных больных включала 39 пациентов с ишемическим инсультом (средний возраст 60,8 ± 7,4 года) и 9 - с геморрагическим инсультом (средний возраст 60,8 ± 8,2 года). В качестве группы сравнения были обследованы 27 больных с инфарктом миокарда (средний возраст 61,5 ±11,4 года), из которых 3 - с инфарктом миокарда без зубца 0, и 24 - с инфарктом миокарда с зубцом О на ЭКГ. Диагноз инфаркта миокарда подтверждался данными теста на тропонин-Т, диагноз инсульта - данными ядерно-магнитной резонансной томографии. У всех больных с инсультом были проанализированы данные эхокардиографического исследования, проведенного на догоспитальном этапе. В исследование не включались больные с сахарным диабетом 2 типа, язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, бронхиальной астмой, злокачественными новообразованиями и хроническим алкоголизмом. Конечными точками наблюдения за больными с инсультом и ИБС в течение 6 месяцев считались: развитие рецидива инфаркта миокарда или инсульта, наступление смерти.
Нейтрофилы выделяли из гепаринизированной крови, взятой натощак при поступлении больных в стационар, в двойном градиенте плотности фиколла-верографина 1,077 и 1,092 г/мл. Для исследования брали клетки второй интерфазы, которую нейтрофилы составляли на 95%. Для изучения образования нейт-рофилами супероксидного анион-радикала использовался спонтанный и стимулированный тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ), который проводили количественным спектрофотометрическим методом по T.A.Gentle и R.A.Thompson (1990) с использованием 0,2% раствора нитросинего тетразолия и растворением восстановленного диформазана в смеси 2М калия гидроксида и диметилсульфоксида 3:5 по объему [19]. В качестве индукторов кислородзависимого метаболизма фагоцитов использовали: взвесь 1 х 109 убитых клеток Staphylococcus aureus штамма р-209 (активность FcR) и фитогемагглютинин (активность C3R) из бобов фасоли (Phaseolus vulgaris). Содержание миелопероксидазы в лизате нейтрофилов оценивали количественным спектрофотометрическим методом с использованием 0,04% раствора орто-фенилендиами-на на фосфатном буфере с pH 5,0 и добавлением 0,33% раствора перекиси водорода в соотношении 20:1 по объёму [10]. Активность глутатионредуктазы в лизате нейтрофилов определяли по E. Beutler (1975) спектрофотометрическим методом по степени окисления НАДФ-Н [1]. Конечный результат HCT-теста, содержания миелопероксидазы и активности глутатионредуктазы рассчитывали на 1-106 фагоцитов, исходя из содержания в исследуемой суспензии 5-10*’ клеток. Определение активности каталазы в сыворотке крови основывалось на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс [7]. Содержание циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) определяли по методу A.Digean и В.Mayer в модификации В. Гашковой и соавторов (1978), преципитацией в растворе полиэтиленглико-ля при pH 8,4 [3].
Статистическую обработку данных проводили с помощью параметрических и непараметрических методов, используя пакет Statistica 5.5. Данные исследований представлены в виде их средних значений и стандартного отклонения (М ± SD). Различия между группами считались статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
При сравнении состояния кислородзависимого метаболизма нейтрофилов и антиоксидантной защиты выявлены достоверные различия между показателями в группах ишемического и геморрагического инсульта (табл.). У больных с геморрагическим инсультом при поступлении в стационар были достоверно выше показатели ЦИК (р = 0,001) и стимулированного фитогемагглютинином HCT-теста с
нейтрофилами (р = 0,03). Выявленное ЦИК-зависи-мое праймирование нейтрофилов при геморрагическом инсульте сопровождалось более выраженной протеинурией (0,07 ± 0,08 > 0,01 ± 0,03 г/л; р = 0,003), по сравнению с показателями белка в моче у больных с ишемическим инсультом. Иммунологические данные у больных с инфарктом миокарда были близки к значениям при геморрагическом инсульте -достоверно выше уровень ЦИК (р = 0,0001) и показатели стимулированного фитогемагглютинином НСТ-теста (р = 0,04) по сравнению с группой ишемического инсульта. При инфаркте миокарда также выявлялись ниже уровень каталазы плазмы крови (р = 0,00004) и выше содержание миелопероксидазы в нейтрофилах (р = 0,006), которое было больше и по сравнению с показателями при геморрагическом инсульте. Содержание глутатионредуктазы в нейтрофилах было наиболее низким у больных с геморрагическим инсультом. Уровень протеинурии у больных с инфарктом миокарда был выше, чем при ишемическом инсульте, хотя достоверно ниже, чем при геморрагическом инсульте (0,01 ± 0,03 < 0,02 ±
0,03 < 0,07 ± 0,08 г/л). Таким образом, ЦИК-зависи-мое праймирование нейтрофилов, более выраженное у больных с геморрагическим инсультом и инфарктом миокарда, ассоциируется с ростом протеинурии. Выявлена прямая корреляция между показателями белка в моче и мочевиной, уровень которой был выше при геморрагическом инсульте и инфаркте миокарда, а также со значениями стимулированного лекти-ном НСТ-теста (г = 0,41; р = 0,002).
Считается доказанным, что маркером распространенного атеротромбоза является альбуминурия, ассоциирующаяся со смертностью от атеротромбо-тических заболеваний независимо от наличия сахарного диабета 2 типа, а также риском развития повторного инсульта [17,18]. Всего за время наблюдения в течение 6 месяцев после выписки из стационара у обследованных больных зарегистрировано 8 (10,6%) случаев неблагоприятных исходов, из них у пациентов с инсультом - 4 (8,3%) случая (1 рецидив инсульта и 3 смерти), с инфарктом миокарда также 4 (15,3%) события (2 рецидива инфаркта миокарда и 2 смерти). По данным кластерного анализа (рис.) из множества биохимических и иммунологических показателей, данных клинического анализа крови большей широтой связи с развитием неблагоприятных исходов у больных с инсультом и инфарктом миокарда обладали протеинурия, уровень которой у данных больных при поступлении в стационар был достоверно выше контроля (0,05 ± 0,04 > 0,003 ± 0,008 г/л; р = 0,005), а также активность глутатионредуктазы в нейтрофилах.
Поскольку показатели протеинурии у обследованных больных коррелировали с данными НСТ-теста, это говорит об определяющей роли нейтрофилов в развитии нефропатии. Доказано, что активи-
рованные нейтрофилы играют важную роль в патогенезе заболеваний почек. При хронической почечной недостаточности плохой прогноз предопределяет атрофия канальцев почек, важную роль в развитии которой принимает Баз-опосредованный апоп-тоз клеток тубулярного эпителия. Одной из причин, способных индуцировать апоптоз, являются свободные радикалы, образуемые активированными нейт-рофилами, а также действие комплемента [8]. Полагается, что фиксация ¡СЗЬ - продукта расщепления компонента комплемента на эндотелиальных клетках вызывает адгезию нейтрофилов (по аналогии с опсонизацией бактериальных клеток) [12]. Выявлено, что в присутствии фитогемагглютинина значительно повышается в культуре лейкоцитов содержание белка р53, останавливающего клетки в фазе в1 или включающего программируемую смерть клеток в ответ на нарушения в ДНК [21]. Предполагается, что важную роль в элиминации молекул межклеточной адгезии (УСАМ-1), которые принимают участие в прилипании лейкоцитов к эндотелию и рост уровня которых связан с факторами сердечно-сосу-дистого риска, в том числе артериальной гипертонией, играют почки [16].
Активация кислородзависимого метаболизма нейтрофилов может быть связана с хронической или рецидивирующей инфекцией, признаки которой выявляются у больных с атеротромбозом как головного мозга, так и сердца [23, 25]. Другим фактором активации метаболической активности нейтрофилов и развития нефропатии может быть хроническая сердечная недостаточность у пациентов с инсультом и
ИБС. Считается, что возрастная гипофункция почек легко сдвигается в сторону почечной недостаточности в стрессовых ситуациях, в том числе при развитии хронической сердечной недостаточности [14]. В исследовании SAVE [20] показано, что больные, у которых развивался инсульт, были старше по возрасту и имели более низкую фракцию выброса левого желудочка сердца. Развитие сердечной недостаточности в свою очередь сопровождается увеличением образования свободных радикалов, что коррелирует с активацией симпатико-адреналовой системы [И]. Под влиянием катехоламинов увеличивается количество циркулирующих нейтрофилов за счёт перехода в циркуляцию части пристеночных клеток маргинального пула, а также усиливается рекрутирование гранулоцитов в лёгкие, где происходит нарастание продукции ими свободных радикалов [6, 13].
В данном исследовании у больных с геморрагическим инсультом до поступления в стационар, в отличие от ишемического инсульта, наблюдались более низкая фракция выброса (56 ± 5,3 < 61 ± 7,5%), высокие показатели конечного диастолического объема (118 + 4,8 > 108 ± 18 мл) и конечного систолического объема левого желудочка (51 ± 1,4 > 38,6 ± 5,5 мл; р = 0,01), который является одним из наиболее значимых предикторов летального исхода после перенесенного инфаркта миокарда [15]. Данные изменения при геморрагическом инсульте сопровождались достоверно более низкими показателями суммарной высоты зубцов R (263,3 ±72,5 <419,7 ± 87,9 мм; р = 0,02) по данным электрокардиотопографии при поступлении в стационар, что свидетельствует
ТАБЛИЦА. СОСТОЯНИЕ КИСЛОРОДЗАВИСИМОГО МЕТАБОЛИЗМА НЕЙТРОФИЛОВ И АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ У БОЛЬНЫХ С РАЗЛИЧНЫМИ ФОРМАМИ ИНСУЛЬТА И ИНФАРКТОМ МИОКАРДА
Показатели Контроль п = 20 I Ишемический инсульт п = 39 II Г еморрагический инсульт п = 9 III Инфаркт миокарда п = 27
Спонтанный НСТ, нмоль восст. НСТ 94,7 ± 14,4 104,1 ±46,8 112 ±40,4 103,5 ±23,6
Стимул. НСТ (FcR), нмоль восст. НСТ 103,4 ±7 102,7 ± 37,8 120,3 ± 17,8* 110,5 ±22,3
Стимул. НСТ (C3R), нмоль восст. НСТ 103,4 ±7 103 ±35,7 130,2 ± 38,38* ** 118 ±36,1* ***
Г лутатионредуктаза, нмоль л''/ceK'1 43,3 ±48,6 30,5 ± 65,3 26 ± 0,2 40 ± 42,9
Миелопероксидаза, у.е.а. 19 ± 14,3 11,8 ±6,8 10,6 ± 6,1 17,7 ±9,2***
Каталаза, мкат/л 586 ± 276,6 760,6 ± 339,8 685 ±351,3 414,2 ±200,3* ***
ЦИК, ед. опт. пл. 21,2 ±22,5 23,6 ± 13 69,6 ± 74,8* ** 61,3 ±50,5* ***
Примечание: при р < 0,05: * - по сравнению с контролем, ** -1 - II, *** -1 - III.
Взвешенный центроидный метод (медиана)
Процент несогласия
С-реактивный белок зозинофилы лейкоциты моноциты спонт. НСТ-тест стим. НСТ-тест лимфоциты нейтрофилы
соэ
глюкоза
креатинин
мочевина
каталаза
ЦИК
миелопероксидаза глутатионредуктаза белок мочи
О 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Расстояние связи
Рис. Кластерный анализ иммунологических, биохимических показателей и данных клинического анализа крови у больных с неблагоприятным исходом при инсульте и инфаркте миокарда
об уменьшении массы жизнеспособного миокарда. Выявленная обратная корреляция у больных с геморрагическим инсультом между показателями конечного систолического объема левого желудочка и белка в моче (г = — 0,41; р = 0,03), а также прямая с данными стимулированного фитогемагглютинином HCT-теста с нейтро-филами (г = 0,46; р = 0,04) подтверждает связь хронической сердечной недостаточности с активацией кислородзависимого метаболизма нейтрофилов и развитием нефропатии. Таким образом, развитие геморрагического инсульта, в отличие от ишемического, происходит на фоне ЦИК-зависимого праймирования нейтрофилов и развития нефропатии, которые ассоциируются с наличием у данных больных хронической сердечной недостаточности.
Доказательством связи активации метаболизма фагоцитов с развитием инсульта является также применение статинов для их профилактики. Показано, что снижение риска развития инсультов не зависит от ги-похолестеринемического действия данных лекарств. Напротив, низкий уровень холестерина может быть фактором риска геморрагического инсульта. При этом статины снижают димеризацию адгезивных молекул (CDllb/CD18, Р-селектин, VCAM-1, ICAM-1) и изоп-ренилирование лейкоцитарных G-белков семейства Ras/Rho, которые вовлечены в процессы апоптоза [4].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Арутюнян A.B., Дубинина Е.Е., Зыбина H.H. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма // Методические рекомендации. — СПб: ИКФ “Фолиант”, 2000.
- С.77-78.
2. Верещагин Н.В., Суслина З.А., Максимова М.Ю. Артериальная гипертония и цереброваскулярная патология: современный взгляд на проблему // Кардиология. — 2004. — № 3. — С. 4-8.
3. Гашкова В., Матл И., Кашлик И. Циркулирующие комплексы у больных иммунокомплексными заболеваниями и после трансплантации почек // Чех. Мед. - 1978. - № 2. - С.117-122.
4. Затейщиков Д.А. Лечение атеросклероза: насколько важно действие статинов на уровень холестерина? // Фарматека. — 2003. — № 6. — С. 39-44.
5. Кобалава Ж.Д., Толкачева В.В. Цереброваскулярные осложнения АГ. Возможности антагонистов рецепторов ангиотензина II // Сердце. — 2003. — том. 2,-№4.-С. 165-172.
6. Коган А. Усиление генерации активных форм кислорода лейкоцитами в лёгких // Врач. - 1995. -№ И.-С. 30-31.
7. Мамонтова Н.С., Белобородова Э.И., Тюкало-ва Л.И. Активность каталазы при хроническом ал-
коголизме // Клиническая лабораторная диагностика. - 1994.-№ 1. - С. 27-28.
8. Перевезенцева Ю.Б. Апоптоз и его роль в патогенезе заболеваний почек // Нефрология. - 2001. — № 4. - С. 17-23.
9. Садовски С. Метаболические подходы к лечению ИБС у лиц пожилого возраста и больных сахарным диабетом // Медикография (метаболизм миокарда и лечение ИБС). — 1999. — № 2. — С. 101-102.
10. Саидов М.З., Пинегин Б.В. Спектрофотометрический способ определения активности миелопе-роксидазы в фагоцитирующих клетках // Лабораторное дело. — 1991. — № 3. — С.56-59.
11. Сайфутдинов Р.И., Коц Я.И., Тихазе А.К., Ланкин В.З. Изменение активности антиокислительных ферментов у больных с хронической сердечной недостаточностью // Кардиология. - 1990. -№ 3. - С. 65-68.
12. Саложин К.В., Насонов Е.Л., Беленков Ю.Н. Роль эндотелиальной клетки в иммунопатологии // Тер. архив. - 1992. -№ 3. - С. 150-157.
13. Серов В.В., Пауков B.C. Воспаление. М: Медицина, 1995.
14. Терещенко С.Н., Демидова И.В. Почечная недостаточность при хронической сердечной недостаточности у больных пожилого и старческого возраста// Сердце. — 2002. — том. 1. — № 5. — С. 251-256.
15. Явелов И.С., Деев А.Д., Травина Е.Е., Грацианский H.A. Прогностическое значение средней частоты сердечных сокращений и вариабельности ритма сердца, оцененных за короткое время в стандартных условиях в ранние сроки инфаркта миокарда // Кардиология. — 1999. — № 6. — С. 6-13.
16. Bonomini М., Reale М., Santarelli P. Serum levels of soluble adhesion molecules in chronic renal failure and dialysis patients //Nephron. — 1998. — Vol. 79. — P. 399-407.
17. Coull B.M., Beamer N.B., dark W.M., Wynn M. Microalbuminuria and risk of recurrent stroke (Abstr.) // Stroke. - 1998. - Vol. 29. - P. 285.
18. Darnsgaard E.M., Froland A., Jorgensen O.D., Morgensen C.E. Microalbuminuria as predictor of increased mortality in elderly people // Br. Med. J. — 1990.-Vol. 300.-P. 297-300.
19. Gentle T. A., Thompson R. A. Neutrophil function tests in clinical immunology // Clinical Immunology A Practical Approach. / ed. Gooi H.G., Chapel H. — New York: Oxford University Press, 1990. — P. 57-59.
20. Loh E., Sutton M.ST.J., Wun C.C.C. Ventricular dysfunction and the risk of stroke after myocardial infarction // N. Engl. J. Med. — 1997. — Vol. 336. — P. 251-257.
21. Mercer W.E., Baserga R. Expression of the p53 protein during the cell cycle of human peripheral blood lymphocytes // Exp. Cell Res. — 1985. — Vol. 160. — P. 31-46.
22. Rosengren A., Welin L., Tsipogianni A., Wilhelmsen L. Impact of cardiovascular risk factors on coronary heart disease and mortality among middle aged diabetic men: a general population study // Br. Med. J. — 1989. — Vol. 299.-P. 1127-1131.
23. Saikku P. Chlamydia pneumoniae as a risk factor in acute myocardial infarction // Eur. Heart J. — 1993.
- Vol. 14 (Suppl. K). - P. 62-65.
24. Violi F., Criqui M., Longoni A., Castiglioni C. for the ADEP Group. Relation between risk factors and cardiovascular complications in patients with peripheral arterial disease. Results from the ADEP study // Atherosclerosis. — 1996. — Vol. 120. — P. 25-35.
25. Wimmer M.L.J., Sandmann-Strupp R., Saiiku P., Haberl R.L. Association of Chlamydial infection with cerebrovascular disease // Stroke. — 1996. — Vol. 27. — P. 2207-2222.
