CC BY
135
Химия растительного сырья. 2011. №1. С. 59-63.
УДК 668.473:547.992.3:532.133; 619:615.9 АДСОРБЦИЯ МИКОТОКСИНОВ ТЕХНИЧЕСКИМИ ЛИГНИНАМИ
© З.А. Канарская1, А.В. Канарский1, Ю.Г. Хабаров2 , С.Б. Селянина3, Т.А. Бойцова3, М.Я. Тремасов4,
Э.И. Семенов4, Н.Н. Мишина4, Е.Ю. Тарасова4
1 Казанский государственный технологический университет, ул. К. Маркса,
68, Казань, Татарстан, 420015 (Россия) e-mail: alb46@yandex.ru 2Архангельский государственный технический университет, наб. Северной Двины, 17, Архангельск, 163000 (Россия) e-mail: khabarov@agtu.ru 3Институт экологических проблем Севера УрО РАН, наб. Северной Двины,
23, Архангельск, 163000 (Россия) e-mail: smssb@yandex.ru 4Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных, Научный городок, 2, Казань, Татарстан, 420075 (Россия)
Установлено влияние химического строения и молекулярной массы технических лигнинов на эффективность адсорбции микотоксина Т-2 и афлатоксина BL Показано, что максимальной адсорбционной способностью и прочностью связывания микотоксина Т-2 и афлатоксина В! обладает сульфатный лигнин. Предложено использовать сульфатный лигнин как профилактическое средство при микотоксикозах животных.
Ключевые слова: энтеросорбенты, микотоксины, сульфатный лигнин, лигносульфонаты, гидролизный лигнин, адсорбция,
Введение
Микотоксины относятся к одной из доминирующих в последние годы групп биогенных ядов, загрязняющих корма и продукты питания. При потреблении таких кормов и продуктов питания у животных и человека возникают отравления - микотоксикозы [1].
Расширение масштабов экспорта и импорта зерна между странами, наблюдаемое изменение климата в мире, систематическое применение фунгицидов, пестицидов, протравителей семян приводит к увеличению образования микотоксинов в сотни раз и повышению возможности одновременной контаминации корма различными микотоксинами. При этом концентрация каждого микотоксина в отдельности может быть ниже установленной ПДК, что затрудняет постановку диагноза, усугубляет заболевания животных и обусловливает высокий экономический ущерб. Наиболее часто корма загрязняются микотоксинами грибов рода Fusarium и Aspergillus, продуцирующие, соответственно, наиболее опасные микотоксин Т-2 и афлатоксин Bj [2].
Из множества существующих мер профилактики микотоксикозов: аграрных, правильного хранения кормов, обработки препаратами химического и биологического происхождения и прочих, в последнее время все большее распространение находят энтеросорбенты растительного происхождения. Эти адсорбенты сочетают в себе свойства, предъявляемые к профилактическим препаратам: физиологичность, безвредность, низкий процент вводимости в рацион, избирательность адсорбции, экономичность.
Важнейшим требованием, предъявляемым адсорбентам микотоксинов, является их энзимрезистентность и сохранение адсорбционных свойств по отношению к микотоксинам при перемещении адсорбентов вже-лудочно-кишечном тракте моногастричных и жвачных животных.
В этой связи представляется весьма перспективным в качестве адсорбента для микотоксинов применение лигнина, который обладает развитой поверхностью, высокими адсорбционными свойствами по отношению к веществам различных классов и не переваривается в организме животных и человека.
Настоящая работа посвящена определению адсорбционных свойств технических лигнинов по отношению к микотоксину Т-2 и афлатоксину Вь
*Автор, с которым следует вести переписку,
Экспериментальная часть
В исследовании использовали производственный сульфатный лигнин Архангельского ЦБК и технические лигносульфонаты (ЛСТ) от кислой сульфитной варки на натриевом основании хвойной древесины Архангельского ЦБК (г. Новодвинск) и Котласского ЦБК (ОАО «Группа «Илим», г. Коряжма), а также энтеросорбирующее средство «Полифепан» (международное наименование - лигнин гидролизный), изготовленое ЗАО «Сайтек» в 2008 г.
Сульфатный лигнин (СЛ) выделяли из черного щелока промышленных варок путем подкисления серной кислотой при нагревании. Осадок СЛ промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции и высушивали при температуре 20-35 °C. Для определения влияния на адсорбционные свойства лигнина низкомолекулярных органических примесей часть СЛ освобождали от этих примесей путем экстракции диэтиловым эфиром.
ЛСТ очищали от низкомолекулярных примесей методом диализа. После диализа раствор концентрировали выпариванием, высушивали при температуре 20-30 °С и после высушивания измельчали. Полученные препараты ЛСТ представляли собой порошки темно-коричневого цвета влажностью 7,5-8%.
Содержание сухих веществ, золы, редуцирующих веществ, общей и органически связанной серы и функциональных групп в образцах лигнина определяли принятыми методами [3, 4].
Определение молекулярной массы проводили методом гель-проникающей хроматографии на колонке с гелем Сефадекс G-75. В качестве элюента при анализе ЛСТ использовали водно-солевой буфер с pH 6,85 (состав буфера 0,14 М Na2HPO4x12 H2O, 0,07 M KH2PO4, 0,1 M NaCI), при анализе СЛ - диметилсульфок-сид. Значение молекулярных масс рассчитывали по программе MMD [5], используя для расчета калибровочные величины (объем выхода декстрана и ванилина) и коэффициенты зависимости KD=f (MM).
Эффективность адсорбции микотоксинов лигнинами определялась in vitro. Для экспериментальных исследований использовали кристаллические микотоксин Т-2 и афлатоксин В1, соответствующие стандартным образцам.
Адсорбцию афлотоксина и микотоксина Т-2 техническими лигнинами проводили при концентрации их в водно-солевых растворах соответственно 0,1 и 1 мкг/мкл. К 5 мл водно-солевого раствора добавляли 10 мкл спиртового раствора микотоксина. Масса адсорбента - 50 мг. Соотношение «токсин : адсорбент» составляло 1 : 1000. Адсорбцию проводили при pH 7 и 2 и температуре 37±1 °С, что моделирует условия адсорбции микотоксинов, соответственно, в ротовой полости и желудке животных. Далее проводили экспозицию при постоянном встряхивании в течение 30 мин. Затем раствор центрифугировали и из фугата токсин экстрагировали хлороформом (три раза по 20 мл). Экстракты объединяли и упаривали досуха на ротационном испарителе.
Вероятность десорбции микотоксинов с поверхности технических лигнинов в кишечнике моделировали последующей после адсорбции микотоксинов при pH 2 десорбцией при pH 8, при температуре водносолевого раствора 37±1 °С и продолжительности 30 мин. На 50 мг адсорбента также брали 5 мл водносолевого раствора.
Обнаружение и количественное определение микотоксинов проводили методом ТСХ на пластинах Sorbfil ПТСХ-АФ-А.
При проведении тонкослойной хроматографии (ТСХ) афлатоксина в качестве подвижной фазы применялись смесь растворителей хлороформ - ацетон (9 : 1). Для обнаружения афлатоксинов на хроматографической пластине применялся УФ-облучатель с длиной волны 365 нм (лампа Вуда, ОЛД-41).
Количественное определение афлатоксинов Bj проводили с поддержкой программы денситометрии Sorbfil TLC Videodensitometer (предназначена для количественной оценки и расчета параметров в тонкослойной хроматографии).
Количественное определение микотоксина Т-2 проводили методом тонкослойной хроматографии с био-автографическим завершением с использованием культуры Candida pseudotropicalis штамм 44 ПК. В качестве подвижой фазы использовалась система растворителей толуол - этилацетат - муравьиная кислота (6 : 3 : 1).
Обсуждениерезультатов
Анализ представленных в таблицах 1 и 2 данных позволяет сделать вывод о том, что адсорбционные свойства технических лигнинов по отношению к микотоксину Т-2 и афлатоксину Bj зависят от их природы
и pH среды. В нейтральной среде ЛСТ в сравнении с СЛ имеют более низкую адсорбционную способность по отношению к рассматриваемым микотоксинам. В кислой среде при pH 2 адсорбционная способность ЛСТ и СЛ сопоставима по значениям. Однако при pH 8 десорбция микотоксинов с ЛСТ происходит в большей степени, чем с СЛ. Это способствует получению истинной адсорбции микотоксинов сульфатным лиг -нином большей, чем лигносульфонатами.
Следует отметить, что удаление низкомолекулярных веществ из препаратов как ЛСТ, так и СЛ снижает их способность к адсорбции и микотоксина Т-2, и афлатоксина В1 независимо от кислотности среды.
Истинная адсорбция микотоксина Т-2 гидролизным лигнином (полифепаном) значительно меньше СЛ и ЛСТ и сопоставима с истиной адсорбцией этого микотоксина с диализованным лигносульфонатом. Это обусловлено высокой десорбцией микотоксина Т-2 с его поверхности.
Таким образом, наиболее эффективно рассматриваемые токсины адсорбирует сульфатный лигнин, не подвергавшийся экстракции диэтиловым эфиром.
При интерпретации полученных результатов следует обратить внимание на особенности химического строения микотоксинов и технических лигнинов. Использованные в работе токсиканты являются полицикли-ческими соединениями и содержат различные функциональные группы [7]. У микотоксина Т-2 присутствуют сложноэфирные группировки, спиртовая гидроксильная группа, оксирановый цикл и этиленовая двойная связь (рис. 1а). В молекуле афлатоксина В1 кроме этиленовых двойных связей имеются кетонная карбонильная группа, лактонная группировка, простые циклические и нециклические эфирные связи (рис. 16).
Как и микотоксины, технические лигнины также многофункциональны [8—11]. Вместе с тем представленные в таблице 3 данные наглядно демонстрируют, что количество функциональных групп в технических лигнинах различной предыстории отличается довольно значительно.
Рис. 1. Химическая структура: а) микотоксина Т-2; б) афлатоксина В1
Таблица 1. Адсорбция микотоксина Т-2 лигнинами, %
Наименование образца лигнина Адсорбция микотоксина Т-2 Десорбция микотоксина Т-2 Истинная адсорбция
pH 7 pH 2 pH 8 pH 2
Лигносульфонат Архангельского ЦБК 10,7 89,5 33,0 56,5
Лигносульфонат Котласского ЦБК 5,3 88,5 37,2 51,3
Сульфатный лигнин Архангельского ЦБК 57,1 84,2 43 79,5
46,4 74,5 4,0 70,5
Лигносульфонат диализованный 11,6 46,6 13,8 32,8
Полифепан (гидролизный лигнин) * .... 64,0 52,8 18,1 34,7
В числителе - лигнин, промытый до нейтральной среды; в знаменателе - лигнин, освобожденный от эфирорастворимых соединений.
Таблица 2. Адсорбция афлатоксина В1 лигнинами, %
Наименование лигнина и источника Адсорбция афлатоксина В1 Десорбция афлатоксина В1 Истинная адсорбция
pH 7 pH 2 pH 8 pH 2
Лигносульфонат Архангельского ЦБК 17,5 79,6 40,1 39,5
Лигносульфонат Котласского ЦБК 9,4 75,8 40,5 35,3
Сульфатный лигнин Архангельского ЦБК 60,3 87,4 57 81,7
54,8 69,5 6,5 63,0
Лигносульфонат диализованный * .... 19,3 57,5 19,1 38,4
В числителе - лигнин, промытый до нейтральной среды; в знаменателе - лигнин, освобожденный от эфирорастворимых соединений.
На количество функциональных групп в технических лигнинах влияет и содержание минеральных и редуцирующих веществ (табл. 4). Сульфатный лигнин имеет наименьшее содержание золы и общей серы, в нем отсутствуют редуцирующие вещества, что также способствует обогащению сульфатного лигнина функциональными группами.
Кроме того, лигнины значительно различаются по величинам молекулярных масс (табл. 4). Сульфатный лигнин имеет наименьшее значение молекулярной массы, и, соответственно, его функциональные группы более доступны для взаимодействия с микотоксинами. Гидролизные лигнины являются наиболее конденсированными из технических лигнинов. Они имеют структуру трехмерной сетки, поэтому практически нерастворимы, что снижает доступность их функциональных групп для адсорбции микотоксинов.
Учитывая функциональность рассматриваемых микотоксинов и технических лигнинов, можно предположить, что они способны эффективно взаимодействовать друг с другом. Природа таких явлений может быть различной, в частности, адсорбция микотоксинов за счет водородных связей или донорно-акцепторных взаимодействий функциональных групп рассматриваемых веществ. Кроме того, вероятным представляется и адсорбция микотоксинов лигнинами за счет образования функциональными группами прочных химических связей рассматриваемых веществ.
Так как у сульфатных лигнинов содержание функциональных групп больше, чем у других технических лигнинов, адсорбционные свойства у них должны быть более ярко выражены в результате хемосорбции.
Таким образом, полученные в ходе исследования результаты позволяют с высокой долей вероятности предполагать, что при взаимодействии микотоксинов с техническими лигнинами наблюдается как физическая, так и химическая адсорбция.
Для исключения возможности негативного действия сульфатного лигнина на организм животных проведены исследования хронической токсичности этого лигнина в опытах на белых крысах. Исследования показали, что введение сульфатного лигнина в корм от 0,5 до 5% от рациона не оказывает отрицательного влияния на организм животных. Статистически достоверной разницы в приросте массы тела у крыс контрольной и опытных групп, показателях гематологических, биохимических и неспецифической резистентности не обнаружено ф> 0,05).
Проверена сравнительная профилактическая эффективность сульфатного лигнина как энтеросорбента при микотоксикозах овец. Установлено, что введение лигнина в рацион животных в количестве 0,5% при хроническом сочетании микотоксина Т-2 и афлатоксикозе оказывает положительное влияние на показатели неспецифической резистентности животных [12].
Таблица 3. Состав функциональных групп лигнинов
Наименование образца лигнина Порода Содержание, %
древесины ОН0бщ. ОНкисл. ОНфеи. ОСН3 соон >с=о
Лигносульфонат Архангельского ЦБК хвойная 5,5 ** ** 10.3 2.03 1.37
Лигносульфонат Котласского ЦБК хвойная 2.5 10.5 1.45
Сульфатный лигнин Архангельского ЦБК хвойная 9.79 6,26 1.43 1.75 8.36 4.51 12.6 12.7 1.53 5.24 5.51
Лигносульфонат диализованный хвойная 5.4 1.16 1.44 10.0 2.8 1.5
Полифепан (гидролизный лигнин) хвойная, лиственная 4.82 5.74 8.4 0.87
В числителе - лигнин, промытый до нейтральной среды, в знаменателе - лигнин, освобожденный от эфирорастворимых соединений; - показатели не определялись.
Таблица 4. Характеристика химического состава и молекулярной массы лигнинов
Наименование образца лигнина Содержание, % Молекулярная масса Mw. а.е.м.
общей серы золы РВ
Лигносульфонат Архангельского ЦБК 7.5 17.5 4.4 42000
Лигносульфонат Котласского ЦБК 6.2 13.8 5.8 24000
Сульфатный лигнин Архангельского ЦБК 21 15 9300
1.5 6.8 6900
Лигносульфонат диализованный 7.8 12.3 0.2 60000
Полифепан (гидролизный лигнин) 2.3 2.8 0.4
* В числителе - лигнин, промытый до нейтральной среды, в знаменателе - лигнин, освобожденный от эфирорастворимых соединений; ** - показатели не определялись.
Выводы
1. Адсорбционные свойства технических лигнинов по отношению к микотоксину Т-2 и афлатоксину В1 зависят от их химического строения и молекулярной массы.
2. Максимальной адсорбционной способностью и прочностью связывания микотоксина Т-2 и афлатокси-на В1 обладает сульфатный лигнин.
3. Сульфатный лигнин без удаления из него экстрактивной части оказывает защитное действие при микотоксикозах животных и может использоваться как профилактическое средство в животноводстве.
Список литературы
1. Кузнецов А.Ф. Ветеринарная микология. СПб., 2001. 416 с.
2. Лиморенко A.A., Бажов Г.М., Баранников А.И. Кормовые отравления сельскохозяйственных животных. СПб., 2007. 400 с.
3. Оболенская A.B., Ельницкая З.П., Леонович A.A. Лабораторные работы по химии целлюлозы и древесины. М., 1991. 320 с.
4. Закис Г.Ф. Функциональный анализ лигнинов и их производных. Рига, 1987. 230 с.
5. Соколов О.М. Определение молекулярных масс лигнинов на ультрацентрифуге и методом гель-фильтрации: учебное пособие. Л., 1978. 76 с.
6. Крюков B.C., Крупин В.В., Котик А.Н. Применение клиноптилолита для профилактики микотоксикозов // Ветеринария. 1992. №9-12. С. 28-29.
7. Куценко С.А. Основы токсикологии. СПб., 2004. 720 с.
8. Сарканен К.Х., Людвиг Г.В. Лигнины (структура, свойства и реакции). М., 1975. 632 с.
9. Шорыгина H.H., Резников В.М., Елкин В.В. Реакционная способность лигнина. М., 1976. 368 с.
10. Чудаков М.И. Промышленное использование лигнина. М., 1983. 200 с.
11. Сапотницкий С.А. Использование сульфитных щелоков. М., 1983. 200 с.
12. Мишина H.H. Изучение влияния энтеросорбентов на основе лигнина при смешанном Т-2 и афлатоксикозе // Достижения молодых ученых в производство: матер. науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов, посвященной 100-летию со дня рождения Ч.Ч. Абдулина. Казань, 2008. С. 70-72.
Поступило в редакцию 19 февраля 2010 г.
После переработки 27 апреля 2010 г.
