CC BY
10сибирской медицины. Тематический выпуск. 2009. №1(2). С.59-64.
12. Солдаткин В.А. Психические расстройства у участников ликвидации последствий аварии на Черно-
быльской атомной электростанции: клиника, психопатологическая структура, динамика / В.А. Солдаткин. дис. ... канд. мед. наук. М., 2002. 213с.
ИЗУЧЕНИЕ IN VITRO МИНЕРАЛИЗИРУЮЩИХ СВОЙСТВ КРЕМА, СОДЕРЖАЩЕГО РАЗНЫЕ ПРОТИВОКАРИОЗНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ В ПЕРИОД ВТОРИЧНОЙ МИНЕРАЛИЗАЦИИ ЭМАЛИ ПОСТОЯННЫХ ЗУБОВ
Хоменко Лариса Александровна
д. мед. н., профессор, заведующий кафедры детской терапевтической стоматологии
и профилактики стоматологических заболеваний Национального медицинского университета имени А. А. Богомольца, Киев, Украина.
Сороченко Григорий Валериевич
к. мед. н., доцент кафедры детской терапевтической стоматологии и профилактики стоматологических заболеваний
Национального медицинского университета имени А. А. Богомольца
IN VITRO INVESTIGATION OF REMINERALIZING PROPERTIES OF A CREAM CONTAINING DIFFERENT ANTICARIOGENIC COMPOUNDS DURING THE PERIOD OF SECONDARY MINERALIZATION OF PERMANENT TEETH ENAMEL
Larisa Khomenko, M.D. in dentistry, Professor Head of the department of pediatric and preventative dentistry Bogomolets national medical university, Kyiv, Ukraine
Grigoriy Sorochenko, Ph.D in dentistry, Professor assistant, department of pediatric and preventative dentistry Bogomolets national medical university
АННОТАЦИЯ
С помощью сканирующей электронной микроскопии и рентгенфотоэлектронной спектроскопии изучены in vitro изменения химического состава и морфологической структуры поверхностного слоя 25 образцов эмали постоянных зубов, которые только что прорезались, под воздействием крема, содержащего гидроксиапатит, фторид и ксилит. Эмаль зубов, которые только что прорезались, является недостаточно минерализованной и, соответственно, имеет недостаточный уровень кариесрезистентности. Анализ химического состава поверхностного слоя незрелой эмали постоянных зубов свидетельствует о том, что в течение всего эксперимента под влиянием крема, содержащего гидроксиапатит и фторид, в поверхностном слое происходят достоверные изменения содержания углерода, фтора, кремния и кальция, а также соотношения кальций/фосфор. Повышение уровня минерализации эмали постоянных зубов, которые только что прорезались, под влиянием крема, содержащего гидроксиапатит и фторид, подтверждалось данными сканирующей электронной микроскопии. Достижение оптимального уровня минерализации под воздействием крема, содержащего гидроксиапатит и фторид, происходит в условиях эксперимента через 12 месяцев применения.
ABSTRACT
In vitro changes of chemical composition and morphological structure of the superficial layer of 25 samples of just erupted permanent teeth enamel under the influence of cream with hydroxyapatite, fluoride and xylitol were studied with scanning electron microscopy and X-ray photoelectron spectroscopy. Enamel of just erupted teeth is not mineralized and therefore has insufficient resistance to caries. There are reliable changes in the content of carbon, fluorine, silicon and calcium, Ca/P ratio in superficial layer of immature enamel of permanent teeth under the influence of cream with hydroxyapatite and fluoride. Increased mineralization of the enamel of just erupted permanent teeth under the influence of cream with hydroxyapatite and fluoride was confirmed by scanning electron microscopy method. Optimal level of mineralization, achieved under the influence of cream with hydroxyapatite and fluoride occurs after 12 months of use at experimental conditions.
Ключевые слова: Эмаль, постоянные зубы, минерализация, гидроксиапатит, фторид, профилактика кариеса.
Keywords: Enamel, permanent teeth, mineralization, hydroxyapatite, fluoride, caries prevention.
Анализ многолетнего опыта функционирования программ профилактики основных стоматологических заболеваний в развитых странах указывает на преимущества и перспективы этого направления стоматологии, особенно
среди детского контингента [1,2]. Недостаточное внимание или пренебрежение достижениями первичной профилактики является причиной высоких распространенности и интенсивности кариеса зубов у детей разных регионов
Украины [3,4]. Это может быть связано с недостаточным уровнем знаний врачей об ассортименте и эффективности средств и методов профилактики, отсутствием опыта и комплексного индивидуального подхода к проведению профилактических мероприятий [4].
Поэтому проблемам разработки и оценки эффективности новых средств профилактики кариеса, в составе которой есть кальций, фосфор, фтор, магний и другие химические элементы уделяется значительное внимание [4-10]. Это в определенной мере решает вопрос выбора наиболее эффективных средств профилактики среди имеющихся на стоматологическом рынке.
Заслуживают внимания новые комплексные средства экзогенной профилактики кариеса зубов, которые одновременно содержат в своем составе кальций, фтор и другие элементы ("MI Paste", GC; "Remin Pro", VOCO; "Zuremin CaPF", JenDental и т.п.) [4,8, 11-15]. Раньше одновременное сочетание кальция и фтора было невозможно из-за взаимной инактивации в результате быстрого образования слаборастворимого фторида кальция [16].
Поэтому особенно актуальным является изучение влияния таких средств экзогенной профилактики кариеса на эмаль постоянных зубов в период интенсивной вторичной минерализации с помощью новейших методов исследования.
Цель исследования - изучение in vitro изменений химического состава и морфологической структуры поверхностного слоя эмали постоянных зубов, которые только что прорезались, под воздействием крема с содержанием гидроксиапатита, фторида (1450 ррм) и ксилита.
Материалы и методы исследования. Для проведения исследования было использовано 25 образцов эмали постоянных зубов, которые прорезались в одинаковый срок.
Образцы эмали получали из постоянных зубов, которые были удалены по ортодонтическим показаниям (премоляры 11-13 летних детей, не позже 6 месяцев после прорезывания). Сразу после удаления корни зубов отрезали на уровне эмалево-цементного соединения и удаляли остатки мягких тканей. Коронарные сегменты очищали при помощи ультразвука и полировочной пасты и щетки.
5 образцов эмали служили группой контроля в начале исследования. Остальные 20 образцов были произвольно распределены поровну на две группы. Они были размещены в двух отдельных герметичных боксах (по 10 образцов в боксе), которые были заполнены искусственной слюной (T.Fusayama, 1975). В дальнейшем образцы эмали первой группы обрабатывали кремом на водной основе "Remin
Pro" (активные компоненты - гидроксиапатит, фторид (1450 ррм), ксилит) (VOCO, Германия). Образцы второй группы служили контролем, их ничем не обрабатывали. Обработку образцов проводили в начале исследования, через 3, 6 и 9 месяцев курсами по 10 дней, дважды на день по 3 минуты согласно рекомендациям производителя.
Образцы эмали для дальнейших исследований срезали с вестибулярной и оральной поверхностей коронковой части зубов с помощью алмазного диска толщиной 0,2 мм под струей воды, очищали при помощи ультразвука, обезжиривали и вакуумировали. Поверхность образцов не напыляли для максимальной достоверности результата. Исследования поверхностного слоя эмали проводили в начале эксперимента, через 6 и 12 месяцев в 2 этапа.
Поверхность образцов сначала исследовали с помощью вторичного электронного метода в сканирующем электронном микроскопе (SEM, INCA PENTA FETx3, Oxford Instruments, Co., UK) с увеличением от 200 до 5000. На втором этапе определяли количественный химический состав поверхностного слоя эмали методом рентгенфотоэлек-тронной спектроскопии (X-ray, EDS) с помощью Оже-ми-крозонда JAMP - 9500F (Field Emission Auger Microprobe) аппарата JEOL JSM 5310LV (Япония). Для каждого образца проводили анализ в 5-7 точках поверхности. Результаты вычисляли в массовых процентах. Исследования выполнены в отделе физико-химических исследований материалов (заведующий отдела - академик НАН Украины Г.М. Григоренко) Института электросварки имени Е.О. Патона НАН Украины. Особенная благодарность высказывается ответственному научному сотруднику отдела Л.М. Капи-танчуку.
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием программ МЕДСТАТ. Учитывали среднюю арифметическую (М) и стандартную погрешность средней арифметической (m). Достоверность отличий средних величин оценивали с использованием t -критерия Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение. Результаты исследования химического состава поверхностного слоя незрелой эмали постоянных зубов методом рентгенфото-электронной спектроскопии представлены в табл. 1.
Результаты исследования свидетельствуют о том, что наиболее представленными химическими элементами эмали являются кислород (O), кальций (Ca), фосфор (P) и углерод (C). Также было выявлено 6 элементов, количество которых превышало 0,01 % массовых: азот (N), натрий (Na), магний (Mg), фтор (F), хлор (Cl) и кремний (Табл. 1).
Таблица 1.
Изменения химического состава поверхностного слоя незрелой эмали постоянных зубов под воздействием крема,
содержащего гидроксиапатит, фторид (1450 ррм) и ксилит
Группа и время исследования Содержание химических элементов (% массовые)
C O F Na Mg P Cl Ca Si N Ca/P
Начало исследования 8,22± 0,73 54,09± 6,08 0,1± 0,03 0,58± 0,07 0,21± 0,04 14,83± 0,41 0,46± 0,08 20,47± 1,07 0,02± 0,006 1,02± 0,25 1,38± 0,08
Группа 1 (Remin Pro) 6 месяцев 5,22± 0,63** 48,79± 6,12 1,34± 0,17** 0,39± 0,06** 0,25± 0,03 16,18± 0,52 0,6± 0,07 26,37± 1,12** 0,04± 0,01 0,82± 0,11 1,63± 0,03**
Группа 1 (Remin Pro) 12 месяцев 5,35± 0,51** 46,15± 5,11 2,03± 0,18** 0,4± 0,05** 0,29± 0,03 16,12± 0,43 0,490,04 28,21± 0,9** 0,05± 0,01* 0,91± 0,14 1,75± 0,04**
Группа 2 (контроль) 6 месяцев 8,06± 0,57 53,37± 4,97 0,11± 0,01 0,56± 0,05 0,25± 0,02 14,98± 0,41 0,43± 0,05 21,12± 0,84 0,02± 0,006 1,1± 0,15 1,41± 0,04
Группа 2 (контроль) 12 месяцев 7,23± 0,51 53,59± 5,12 0,13± 0,01 0,54± 0,06 0,22± 0,01* 15,12± 0,53 0,45± 0,06 21,62± 0,71 0,03± 0,007 1,07± 0,17 1,43± 0,05
* - достоверность отличий (р<0,05) в сравнении с начальным уровнем
* - достоверность отличий (р<0,05) в сравнении с контрольной группой в аналогичные сроки эксперимента
В течение всего эксперимента под воздействием исследуемого крема в поверхностном слое незрелой эмали постоянных зубов происходят достоверные изменения содержания углерода, фтора, натрия, кремния и кальция, а также соотношения кальций/фосфор.
Содержание кальция в поверхностном слое эмали в начале исследования равнялось 20,47±1,07. Достоверные изменения количества кальция в образцах эмали постоянных зубов были получены в группе 1 (Remin Pro) после 6-и и 12-и месяцев эксперимента. Уровень кальция в исследуемых образцах группы 1 (Remin Pro) вырос, соответственно, до 26,37±1,12 (28,8 %) и 28,21±0,9 (р<0,05). Содержание кальция в поверхностном слое эмали в группе 2 (контроль) достоверно не изменялось и равнялось 21,12±0,84 после 6-ти месяцев и 21,62±0,71 через 12-ь месяцев (р>0,05).
Установлено достоверное снижение содержания углерода в образцах эмали группы 1 (Remin Pro). Количество углерода в эмали образцов в начале эксперимента равнялось 8,22±0,73. После 6-и месяцев эксперимента в образцах эмали группы 1 (СаРМ§;Х) содержание углерода достоверно уменьшилось до 5,22±0,63 (36,5 %), после 12-и месяцев - до 5,35±0,51 (34,9%). В группе контроля уровень углерода в аналогичные периоды постепенно уменьшался - 8,06±0,57 (1,9%) и 7,23±0,51 (12,04%) - однако результаты были статистически недостоверными (р>0,05).
Результаты исследования доказывают достоверное повышение содержания фтора в образцах эмали постоянных зубов в группе 1 (Remin Pro) на протяжении 12-и месяцев исследования. Количество фтора в эмали образцов этой группы после 6-и месяцев эксперимента равнялось 1,34±0,17, через 12-ь месяцев - 2,03±0,05, что было достоверно выше начального уровня (0,1±0,03) и показателей группы контроля - 0,11±0,01 и 0,13±0,01 - в аналогичные периоды (р<0,05).
Количество натрия в образцах эмали группы 1 (Remin Pro) после 6-и (0,39±0,06) и 12-и месяцев эксперимента (0,4±0,05) было достоверно выше начального уровня (0,58±0,07) и соответствующих показателей группы 2 (контроль) - 0,56±0,05 и 0,54±0,06 (р<0,05).
Было установлено, что количество кремния достоверно увеличилось в образцах эмали группы 1 (Remin Pro) после 12-и месяцев эксперимента (0,05±0,01) в сравнении с начальным уровнем (р<0,05).
Значение коэффициента кальций/фосфор в начале эксперимента в группе контроля составляло 1,38±0,08, что подтверждает существующие данные о недостаточном уровне минерализации эмали постоянных зубов, которые только что прорезались [7,8,16,17]. Под воздействием исследуемого крема уровень минерализации образцов эмали в группе 1 (Remin Pro) вырос через 6-ь месяцев до 1,63±0,03 и через 12-ь месяцев до 1,75±0,04 (р<0,05). В группе контроля соответствующие результаты были достоверно меньшими - 1,41±0,04 (13,5%) через 6-ь месяцев и 1,43±0,05 (18,3%) через 12-ь месяцев исследования (р<0,05).
Следовательно, исследование поверхностного слоя незрелой эмали методом рентгенфотоэлектронной спектроскопии установило достоверное увеличение количества кальция, фтора и коэффициента кальций/фосфор и снижение количества углерода после 12-и месяцев применения крема, который содержит гидроксиапатит, фторид (1450 ррм) и ксилит. Эти результаты по данным разных авторов [17,18] могут указывать на повышение кариесрезистентности эмали. Под воздействием исследуемого средства эмаль постоянных зубов, которые только что прорезались, может достичь высокого уровня минерализации (>1,67) после 12-и месяцев применения. Низкий уровень минерализации поверхностного слоя эмали в группе контроля может свидетельствовать о недостаточном уровне кариесрезистентности даже через 12-18 месяцев после прорезывания.
Повышение уровня минерализации эмали постоянных зубов, которые только что прорезались, под воздействием исследуемого крема подтверждалось данными сканирующей электронной микроскопии (Рис.1-3). На электронных микрофотографиях под разным увеличением наблюдались изменения структуры поверхности эмали в группе 1 (Remin Pro) уже после 6-и месяцев эксперимента в сравнении с группой 2 (контроль). На поверхности образцов
незрелой эмали четко прослеживаются перикиматы (линии Ретциуса), на границе которых отмечается выход эмалевых призм аркадоподобной формы, поверхность эмали тусклая, шершавая (Рис. 1а, 2а). Это свидетельствует о низком уровне минерализации поверхностного слоя эмали, отсутствии защитного слоя на поверхности, высокой проницаемости незрелой эмали, наличии условий для дополнительной ретенции микроорганизмов. Приведенные факторы предопределяют низкую кариесрезистентность незрелой эмали и высокий риск уязвимости относительно
кариеса в период вторичной минерализации.
Через 12-ь месяцев в группе контроля перикиматы сглаживаются, эмаль остается матовой, шершавой, наблюдается значительное количество углублений, которые указывают на место выхода эмалевых призм (Рис. 1Ь,2Ь). Отмеченные изменения могут указывать на то, что на поверхности незрелой эмали происходит отложение слоя минеральных веществ. Однако учитывая количество царапин и кратеров, возможно сделать вывод о низкой степени минерализации и малой толщине данного слоя.
Рис. 1. Поверхность незрелой эмали постоянных зубов: а - в начале исследования, b - через 12-ь месяцев в группе контроля, c - под воздействием крема с гидроксиапатитом и фторидом через 6-ь месяцев, d - под воздействием крема с гидроксиапатитом и фторидом через 12-ь месяцев (SEM,
х500).
Через 6-ь месяцев после обработки образцов незрелой эмали исследуемым кремом перикиматы сглаживаются, эмаль становится блестящей (Рис. 1с, 2с). После 12-и месяцев эксперимента в группе 1 (Remin Pro) поверхность становится более блестящей и неоднородно рельефной, даже в сравнении с результатом предыдущего периода (6-ь месяцев). Места выхода эмалевых призм на поверх-
ность не визуализируются (Рис. Ы, 2ф. Данные изменения поверхности эмали в течение эксперимента могут быть предопределены постепенным откладыванием на поверхности эмали защитного слоя минеральных веществ, который способствует полноценной минерализации, ведет к уменьшению количеству ретенционных пунктов и снижению проницаемости эмали.
Рис. 2. Поверхность незрелой эмали постоянных зубов: а - в начале исследования, b - через 12-ь месяцев в группе контроля, c - под воздействием крема с гидроксиапатитом и фторидом через 6-ь месяцев, d - под воздействием крема с гидроксиапатитом и фторидом через 12-ь месяцев (SEM,
Х2000).
При увеличении в 5000 раз установлена более детальная разница в месте выхода на поверхность эмалевых призм после 12-и месяцев эксперимента (Рис. 3). На поверхности незрелой эмали в начале исследования отмечается значительное количество кратеров малой глубины. Дно крате-
ров шероховатое (Рис. 3а). Через 12-ь месяцев в группе контроля количество незакрытых кратеров значительно уменьшается, кратеры становятся визуально глубже (Рис. 3в).
Рис. 3. Поверхность незрелой эмали постоянных зубов : а - в начале исследования, b - через 12-ь месяцев в группе контроля, c - под воздействием крема с гидроксиапатитом и фторидом через 6-ь месяцев, d - под воздействием крема с гидроксиапатитом и фторидом через 12-ь месяцев (SEM,
Х5000).
Под воздействием исследуемого крема после 6-и месяцев исследования поверхность эмали становится более однородной и гладкой, наблюдаются одиночные кратеры с визуальными признаками частичного сглаживания дна (Рис.
3в). Через 12-ь месяцев кратеры выхода эмалевых призм не визуализируются, поверхность покрыта рельефным блестящим слоем вещества. Это может свидетельствовать об откладывании и длительном сохранении на поверхности
эмали слоя минеральных соединений, даже после механической и ультразвуковой очистки поверхности при подготовке образцов, поддержании условий для полноценной минерализации и росте кариесрезистентности.
Выводы. Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что эмаль зубов, которые только что прорезались, является недостаточно минерализованной и, соответственно, имеет недостаточный уровень кариесрезистентности. Химический состав и структура поверхностного слоя эмали зубов, которые только что прорезались, изменяется под воздействием крема, который содержит гидроксиапатит, фторид и ксилит. Достижение высокого уровня минерализации под воздействием исследуемого крема происходит в условиях эксперимента после 12-ь месяцев применения. Следовательно, комплексные средства экзогенной профилактики кариеса зубов, которые содержат гидроксиапатит, фторид (1450 ррм) и ксилит имеют преимущество в повышении уровня минерализации эмали и могут быть рекомендо-ванны для клинического применения (согласно инструкции) сразу после прорезывания постоянных зубов на период не менее двенадцати месяцев (2-4 курса в год по 10 дней, дважды в день по 3 минуты min).
Список литературы:
1. Савичук Н.А. Анализ программ профилактики основных стоматологических заболеваний в развитых странах / Н.А. Савичук, О.В. Клитинская // Современная стоматология. - 2014. - №4. - С. 66 - 68.
2. Савичук Н.О. Стан та перспективи запроваджен-ня заходiв масово! профшактики стоматолопчних захво-рювань дитячого населення, в тому чист в оргашзованих дитячих колективах / Н.О. Савичук, Л.О.Хоменко // Современная стоматология. - 2012. - № 3(62). - С. 151 -153.
3. Хоменко Л. О. Стоматолопчне здоров'я дггей Украши, реальшсть, перспектива // Науковий в^ник На-щонального медичного Ушверситету iменi О. О. Бого-мольця. - 2007. - №4. - С. 11 - 14.
4. Лобовкина Л.А. Роль фторсодержащих препаратов в профилактике стоматологических заболеваний / Л.А. Лобовкина, А.М. Романов // Современная стоматология. -2013. - № 2. - С. 9-10.
5. Хоменко Л. О. Контроль над карieсом зуба: еволю-щя концепцп / Л.О.Хоменко, Н. В. Бщенко, О.1. Остапко, [та ш.] // Стоматология: от науки к практике. - 2013. - №1. - С. 53-65.
6. Садовский В. В. Клинические технологии блокирования кариеса. М.: Медицинская книга, 2005.- 74 С.
7. Окушко В. Р. Профилактика кариеса: поиск путей
повышения эффективности / В. Р. Окушко // Клиническая стоматология. - 2011. - N 4 (60). - С.4-6.
8. Попруженко Т.В. Профилактика кариеса зубов с использыванием средств, содержащих фториды, кальций и фосфаты: учеб.- метод. пособие / Т.В. Попруженко, М.И. Кленовская. - Минск: БГМУ - 2010. - 258 С.
9. Федоров Ю. А. Клинические возможности применения современных реминерализирующих составов у взрослых // Ю. А. Федоров, В.А.Дрожжина, С.К. Матело, С.А. Туманова / Клиническая стоматология. - №3(47). -2008. -- С. 32 - 34.
10. Reich E. Профилактика кариеса сегодня / Е. Reich // Новое в стоматологии. - 2011. - № 6 (178). - С.6-15.
11. Espinosa R. Efecto de los Sistemas Fluorados en la Remineralizacion de las Lesiones Cariosas Incipientes del Esmalte, Estudio In Situ. Fluoride Systems Effect on Incipient Carious Enamel Lesions Remineralization, In Situ Study / R. Espinosa, R. Bayardo, A. Mercado [et al.] // Revista de Operatoria dental y biomateriales. - 2014. - V.3 - N.1. - P.14-21.
12. Gavrila L. Comparative Study Regarding the Effect of Different Remineralizing Products on Primary and Permanent Teeth Enamel Caries Lesions / L. Gavrila, Maxim A., Balan A. [et al.] // Revista de Chimie. - 2015. - V. 66. - N. 8. - P. 11591161.
13. Kamath U. The effect of Remin Pro® on bleached enamel hardness: An in-vitro study / U.Kamath, H. Sheth, D. Mullur, M. Soubhagya // Indian.J.Dent.Res. - 2013. - V.24. - P. 690-693.
14. Pulido M.T. The inhibitory effect of MI paste, fluoride and a combination of both on the progression of artificial carieslike lesions in enamel / M.T.Pulido, J.S.Wefel, M.M.Hernandez [et al.] // Oper. Dent. - 2008 Sep-Oct. - V. 33(5). - P. 550-555.
15. Cochrane N.J. Enamel subsurface lesion remineralisation with casein Phosphopeptide estabilised solutions of calcium, phosphate and fluoride / N.J.Cochrane, S. Saranathan, F. Cai [et al.] //Caries Res. 2008;42(2):88-97.
16. Современные средства экзогенной профилактики заболеваний полости рта / [Хоменко Л. А., Биденко Н. В., Остапко Е. И., Шматко В. И.] - К.: Книга плюс, 2001. - 208 с.
17. Боровский Е.В. Биология полости рта / Е.В. Боровский, В.К. Леонтьев. - М.: Медицина, Н. Новгород: Изд-во НГМА, 2001. - 304 с.
18. 1шутко 1.Ф. Вплив хiмiчних елементав на структуру i властивосл емалi (огляд лиератури) / 1.Ф. 1шутко // Стоматология: от науки к практике. - 2014. - №1(2). - С. 29-37.
DIVERSE KERATINOCYTE EXPRESSION OF TLR2, HBD-1 AND HBD-2 IN ROSACEA
O.A. Svitich
professor, MD, PhD, Mechnikov research Institute of vaccines and sera, Moscow
L.V. Gankovskaya professor, MD, PhD
Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow
I.V. Khamaganova professor, MD, PhD
Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow
O.L. Novozhilova
doctor, Moscow scientific & practical centre for dermatovenereology & cosmetology
ABSTRACT
the objective of the study was the complex analysis of indicators of innate immunity of the keratinocytes in healthy persons and patients with rosacea. The participants: 35patients with rosacea aged 21- 72 years old, including 8 men, 27 women. The entry criteria were erythematotelangiectatic & papulopustular subtype of rosacea. The exclusion criteria were pregnancy, breast-feeding and proved malignancies. Results: The statistically significant difference was revealed in the gene expression in rosacea patients in comparison with healthy subjects. The expression of Toll-like receptor 2(TLR2) gene in keratinocytes patients with rosacea without Demodex both in healthy and pathological areas observed a significant decrease in gene expression of TLR2. In patients with rosacea and Demodex expression of TLR2 did not drop as critical. Expression of hBD-1 in keratinocytes of patients with rosacea without Demodex expression level of defensin decreased. In patients with Demodex and rosacea level of gene expression of Human beta defensin-1 (hBD-1) was reduced significantly. The indicator gene expression of Human beta defensin-2(hBD- was reduced significantly in different groups as well. Conclusion: the innate immunity in rosacea patients differs significantly from the innate immunity in healthy subjects.
Keywords: rosacea, innate immunity of the keratinocytes, antimicrobial peptides, beta- defensins.
Анализ многолетнего опыта функционирования программ ^^reduction
Rosacea is a common inflammatory facial skin disease, characterized by erythema, telangiectasia, papules and pustules. Rosacea often begins with flushing and progresses to persistent redness and the appearance of visible blood vessels. [1,2].The 4 major clinical subtypes of rosacea are generally applicable: erythematotelangiectatic rosacea, papulopustular rosacea, phymatous rosacea, and ocular rosacea. Steinhoff M et al.[3] emphasized that it needed to be elucidated whether these subtypes develop in a consecutive serial fashion or if any subtypes might occur individually as part of a syndrome. Because rosacea often affects multiple family members, a genetic component is also suspected, but the genetic basis of rosacea remains unclear. During disease manifestation and early stage, the innate immune system and neurovascular dysregulation seem to be driving forces in rosacea pathophysiology. Dissection of major players for disease progression and in advanced stages is severely hampered by the complex activation of the innate and adaptive immune systems, enhanced neuroimmune communication, profound blood vessel and possibly lymphatic vessel changes, and activation of almost every resident cell in the skin. [3] . Many mechanisms interact with the cutaneous innate immune system that may be operative. A variety of potential triggers stimulate this immune detection system which is upregulated and hyper-responsive in facial skin of patients with rosacea as compared to normal skin. The presence of a microbial organism is not a primary or mandatory component of the pathogenesis of rosacea. [4] Skin sample analysis showed a higher expression of genes encoding pro-inflammatory cytokines (Il-8, Il- 1b, TNF-a) and inflammasome-related genes (NALP-3 and CASP-1) in rosacea, especially PPR. Overexpression of LL-37 and VEGF, as
well as CD45RO, MPO and CD163, was observed, indicating broad immune system activation in patients with rosacea. [5] Recent molecular studies suggest that an altered innate immune response is involved in the pathogenesis of the vascular and inflammatory disease seen in patients with rosacea. These findings may help explain the benefits of current treatments and suggest new therapeutic strategies helpful for alleviating this disease.[6] Several molecular features of its inflammatory process have been identified: an overproduction of Toll-Like receptors 2, of a serine protease, and of abnormal forms of cathelicidin. The two factors which stimulate the Toll-like receptors to induce cathelicidin expression are skin infection and cutaneous barrier disruption: these two conditions are, at least theoretically, fulfilled by Demodex, which is present in high density in PPR and creates epithelial breaches by eating cells. [1]Keratinocytes are an immunological barrier against infection. Together with lymphoid tissue they participate in the innate immune system by performing the following functions: 1) removal of large particles and microorganisms, 2) recognition pathogens through pattern recognition receptors -TLRs, 3), the secretion of inflammatory mediators cytokines and antimicrobial peptides.[7].hBD-1 is constitutively expressed in keratinocytes, but exhibits only minor antibiotic killing activity in comparison with other defensins[8,9]. The reduced form of hBD-1 was shown to become a potent antimicrobial peptide, of which reduction was catalyzed by thioredoxin expressed in the epidermis [10] .This suggests that the redox regulation is crucial for the innate immune protection by hBD-1. Elevated hBD-2 expression in human keratinocytes exposed to pathogenic bacteria was described[7]Gallo RL and Nakatsuji T highlighted that our resident commensal microbes produced their own AMPs, act to enhance the normal production of AMPs by keratinocytes, and were beneficial to maintaining inflammatory
homeostasis by suppressing excess cytokine release after minor epidermal injury.[11] These observations indicate that the normal human skin microflora protects skin by various modes of action, a conclusion supported by many lines of evidence associating diseases such as acne, atopic dermatitis, psoriasis, and rosacea with an imbalance of the microflora even in the absence of classical infection.
The objective of the study was the complex analysis of indicators of innate immunity of the keratinocytes in healthy persons and patients with rosacea. We evaluated TLR2, hBD-
1 and hBD-2 expression at the mRNA levels in keratinocytes from patients with rosacea.
Material & methods 35 patients with rosacea aged 21- 72 years old, including 8men, 27 women were examined in the Moscow Research and Practical Center for Dermatovenereology and Cosmetology.
2 patients had erythematotelangiectatic subtype of rosacea, in 1 patient D. folliculorum was detected, in 1 - was not detected.15patients had papulopustular subtype of rosacea, in 9 patients D. folliculorum was detected, in 6 - was not detected.
6 healthy subjects aged 30- 39 years old were examined.
Samples of keratinocytes from patients were collected using swabs that were placed into vials containing 1 ml of polymerase chain reaction (PCR) transport medium and kept at - 200C until being processed for gene expression by PCR (see below).
Isolation of RNA and RT- PCR Analysis
Total RNA was isolated from keratinocytes by using anRNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany) and kit "RIBO-sorb" (ILS, Russia) according to the manufacturer's instructions. For cDNA synthesis, 2 ^l of total RNA was combined with random primers (Syntol, Russia) and reverse primers for the target genes (T2rev, B1rev, B2rev). The mix was heated to 75oC for 3 min and then quick-chilled on ice; 3 ^l of 10X Reverse Transcriptase Buffer (SibEnzime, Russia), 2 ^l of 2.5mM dNTP (SibEnzime, Russia) and 10 ^l of M-Multi Reverse Transcriptase (SibEnzime, Russia) were added to the mix (final volume of 30 ^l). Afterwards, the mix was kept at 37oC for 60 min and at
95oC for 10 min. [12,13]
For quantitative analysis, real-time PCR was performed, using a SYBR Green Kit for qRT-PCR (Syntol, Russia), according to the manufacturer's instructions. The primers and probes for the real-time PCR were synthesized by Syntol (Russia). The PCR reactions were carried out at 50°C for 2 min, 95°C for 2 min, followed by 40 cycles at the primer-specific annealing temperature (60°C) for 50s and 95°C for 20s. The mRNA expression levels of the target genes were normalized with the expression of the housekeeping gene ^-actin[14] Statistical analysis
Statistical differences of the gene expression levels were determined by using a Mann-Whitney U test. p < 0.05 was considered to be statistically significant. The results are shown as the mean ± SEM. Results
We applied an analytical approach in order to evaluate the innate immunity of the skin. It included the definition of gene expression of the receptors - TLR2 and antimicrobial peptides hBD1 and hBD2. Thus, we have shown that the keratinocytes of the skin of donors expresses genes of the innate immunity TLR2, hBD1 and hBD2.
The statistically significant difference was revealed in the gene expression in rosacea patients in comparison with healthy subjects.
The expression of TLR2 gene in keratinocytes in the group of healthy subjects was 16489+/-3553 copies of the TLR2 gene (relative to the expression of actin). In the group of patients with rosacea without Demodex both in healthy and affected areas observed a significant decrease in gene expression of TLR2.(Fig.1)
Expression of hBD-1 in keratinocytes of healthy subjects was 92943+/-27645 number of copies of the test gene. In patients with Demodex and rosacea level of gene expression of hBD-1 was reduced more critical than in patients without Demodex.(Fig.2)
The level of gene expression of hBD-2 reduced both in patients with Demodex and rosacea and in patients without Demodex and rosacea.(Fig3)
Fig.1. The expression of TLR2 gene in healthy subjects, healthy and pathologic areas in patients with rosacea & demodicosis
