CC BY
9
Абсолютная биодоступность соединения, обладающего кардиопротективной активностью (АЛМ-802), у крыс
Колыванов Г. Б., Бочков П. О., Литвин А. А., Шевченко Р. В., Подолько А. Л., Жердев В. П.
ФГБНУ«НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», Москва, Россия
Аннотация. На крысах изучена фармакокинетика нового потенциального кардиопротективного средства АЛМ-802 после однократного внутривенного и внутрижелудочного введения в дозах 10 и 100 мг/кг, соответственно. Абсолютная биодоступность составила 4,45 %, что говорит о потенциальной возможности разработки лекарственной формы для приёма внутрь.
Ключевые слова: кардиопротектор; АЛМ-802; доклиническая фармакокинетика; ВЭЖХ-масс-спектрометрия; абсолютная биодоступность Для цитирования:
Колыванов Г. Б., Бочков П. О., Литвин А. А., Шевченко Р. В., Подолько А. Л., Жердев В. П. Абсолютная биодоступность соединения, обладающего кардиопротективной активностью (АЛМ-802), у крыс. Фармакокинетика ифармакодинамика. 2021;(2):31-35. https://doi.org/10.37489/2587-7836-2021-2-31-35 Поступила: 18 июля 2021 г. Принята: 13 августа 2021 г. Опубликована: 10 ноября 2021 г.
Absolute bioavailability of a substance with cardioprotective activity (ALM-802) in rats
Kolyvanov GB, Bochkov PO, Litvin AA, Shevchenko RV, Podolko AL, Zherdev VP FSBI "Zakusov Institute of Pharmacology", Moscow, Russia
Abstract. The pharmacokinetics of a new potential cardioprotective agent ALM-802 was studied in rats after single intravenous and intragastric administration at doses of 10 and 100 mg/kg, respectively. The absolute bioavailability was 4.45 %, which indicates the potential for the development of a dosage form for oral administration.
Keywords: cardioprotector; ALM-802; preclinical pharmacokinetics; HPLC-mass spectrometry; absolute bioavailability
For citations:
Kolyvanov GB, Bochkov PO, Litvin AA, Shevchenko RV, Podolko AL, Zherdev VP. Absolute bioavailability of a substance with cardioprotective activity (ALM-802) in rats. Farmakokinetika i farmakodinamika. 2021;(2):31-35. (In Russ). https://doi.org/10.37489/2587-7836-2021-2-31-35 Received: July 18, 2021. Accepted: August 13, 2021. Published: November 10, 2021
Введение / Introduction
В ФГБНУ «НИИ фармакологии имена В.В. Закусова», в результате исследований в ряду а,ю-диарилметильных производных бис-(ю-аминоалкил) аминов было выявлено соединение N1-(2,3,4-триметоксибензил)-М2-{2-[(2,3,4-триметоксибензил) амино]этил}-1,2-этандиамина (в виде тригидрохло-рида) с рабочим шифром АЛМ-802, которое по своей кардиопротективной активности, изученной на животных с интактным сосудистым руслом, как минимум, не уступает эталонному препарату триметазидину [1].
Цель данного исследования — методом ВЭЖХ-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС) изучить фармакокинети-ку АЛМ-802 в плазме крови крыс после однократного внутривенного (в/в) и внутрижелудочного (в/ж) введения и определить его абсолютную биодоступность.
Методика исследования / Method of research
Исследование проведено на половозрелых беспородных крысах-самцах с массой тела 180—220 г. Животные содержались в лабораторном виварии при 20—22 °С, относительной влажности воздуха 45—65 %, имели свободный доступ к корму и воде. Эксперименты проводили в соответствии с решением Совета Евразийской экономической комиссии от 3 ноября
2016 г. № 81 «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики Евразийского экономического союза в сфере обращения лекарственных средств».
Изучение фармакокинетики соединения АЛМ-802 в плазме крови крыс проводили после в/в введения раствора (в воде дистиллированной с добавлением 1 капли полисорбата (твина 80) фармацевтической субстанции в дозе 10 мг/кг. Также исследуемое вещество вводили в/ж с помощью зонда в виде суспензии в 1 % крахмальном клейстере в дозе 100 мг/кг. Для определения абсолютной биодоступности АЛМ-802 пробы крови отбирали до введения вещества (контроль) и через 0,08; 0,17; 0,34; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 8; 12 ч после в/в введения и при в/ж введении — контроль и через 0,25; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 8; 12 ч. Анализу подвергали надосадочную жидкость, полученную после добавления к аликвоте плазмы крови 3-кратного объёма ацетонитрила и последующего центрифугирования. Количественное определение соединения АЛМ-802 проводили с использованием метода тан-демной ВЭЖХ с масс-спектрометрией. В работе использовали жидкостной хроматограф «Thermo Ultimate 3000» («Thermo Scientific», США). Детектор — масс-спектрометр «Thermo TSQ Altis» («Thermo Scientific», США) (тип «тройной квадруполь») с ионизацией электрораспылением. Регистрацию масс-спектров проводили в режиме множественных молекулярных
31
ФАРМАКОКИНЕТИКА И ФШЩИШИКА
реакции по дочернему иону с отношением массы к заряду m/z = 181, полученному изолированием и фрагментацией нативного молекулярного иона с m/z = 464 (соответствует протонированному молекулярному иону соединения АЛМ-802), напряжение на электродах в коллизионной ячейке составляло 25 В. Напряжение на распылителе — 3500 В, температура интерфейса — 350 °C; температура ионного капилляра — 325 °C, параметры вспомогательных газов-распылителей задавались управляющей программой по умолчанию для потока 0,3 мл/мин.
Подвижная фаза состояла из компонента А (0,1 % раствор муравьиной кислоты в воде ультрачистой) и Б (к 50 мл воды ультрачистой прибавляли 1 мл муравьиной кислоты, полученный раствор доводили ацетонитрилом в мерном цилиндре до объёма 1,0 л). Растворы А и Б смешивали в соотношении 25:75. Полученную фазу перед использованием дегазировали на ультразвуковой бане.
Анализ выполняли на колонке «Agilent SB-phenyl» («Agilent», США) 2,1x100 мм с размером частиц 1,8 мкм. Температура термостата — 40 °C. Объём вводимой пробы 1 мкл. В этих условиях время удерживания соединения АЛМ-802 составило 1,7 мин. Нижний предел количественного определения — 1 нг/мл.
Исследование биотрансформации АЛМ-802 проводили в плазме крови, полученной через 1 и 2 ч после в/ж введения исследуемого вещества в дозе 100 мг/кг, и суточной моче крыс в сравнении с образцами ин-тактной плазмы крови и мочи крыс. В одну пробу добавляли ß-глюкуронидазу (Sigma-Aldrich, США), в другую — фермент не добавляли. На 0,1 мл плазмы крови добавляли 0,01 мл фермента, на 0,1 мл мочи — равный объём ß-глюкуронидазы. Пробы термоста-тировали на водяной бане при 37 °C в течение 1 ч. Далее проводили процедуру пробоподготовки. О наличии глюкуроноконъюгатов судили по изменению концентрации неизменённого соединения в образцах плазмы крови и мочи после обработки ферментом в сравнении с образцами, пробоподготовка которых не включала обработку ß-глюкоронидазой.
На основании полученных концентраций АЛМ-802 в плазме крови крыс модельно-независимым методом рассчитывали его основные фармакокинетические параметры:
AUC0^ (нг/млхч) — площадь под фармакокинети-ческой кривой (площадь под кривой «концентрация аналита — время») после в/ж или в/в введения.
AUC0^ рассчитывается от момента введения аналита до бесконечности;
Cmax (нг/мл) — максимальная концентрация лекарственного вещества (ЛВ) в плазме крови после в/ж введения;
Tmax (ч) — время достижения Cmax после в/ж введения;
C0 — кажущаяся Cmax ЛВ в плазме крови после в/в введения;
Cl, Cl/F (л/ч/кг) — общий плазменный клиренс; Vd, VyF (л/кг) — кажущийся объем распределения; kel (ч-1) — константа скорости элиминации; ti/2el (ч) — период полувыведения, MRT (ч) — среднее время удерживания ЛВ в организме;
1абс — абсолютная биодоступность, которую рассчитывали по формуле:
/бс = (AUCo^ в/ж xDв/в)/(AUCo^в/в xDв/ж) х 100 %, где AUC0^ в/ж — AUC после в/ж введения, AUC в/в — AUC после в/в введения, D в/в и D в/ж — доза соединения после в/в и в/ж введения, соответственно.
Результаты исследования / Results of the study
На рис. 1 представлены усреднённые фармакокинетические профили соединения АЛМ-802 в плазме крови крыс после однократного в/ж и в/в введения дозах 100 и 10 мг/кг, соответственно. Фармакокинетические параметры АЛМ-802 после различных путей введения представлены в табл. 1. Поскольку на каждую временную точку использовали по 5 животных, результирующая фармакокинетическая кривая была построена по усреднённым концентрациям, поэтому при расчётах фармакокинетических параметров отсутствует статистическая обработка результатов.
Анализируемое вещество после в/ж введения определялось в плазме крови на протяжении 12 ч. Снижение концентраций после достижения максимального значения носит монофазный характер. Как видно из рисунка 1, соединение АЛМ-802 быстро всасывается из
Рис. 1. Усреднённые фармакокинетические профили АЛМ-802 в плазме крови крыс после однократного внутрижелудочного (в/ж) и внутривенного (в/в) введения дозах 100 и 10 мг/кг (n = 5; M±m) Figure 1. Average pharmacokinetic profiles of ALM-802 in rat blood plasma after a single intragastric (IG) and intravenous (IV) administration at doses of 100 and 10 mg/kg (n = 5; M±m)
Таблица 1
Фармакокинетические параметры АЛМ-802 в плазме крови
крыс после однократного внутрижелудочного (в/ж) и внутривенного (в/в) введения субстанции АЛМ-802 в дозе 100 мг/кг и 10 мг/кг, соответственно
Table 1
Pharmacokinetic parameters of ALM-802 in rat blood plasma after a single intragastric (IG) and intravenous (IV) administration of ALM-802 substance at a dose of 100 mg/kg and 10 mg/kg, respectively
Параметр / Parameter Единицы Измерения / Dimensions Путь введения / Administration route
в/ж /IG в/в /IV
Со нг/мл - 15427,87
C max нг/мл 1064,79 -
T max ч 3,0 -
kel ч-1 0,2705 0,2194
AUC0_ нг/мл хч 4648,86 10448,45
tl/2el ч 2,6 3,2
MRT ч 4,9 4,6
Cl л/ч/кг - 0,957
Cl/F л/ч/кг 21,511 -
Vd л/кг - 4,361
Vd /F л/кг 79,52 -
fабс % 4,45
ЖКТ в системный кровоток и определяется в плазме крови уже через 15 мин. Максимальная концентрация (Cmax) АЛМ-802 в плазме крови (1064,79 нг/мл) достигалась через 3,0 ч (Tmax) после введения (см. табл. 1). Соединение АЛМ-802 достаточно медленно выводится из организма животных. Об этом свидетельствуют значения следующих фармакокинетических параметров: период полувыведения (t1/2el) исследуемого вещества составил 2,6 ч, а среднее время удерживания вещества в организме животных (MRT) — 4,9 ч.
Параметром, характеризующим степень проникновения ЛВ в ткани, является кажущийся объём распределения (Vd /F). Его величина для крыс составила 79,52 л/кг. Крайне высокое значение данного параметра указывает, что АЛМ-802 распределяется во всех жидких средах организма животных.
Фармакокинетика соединения АЛМ-802 после его в/в введения крысам существенно отличается от кинетики в/ж введения, прежде всего более высокими концентрациями неизменённого соединения (см. рис. 1). После в/в введения соединение АЛМ-802 так же как и в случае в/ж введения определяется в плазме крови на протяжении 12 ч. Из рис. 1 видно, что после в/в способа введения в плазме крови наблюдается двухфазное снижение концентраций исследуемого соединения. На протяжении первой фазы (с момента введения до 1 ч после введения) концентрация неизменённого со-
единения упала с 15 427,87 нг/мл (кажущаяся начальная концентрация — С0, т. е. концентрация АЛМ-802 в момент введения) до 907,26±183,72 нг/мл, т.е. в 17 раз. Терминальная часть фармакокинетической кривой была аналогична таковой после в/ж введения. Об этом свидетельствуют значения констант скорости элиминации (kel) (0,2194 и 0,2705 ч-1, соответственно). Такие фармакокинетические параметры, как t1/2el равный 3,2 ч и MRT — 4,6 ч, указывают на относительно длительное нахождение исследуемого вещества в системном кровотоке животных. Таким образом, полученные результаты по изучению фармакокинетики соединения АЛМ-802 позволяют заключить, что исследуемое ЛВ элиминирует из организма животных с невысокой скоростью и его можно отнести к группе «долгоживущих».
Абсолютная биодоступность (fa6) соединения АЛМ-802 после в/ж введения составила 4,45 %. Невысокую абсолютную биодоступность АЛМ-802 можно объяснить тем, что после в/ж введения соединение подвергается эффекту «первого прохождения» через печень с образованием глюкуроноконъюгированных метаболитов. В то же время после в/в введения этот эффект выражен в меньшей степени, и в плазме крови, в основном, регистрируется исходное соединение. В пользу этого утверждения говорят результаты изучения биотрансформации триметазидина. АЛМ-802 можно рассматривать как структуру, содержащую в своей молекуле двойной 2,3,4-триметоксибензиловый фрагмент триметазидина (рис. 2):
Метаболизм триметазидина в плазме крови и моче человека подробно описан [2, 3]. Одно из направлений биотрансформации заключается в образовании метаболитов за счёт деметилирования метоксигруппы
Рис. 2. Структурные формулы соединения АЛМ-802 и триметазидина
Figure 2. Structural formulas of ALM-802 and trimetazidine
2,3,4-триметоксибензиловой части молекулы тримета-зидина с последующей конъюгацией до О-глюкуронида и О-сульфата.
В тоже время нами были проведены исследования подтверждающие, что соединение АЛМ-802 после в/ж введения подвергается выраженному эффекту «первого прохождения» через печень с образованием глюку-роноконъюгированных метаболитов. Полученные результаты показали, что после обработки ферментом концентрация неизменённого соединения в образцах
плазмы крови выросла на 26—63%. В то же время в образцах суточной мочи, не обработанных ферментом, соединение АЛМ-802 обнаружено не было. После добавления к этим пробам в-глюкуронидазы регистрировались высокие концентрации АЛМ-802.
В результате проведённого исследования необходимо отметить, что абсолютная биодоступность соединения АЛМ-802 после в/ж введения, составившая 4,45 % говорит о потенциальной возможности разработки лекарственной формы для приёма внутрь.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Колыванов Геннадий Борисович
e-mail: 7822535@mail.ru
ORCID ID: https://orcid.org/0000-0002-2571-0047 SPIN-код: 2538-8639
д. б. н., в. н. с. лаборатории фармакокинетики ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Заку-сова», Москва, Россия
Kolyvanov Gennadiy B.
e-mail: 7822535@mail.ru
ORCID ID: https://orcid.org/0000-0002-2571-0047 SPIN code: 2538-8639
D. Sci. in Biology, Leading researcher of the laboratory of pharmacokinetics FSBI «Zakusov institute of Pharmacology», Moscow, Russia
Бочков Павел Олегович
е-mail: bok-of@yandex.ru
ORCID ГО: https://orcid.org/0000-0001-8555-5969
SPIN-код: 5576-8174
к. б. н., с. н. с. лаборатории фармакокинетики ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Заку-сова», Москва, Россия
Bochkov Pavel O.
е-mail: bok-of@yandex.ru
ORCID ID: https://orcid.org/0000-0001-8555-5969
SPIN code: 5576-8174
PhD in Biology, Senior Research Officer of laboratory pharmacokinetics FSBI «Zakusov institute of Pharmacology», Moscow, Russia
Литвин Александр Алексеевич Автор, ответственный за переписку
e-mail: litbiopharm@yandex.ru
ORCID ID: https://orcid.org/0000-0002-2818-3457
SPIN-код: 6193-5770
д. б. н., в. н. с. лаборатории фармакокинетики ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Заку-сова», Москва, Россия
Litvin Alexander A. Corresponding author
e-mail: litbiopharm@yandex.ru
ORCID ID: https://orcid.org/0000-0002-2818-3457
SPIN code: 6193-5770
D. Sci. in Biology, Leading researcher of the laboratory of pharmacokinetics FSBI «Zakusov institute of Pharmacology», Moscow, Russia
Шевченко Роман Владимирович
e-mail: rmn.shev@gmail.com
ORCID ID: https://orcid.org/0000-0003-4646-7733
SPIN-код: 1844-6202
к. м. н., н. с. лаборатории фармакокинетики ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Заку-сова», Москва, Россия
Shevchenko Roman V.
e-mail: rmn.shev@gmail.com
ORCID ID: https://orcid.org/0000-0003-4646-7733
SPIN code: 1844-6202
PhD in Medicine, Research Officer of laboratory pharmacokinetics FSBI «Zakusov institute of Pharmacology», Moscow, Russia
34
ФШКОШЕТШ И ФШЩШМШ
Подолько Анна Леонидовна
e-mail: podolko.a.l@gmail.com
ORCID ID: https://orcid.org/0000-0003-2418-8055
SPIN-код: 4707-3068
м. н. с. лаборатории фармакокинетики ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», Москва, Россия
Podolko Anna L.
e-mail: podolko.a.l@gmail.com
ORCID ID: https://orcid.org/0000-0003-2418-8055
SPIN code: 4707-3068
Junior Research Officer of laboratory pharmacokinetics FSBI «Zakusov institute of Pharmacology», Moscow, Russia
Жердев Владимир Павлович
e-mail: zherdevpharm@mail.ru
ORCID ID: https://orcid.org/0000-0003-2710-7134
SPIN-код: 2213-9592
д. м. н., профессор, заведующий лабораторией фармакокинетики ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», Москва, Россия
Zherdev Vladimir P.
e-mail: zherdevpharm@mail.ru
ORCID ID: https://orcid.org/0000-0003-2710-7134
SPIN code: 2213-9592
D. Sci. in Medicine, professor, Head of laboratory pharmacokinetics FSBI «Zakusov institute of Pharmacology», Moscow, Russia
Литература / References
1. Крыжановский С.А., Лихошерстов А.М., Цорин И.Б., Столя-рук В.Н., Вититнова М.Б., Мокров Г.В., Гудашева Т.А. Скрининг кардиотропной активности в ряду а,т-диарилметильных производных бис-(т-аминоалкил)аминов. Фармакокинетика и Фармакодинамика. 2016;(2):10-13. [Kryzhanovskii SA, Likhosherstov AM, Tsorin IB, Stolyaruk VN, Vititnova MB, Mokrov GV, Gudasheva TA. Screening of the compounds having cardiotropic activity among the a, m-diarilmetil derivatives of bis-
(a>-aminoalkyl)amines. Farmakokinetika i farmakodinamika. 2016;(2):10—13. (In Russ).].
2. Jackson PJ, Brownsill RD, Taylor AR. Identification of trimetazidine metabolites in human urine and plasma. Xenobiotica. 1996;26(2):221—228. DOI: 10.3109/00498259609046702.
3. Jeoung MK, Kim KS, Kim CS, Kim NH. An HPLC Determination of Trimetazidine in Human Plasma Using Liquid-Liquid Extraction for Sample Clean-Up. JLiq Chrom Relat Tech. 2005;28(9):1299-1309. DOI: 10.1081/JLC-200054785
35
ФАРМАКОКИНЕТИКА И ФШЩИШИКА
