CC BY
5
УДК 547.857.7; 616-006.66
7-Метилгуанин подавляет рост аденокарциномы толстой кишки in vivo
К. И. Кирсанов1,2, Т. И. Фетисов1, Е. Е. Антошина1, Т. Г. Горькова1, Л. С. Труханова1, С. И. Шрам3, И. Ю. Нагаев3, Ю. А. Золотарев3, Л. Або Кура1,2, В. С. Покровский1,2, М. Г. Якубовская1, В. К. Швядас45, Д. К. Нилов4*
Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина, Научно-исследовательский институт канцерогенеза, Москва, 115478 Россия 2Российский университет дружбы народов, Медицинский институт, Москва, 117198 Россия Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Москва, 123182 Россия 4Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, Москва, 119991 Россия 5Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, факультет биоинженерии и биоинформатики, Москва, 119234 Россия *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 08.05.2024 Принята к печати 26.06.2024 DOI: 10.32607/actanaturae.27422 РЕФЕРАТ 7-Метилгуанин (7-МГ) является природным ингибитором поли(ADP-рибозо)полимеразы 1 и тРНК-гуанинтрансгликозилазы, ферментативная активность которых важна для пролиферации опухолевых клеток. Недавно в ряде доклинических тестов была продемонстрирована безопасность 7-МГ и подобрана доза для внутрижелудочного введения мышам. В представленной работе исследована фармакологическая активность 7-МГ на мышах BALB/c и BALB/c nude с перевитой опухолью. Показано, что 7-МГ эффективно проникает в опухолевую ткань и подавляет рост аденокарциномы толстой кишки в модели Акатол, а также в ксенографтной модели с использованием клеток человека HCT116. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА 7-метилгуанин, ингибитор, поли(ADP-рибозо)полимераза 1, тРНК-гуанинтранс-гликозилаза, аденокарцинома толстой кишки, мыши BALB/c.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ в/б - внутрибрюшинное введение; в/ж - внутрижелудочное введение; 7-МГ -7-метилгуанин; ПАРП-1 - поли(ADP-рибозо)полимераза 1; ТГТ - тРНК-гуанинтрансгликозилаза.
ВВЕДЕНИЕ паратов, однако обладают серьезными побочными
7-Метилгуанин (7-МГ) является метаболитом нукле- эффектами (в частности, миелодиспластический
иновых кислот, который в малом количестве обна- синдром/острый миелоидный лейкоз) [8, 9]. В то же
руживается в крови и моче человека [1]. Изучение время природный ингибитор 7-МГ продемонстриро-
7-МГ как потенциального противоопухолевого инги- вал безопасность в проведенном нами токсикологи-
битора началось с работы по компьютерному скри- ческом исследовании; была подобрана доза для его
нингу природных азотистых оснований и их произ- введения мышам - 50 мг/кг внутрижелудочно (в/ж),
водных в отношении поли(ADP-рибозо)полимеразы 3 раза в неделю [10]. Наличие нескольких релевант-
1 (ПАРП-1) - ключевого фермента репарации ДНК ных мишеней (ПАРП-1, ТГТ) и безопасность 7-МГ
[2]. Моделирование продемонстрировало комплемен- обуславливают перспективность дальнейших in vivo
тарность 7-МГ к активному центру ПАРП-1, даль- исследований. В представленной работе впервые
нейшие in vitro исследования подтвердили предпо- описано противоопухолевое действие 7-МГ на мо-
ложение о конкурентном характере ингибирования делях аденокарциномы толстой кишки. [3-5]. 7-МГ также является ингибитором тРНК-
гуанинтрансгликозилазы (ТГТ) - фермента, уча- ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ствующего в механизме трансляции [6]. Показано, Мыши BALB/c (самцы, возраст 4 недели) были почто при нокауте/нокдауне гена ТГТ снижается про- лучены из разведения НМИЦ онкологии им. Н.Н. лиферация и миграция опухолевых клеток [7]. Блохина. Образец мышиной аденокарциномы Акатол Синтетические ингибиторы ПАРП-1 олапариб, [11] был получен из коллекции опухолей НМИЦ он-рукапариб и нирапариб используются в медицине кологии им. Н.Н. Блохина. Суспензию опухолевых в качестве инновационных противоопухолевых пре- клеток (0.5 мл, 0.1 г/мл) вводили подкожно в надло-
50 | ACTA NATURAE | ТОМ 16 № 2 (61) 2024
паточную область. Введение тестируемых веществ начинали на 5-й день после перевивки. Мышей разбивали на группы по 9 животных в каждой: контрольная группа I, вода (в/ж, 3 раза в неделю); группа II, цисплатин (2.5 мг/кг в/б, 2 раза в неделю в течение 1 недели); группа III, 7-МГ (50 мг/кг в/ж, 3 раза в неделю); группа IV, 7-МГ + цисплатин. Для приготовления суспензии 7-МГ (5 мг/мл) навеску вещества смешивали с дистиллированной водой, встряхивали на вортексе, после чего оставляли на 5 мин в ультразвуковой бане при температуре 45оС. Полученную суспензию 7-МГ вводили с помощью гастрального зонда. При комбинированном лечении 7-МГ вводили за 3 ч до цисплатина. После развития опухолевых узлов измеряли их объем по формуле: V = 1/2*длина*ширина2. Анализ результатов проводили по достижении среднего значения объема опухоли в контрольной группе 4000 мм3.
Фармакокинетический эксперимент проводили на самцах мышей BALB/c на 15-й день после перевивки опухоли Акатол. За 18 ч до проведения эксперимента мышей лишали доступа к корму. Животным однократно вводили 7-МГ (50 мг/кг в/ж) и затем производили забор крови и опухолевой ткани через 15 мин (2 мыши), 60 мин (2 мыши) и 180 мин (3 мыши). Полученные образцы замораживали и подвергали ли-офилизации, механическому измельчению и последовательной экстракции растворителями (90% водным раствором ацетонитрила, содержащим 2% трифто-руксусной кислоты, ацетоном и 0.1% водным раствором гептафтормасляной кислоты). Количественный анализ 7-МГ проводили с помощью хромато-масс-спектрометрического анализа на приборе LCQ Advantage MAX (Thermo Electron Co., США), оснащенного хроматографом Surveyor Plus и источником ионизации ESI. В качестве внутреннего стандарта использовали дейтерированный 7-МГ, полученный методом твердофазного изотопного обмена [12].
Иммунодефицитные мыши BALB/c nude (самки, возраст 6-7 недель) были получены из разведения лаборатории биохимических основ фармакологии и опухолевых моделей НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина. Суспензию опухолевых клеток человека HCT116 (0.2 мл, 1.2*106 кл/мл) вводили подкожно в правый и левый бок мыши. Введение тестируемых веществ начинали на 10-й день после перевивки. Мышей разбивали на группы по 4 животных в каждой: контрольная группа I, калий-фосфатный буфер (в/б, 3 раза в неделю); группа II, цисплатин (1 мг/кг в/б, 3 раза в неделю в течение 1 недели); группа III, 7-МГ (50 мг/кг в/ж, 3 раза в неделю); группа IV, 7-МГ + цисплатин. При комбинированном лечении 7-МГ вводили за 3 ч до цисплатина. Объем опухолевых узлов измеряли
по формуле V = л/бхдлина*ширинахглубина.
-•- I контроль -•- II цисплатин — III 7-МГ
-— IV 7-МГ + цисплатин
4500 4000 3 3500 3000
X
О 2500 х
С 2000 | 1500
V? 1000 О
500 0
Сутки после перевивки Рис. 1. Динамика роста аденокарциномы толстой кишки в модели Акатол
0.8
с о
<и
а
m
и
£ .0
со
0.6
0.4
0.2
\
ч
I контроль
II цисплатин
III 7-МГ
10 15 20 25 30 Сутки после перевивки
35
40
Рис. 2. Выживаемость мышей с перевитой опухолью Акатол (животное выбывало из группы по достижении размера опухоли 4000 мм3)
5 х
л
о
X
у
п
о
е
.А
ю О
4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
I контроль
II цисплатин
III 7-МГ
IV 7-МГ + цисплатин
3 5
7 10 12 14 17 19 22 24 27 29 32 Сутки после перевивки Рис. 3. Динамика роста аденокарциномы толстой кишки в ксенографтной модели
0
0
5
ТОМ 16 № 2 (61) 2024 | ACTA NATURAE | 51
Все эксперименты на животных выполняли в соответствии с требованиями Этического комитета НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина по работе с животными.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Биологическая активность ингибитора 7-МГ при в/ж введении была исследована на модели рака толстой кишки мыши Акатол. В качестве препарата сравнения использовали классический генотоксичный агент цисплатин, эффективность которого была ранее продемонстрирована в отношении модели Акатол. В результате показано существенное торможение роста опухоли в случае введения циспла-тина (65.8%), 7-МГ (52.5%) и их комбинации (65.5%) на 16-е сутки эксперимента (рис. 1). Эффекты известного химиопрепарата цисплатина и обнаруженного ингибитора ПАРП-1 7-МГ оказались сопоставимы, а использование их комбинации не привело к усилению противоопухолевого действия.
Согласно регламенту работы с модельными мышами, при достижении критического размера опухоли (4000 мм3) животное может быть исключено из экспериментальной группы. Время, за которое опухоль достигает такого размера, можно условно принять за продолжительность жизни после перевивки. На рис. 2 показано выбывание мышей из группы по достижении критического размера опухоли, можно видеть заметное увеличение выживаемости при введении цисплатина и 7-МГ.
Для подтверждения накопления 7-МГ в перевитой опухоли Акатол был осуществлен фармакокинетиче-ский эксперимент. После в/ж введения 7-МГ его содержание в опухоли постепенно возрастало и через 15, 60 и 180 мин составило 218±13, 460±28 и 989±59 нг/г соответственно. При этом соотношение концентраций 7-МГ в опухоли и крови практически не зависело от времени и равнялось в среднем 0.44, что, с учетом низкой васкуляризации ткани, свидетельствует об эффективном проникновении 7-МГ в опухоль.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Topp H., Sander G., Heller-Schöch G., Schöch G. // Anal. Biochem. 1987. V. 161. P. 49-56.
2. Нилов Д.К., Тараров В.И., Куликов А.В., Захаренко А.Л., Гущина И.В., Михайлов С.Н., Лаврик О.И., Швядас В.К. // Acta Naturae. 2016. Т. 8. № 2. С. 120-128.
3. Nilov D., Maluchenko N., Kurgina T., Pushkarev S., Lys A., Kutuzov M., Gerasimova N., Feofanov A., Svedas V., Lavrik O., et al. // Int. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. P. 2159.
4. Кургина Т.А., Шрам С.И., Кутузов М.М., Абрамова Т.В., Щербакова Т.А., Мальцева Е.А., Поройков В.В., Лаврик О.И., Швядас В.К., Нилов Д.К. // Биохимия. 2022. Т. 87. С. 794-803.
5. Шрам С.И., Щербакова Т.А., Абрамова Т.В., Барадиева Э.Ц., Ефремова А.С., Смирновская М.С., Сильников В.Н., Швядас В.К., Нилов Д.К. // Биохимия. 2023. Т. 88. С. 962-972.
6. Пушкарев С.В., Винник В.А., Шаповалова И.В., Швядас В.К., Нилов Д.К. // Биохимия. 2022. Т. 87. С. 550-557.
Также противоопухолевая активность 7-МГ была протестирована на ксенографтной модели рака толстой кишки, полученной в результате перевивки мышам опухолевых клеток человека HCT116. На 32 сутки эксперимента торможение роста опухоли при введении цисплатина, 7-МГ и их комбинации составило 16.1, 37.8 и 80% соответственно (рис. 3). Интересно, что комбинация 7-МГ и цисплатина привела к аддитивному эффекту, который не наблюдался в случае модели Акатол. Вероятно, опухолевые клетки человека HCT116 более чувствительны к комбинированному воздействию тестируемых препаратов.
ВЫВОДЫ
Осуществлен in vivo анализ противоопухолевой активности природного соединения 7-МГ на модели рака толстой кишки Акатол, а также на ксенографтной модели с использованием опухолевых клеток человека HCT116. Показатели торможения роста опухоли при введении 7-МГ свидетельствуют о высокой эффективности препарата в выбранном режиме - 50 мг/кг в/ж, 3 раза в неделю. С использованием хромато-масс-спектрометрического анализа показана высокая степень накопления 7-МГ в опухолевой ткани. В случае ксенографтной модели обнаружено существенное усиление противоопухолевого действия при комбинированном введении 7-МГ и известного химиотерапевтического препарата цисплатина (торможение роста 80%). Полученные данные подтверждают перспективность дальнейших исследований 7-МГ в качестве нового противоопухолевого средства. •
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 19-74-10072). Получение дейтерированного 7-МГ осуществлено в рамках выполнения государственного задания НИЦ «Курчатовский институт».
7. Zhang J., Lu R., Zhang Y., Matuszek Z., Zhang W., Xia Y., Pan T., Sun J. // Cancers (Basel). 2020. V. 12. P. 628.
8. Ohmoto A., Yachida S. // Onco Targets Ther. 2017. V. 10. P. 5195-5208.
9. Mittica G., Ghisoni E., Giannone G., Genta S., Aglietta M., Sapino A., Valabrega G. // Recent Pat. Anticancer Drug Discov. 2018. V. 13. P. 392-410.
10. Kirsanov K., Fetisov T., Antoshina E., Trukhanova L., Gor'kova T., Vlasova O., Khitrovo I., Lesovaya E., Kulbachevskaya N., Shcherbakova T., et al. // Front. Pharmacol. 2022. V. 13. P. 842316.
11. Фетисов Т.И., Тилова Л.Р., Лесовая Е.А., Антошина Е.Е., Горькова Т.Г., Труханова Л.С., Морозова О.В., Шипаева Е.В., Иванов Р.В., Пурмаль А.А. и др. // Усп. мол. онкол. 2016. Т. 3. С. 67-72.
12. Zolotarev Y.A., Dadayan A.K., Borisov Y.A., Kozik V.S. // Chem. Rev. 2010. V. 110. P. 5425-5446.
52 I ACTA NATURAE | ТОМ 16 № 2 (61) 2024
