CC BY
58
УДК 577.152.161; 576.08
Ингибирование поли(ADP-рибозо)-полимеразы метаболитом нуклеиновых кислот 7-метилгуанином
Д. К. Нилов1,2, В. И. Тараров3, А. В. Куликов4, А. Л. Захаренко5, И. В. Гущина2, С. Н. Михайлов3, О. И. Лаврик5, В. К. Швядас12*
'Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991, Москва, Ленинские горы, 1,стр. 40
2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет биоинженерии и биоинформатики, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 73 3Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова,32
4Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет
фундаментальной медицины, 119192, Москва, Ломоносовский просп., 31, корп. 5
5Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН,
630090, Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 8
*E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 01.12.2015
Принята к печати 01.02.2016
РЕФЕРАТ Способность метаболита нуклеиновых кислот 7-метилгуанина ингибировать поли(ADP-рибозо)-полимеразу 1 (ПАРП-1) и поли(ADP-рибозо)полимеразу 2 (ПАРП-2) выявлена in silico и изучена экспериментально. Показано, что для эффективного связывания пуриновых производных с ПАРП важна аминогруппа в положении 2 и метильная группа в положении 7. Активность ПАРП-1 и ПАРП-2 подавляется 7-метилгуанином со значениями IC50 150 и 50 мкМ соответственно. В ПАРП-ингибирующей концентрации 7-метилгуанин не токсичен, но способен усиливать апоптотическую гибель BRCAl-дефицитных клеток рака молочной железы под воздействием цисплатина и доксорубицина - широко используемых ДНК-повреждающих химиотерапевтических препаратов. 7-Метилгуанин имеет привлекательный предсказанный профиль фармакокинетики и токсичности и может рассматриваться в качестве дополнительного компонента химиотерапии.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА докинг, ингибиторы ПАРП, молекулярное моделирование.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ПАРП - поли(ADP-рибозо)полимераза; МД - молекулярная динамика.
ВВЕДЕНИЕ
Под действием различных факторов стресса в ДНК человека возникают генотоксичные повреждения, которые должны устраняться для обеспечения правильной репликации ДНК, транскрипции и предотвращения канцерогенеза. В клеточные пути репарации вовлечены многие белки, которые распознают и устраняют модификации азотистых оснований и разрывы цепи ДНК [1]. Поли(ADP-рибозо)поли-меразы (ПАРП; [КФ. 2.4.2.30]) представляют группу эукариотических белков с разнообразными функциями, связанными в основном с репарацией ДНК и клеточной гибелью. Наиболее изученные представители семейства ПАРП-1 и ПАРП-2 обладают
ДНК-зависимой активностью и катализируют синтез поли(ADP-рибозы) [2]. Донором остатка ADP-рибозы для синтеза полимера служат молекулы NAD+, в ходе реакции высвобождается никотинамид и образуется гликозидная связь между остатками. Связывание белков ПАРП-1 и ПАРП-2 с поврежденной ДНК приводит к поли(ADP-рибозил)ированию как самих ферментов, так и других белков, вовлеченных в метаболизм ДНК [3-6]. Результатом данной посттрансляционной модификации являются активация и сборка систем репарации в поврежденном локусе ДНК. Так, автомодифицированная ПАРП-1 мобилизует белок эксцизионной репарации XRCC1, ассоциированный с ДНК-полимеразой в и ДНК-
лигазой III [7-9]. Важная роль ПАРП-1 и ПАРП-2 подтверждается тем фактом, что рагр-1-/- и рагр-2-/-мыши более чувствительны к ионизирующей радиации, а двойные мутанты ратр-1-/-ратр-2-/- погибают на ранней стадии развития в начале гаструляции [10].
ДНК-связывающий домен ПАРП-1 построен из специализированных цинковых пальцев, в то время как его структура в ПАРП-2 неизвестна, а соответствующий участок последовательности не обладает гомологией с описанными ДНК-связывающими мотивами. Напротив, каталитические домены и активные центры ПАРП-1 и ПАРП-2 характеризуются высоким структурным сходством как в апоформе, так и в комплексе с ингибиторами [11, 12]. Связанный в активном центре субстрат NAD+ взаимодействует с остатками Gly863 и Туг907 (нумерация для ПАРП-1) схожим образом с ингибиторами - миметиками никотинамидного фрагмента. Остов Gly863 образует две водородные связи с амидной группой никотина-мида, а боковая цепь Туг907 - стэкинг с никотина-мидным кольцом [13]. Несколько описанных классов ингибиторов ПАРП содержат карбоксамидную группу, присоединенную к ароматическому кольцу, или лактамную группу, встроенную в систему ароматических колец [14-19], что обеспечивает образование упомянутых взаимодействий с остатками Gly863 и Туг907. Помимо соединений, конкурирующих с NAD+ за активный центр, лиганды малой бороздки, затрагивающие ДНК-зависимый путь регуляции ПАРП-1, также могут рассматриваться в качестве ингибиторов [20].
Вовлеченность ПАРП в системы репарации ДНК делает этот фермент привлекательной мишенью для противоопухолевой терапии. Ингибиторы ПАРП-1 и ПАРП-2 могут усиливать эффект различных ДНК-повреждающих противоопухолевых средств, таких, как цисплатин или доксорубицин. При умеренном повреждении ДНК ПАРП принимает участие в репарации, что позволяет опухолевым клеткам выжить. Комбинирование ДНК-повреждающего агента и ингибитора ПАРП-1 или ПАРП-2 может способствовать преодолению лекарственной устойчивости и апоптотической гибели клеток, представляя, таким образом, многообещающую стратегию терапии опухолей [15, 21-23]. Кроме того, ингибиторы могут найти применение и при дефектах репарации ДНК в определенных опухолевых клетках. Так, отсутствие гомологичной рекомбинации в клетках с дефицитом BRCA1/2 делает их высокочувствительными к ингибированию ПАРП [24-26]. Несколько ингибиторов ПАРП, обладающих противоопухолевой активностью, не прошли доклинические или клинические испытания по причине токсичности и недостаточной эффективности [27-29]. В частности, хорошо из-
вестный ингибитор ПАРП-1 3-аминобензамид плохо проникает в клетку и влияет на другие метаболические процессы. В декабре 2014 года в США было одобрено использование олапариба, первого в своем классе ингибитора ПАРП-1, при прогрессирующем раке яичников [30]. Это соединение является производным фталазина с лактамной группой и в наномо-лярной концентрации подавляет ферментативную активность ПАРП. Тем не менее разработка эффективных и нетоксичных соединений, воздействующих на ПАРП и способных подавлять развитие различных типов рака, по-прежнему представляет важную и сложную проблему.
Один из перспективных классов ингибиторов ПАРП - природные азотистые основания и их производные, содержащие лактамную группу [31, 32]. Однако идентифицированные соединения (например, тимин, гипоксантин) обладают относительно слабым ингибирующим эффектом. В данной работе представлены результаты компьютерного скрининга ингибиторов ПАРП среди производных азотистых оснований и in vitro исследования отобранных соединений.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Подготовка модели белка
Стартовая модель ПАРП-1 построена на основе кристаллической структуры комплекса ПАРП с ингибитором 1efy [33] с помощью пакета программ AmberTools 1.2 (http://ambermd.org). К структуре белка добавляли атомы водорода, после чего помещали ее в ячейку воды типа TIP3P (минимальная толщина слоя молекул воды - 12 А). Для нейтрализации заряда системы добавляли ионы хлора. Для минимизации энергии полученной модели молекулу белка описывали силовым полем ff99SB [34], а ингибитор -автоматически рассчитанными параметрами GAFF [35]. Минимизацию энергии (2500 шагов по методу наискорейшего спуска, затем 2500 шагов по методу сопряженных градиентов) проводили с помощью пакета программ Amber 10 [36] для оптимизации позиции атомов водорода. В ходе минимизации тяжелые атомы белка и ингибитора фиксировали позиционными ограничениями k(Ax)2, где силовая постоянная k была равна 2 ккал/(моль х А2). Ингибитор, молекулы воды и ионы хлора удаляли из оптимизированной системы, чтобы получить модель для проведения молекулярного докинга.
Молекулярный докинг
Компьютерную библиотеку производных природных азотистых оснований подготовили с использованием программы ACD/ChemSketch [37].
Молекулярный докинг проводили с помощью программы Lead Finder 1.1.14 [38]. Рассчитывали карту потенциала взаимодействия в активном центре модели ПАРП-1 (потенциальную решетку) и осуществляли скрининг библиотеки при помощи генетического алгоритма поиска. Проводили 20 независимых запусков докинга для каждого соединения, после чего вероятность успешного докирования -Pdock определяли как отношение числа запусков с успешным результатом (удовлетворяющим заданному структурному критерию) к общему числу запусков, т.е. Pdock = N /20. Структурным критерием было наличие двух водородных связей между лактамной группой докированного соединения и остатком Gly863. Соединения с Pdock ^ 0.8 автоматически исключали с помощью Perl-скрипта.
Молекулярно-динамическая симуляция
Чтобы включить молекулу отобранного ингибитора в систему для симуляции, его параметры, за исключением частичных зарядов, брали из силового поля ff99SB. С целью определения зарядов рассчитывали молекулярный электростатический потенциал ингибитора на HF/6-31G* уровне теории с помощью программы PC GAMESS/Firefly [39]. Подбор частичных атомных зарядов осуществляли с помощью метода RESP [40]. Уравновешивание и последующую симуляцию молекулярной динамики (МД) ПАРП-1 в комплексе с ингибитором проводили с использованием AmberTools 1.2 и Amber 10. Модель комплекса, полученную молекулярным докингом, окружали 12 Â-слоем воды TIP3P и описывали силовым полем ff99SB. Для релаксации сольватированной системы проводили минимизацию энергии методами наискорейшего спуска и сопряженных градиентов. Затем систему разогревали от 0 до 300 К в течение 50 пс и уравновешивали при 300 К в течение 500 пс. Наконец, рассчитывали траекторию равновесной симуляции (10 нс) при постоянном давлении. Все симуляции осуществляли с использованием периодических граничных условий и метода PME (Particle Mesh Ewald) для учета дальнодействующих электростатических взаимодействий.
Программу VMD 1.8.6 [41] использовали для визуализации структур. Параллельные вычисления МД-траектории проводили на суперкомпьютере МГУ [42].
Синтез соединений
7-Метилгуанин, 7-метилксантин, 7-метилгипоксан-тин, 7-этилгуанин получали путем алкилирования соответствующих нуклеозидов с последующим расщеплением N-гликозидной связи согласно ранее описанным методикам [43, 44].
7-Метилгуанин. 400 МГц Ш-ЯМР (ДМСО-d,.): б = 3.82 (s, 3H, Me), 6.03 (brs, 2H, NH2), 7.81 (s, 1H, H-8), 10.66 (brs, 1H, NH).
7-Метилксантин. 400 МГц 1Н-ЯМР (ДМСО-d,.): б = 3.81 (s, 3H, Me), 7.85 (s, 1H, H-8), 10.79 (brs, 1H, NH), 11.48 (brs, 1H, NH).
7-Метилгипоксантин. 400 МГц 'H-ЯМР (CDCLr CD3OD): б = 3.94 (s, 3H, Me), 7.80 (s, 1H, H-2), 7.84 (s, 1H, H-8).
7-Этилгуанин. 400 МГц 'H-ЯМР (ДМСО-d,.): б = 1.36 (t, 3H, J = 7.2 Гц, CH3), 4.19 (q, 2H, Me, J = 7.2 Гц, CH2), 6.09 (brs, 2H, NH2), 7.90 (s, 1H, H-8), 10.26 (brs, 1H, NH).
Измерение ферментативной активности
Рекомбинантные белки ПАРП-1 человека и ПАРП-2 мыши очищали по описанной ранее методике [45, 46]. Реакцию поли(ADP-рибозил)ирования, катализируемую ПАРП-1 и ПАРП-2, проводили в оптимальных для каждого фермента условиях [47, 48]. Кратко, для ПАРП-1: 50 мM трис-HCl pH 8.0, 20 мM MgCl2, 150 мM NaCl, 7 мM Р-меркаптоэтанол, активированная ДНК (2 о.е.280/мл, степень активации 25%), 300 м^ NAD+ (0.18 мкКи [3H]NAD+), 37°С. Реакцию запускали добавлением ПАРП-1 до конечной концентрации 0.2 мкM и останавливали через 1 мин, нанося реакционную смесь на бумажные фильтры (Whatman-1), пропитанные 5% раствором трихлор-уксусной кислоты. Для ПАРП-2: 50 мМ трис-HCl pH 8.0, 40 hM NaCl, 0.1 мг/мл БСА, 8 hM MgCl2, 1 мM ДТТ, активированная ДНК (2 о.е.280/мл, степень активации 25%), 400 м^ NAD+ (0.4 мкКи [3H]NAD+), 37°С. Реакцию запускали добавлением ПАРП-2 до конечной концентрации 0.2 мкM и останавливали через 5 мин, нанося реакционную смесь на бумажные фильтры. Фильтры отмывали 4 раза в 5% трихлорук-сусной кислоте, затем в 90% этаноле (для удаления кислоты) и сушили на воздухе. Количество радиоактивной метки, включенной в кислотонераствори-мый продукт, регистрировали на сцинтилляционном счетчике Tri-Carb 2800 (Perkin Elmer) в толуоловом сцинтилляторе. Определение количества радиоактивно меченного продукта проводили на начальном участке зависимости скорости реакции от времени.
ПАРП-ингибирующую активность синтезированных соединений оценивали в реакции поли(ADP-рибозил)ирования при концентрации NAD+ 0.3 mM в случае ПАРП-1 и 0.4 mM в случае ПАРП-2. Различные количества тестируемых соединений добавляли в реакционную смесь перед добавлением фермента. Реакцию и детекцию продуктов проводили как описано выше. Для определения значения IC50 (концентрация соединения, при которой активность фермента снижена на 50%) изучали влияние различ-
ных концентраций ингибитора на ферментативную активность. Измерения проводили по меньшей мере в двух независимых экспериментах. Значения IC50 рассчитывали методом нелинейного регрессионного анализа с помощью Origin Pro 8.0.
Измерение цитотоксичности
Цитотоксическую активность 7-метилгуанина, ци-сплатина, доксорубицина и их комбинаций оценивали путем анализа клеточного цикла и измерения популяции Sub-G1 методом проточной цитометрии, а также измерения активности каспазы-3 как маркера активации апоптоза. BRCA1-дефицитную линию клеток рака молочной железы человека HCC1937 культивировали в DMEM с добавлением 10% инак-тивированной эмбриональной бычьей сыворотки, пенициллина/стрептомицина (100 ед./мл) и пирувата (0.11 мг/мл) при 37°С в увлажненной атмосфере O2 (20%). Во всех опытах клетки находились в состоянии логарифмического роста. Через 24 ч после рассеивания клетки обрабатывали 7-метилгуанином (150 мкМ) с последующим добавлением цисплатина (70 мкМ) или доксорубицина (1 мкМ) через 3 ч.
Для анализа клеточного цикла клетки собирали через 72 ч, фиксировали в 70% этаноле (конечная концентрация) в течение 60 мин на льду, промывали в фосфатном буфере и окрашивали в 500 мкл раствора, содержащего йодид пропидия (50 мкг/мл) и РНКазу А (25 мкг/мл) в течение 15 мин. Данные получали с помощью проточного цитометра BD FACS CantoII (BD Biosciences) и анализировали с помощью программного обеспечения FACSDiva. Расщепление флуорогенного пептидного субстрата Ac-DNLDAMC оценивали после 48 ч инкубации с цитотоксически-ми агентами. Клетки собирали, промывали фосфатным буфером, центрифугировали и ресуспен-дировали в фосфатном буфере в концентрации 2 х 106 клеток/100 мкл. Затем 35 мкл суспензии добавляли в ячейки 96-луночного планшета и смешивали с пептидным субстратом, растворенным в стандартном реакционном буфере (100 мМ HEPES, 10% сахарозы, 5 мМ ДТТ, 0.001% NP-40 и 0.1% CHAPS, pH 7.2). Расщепление субстрата измеряли по высвобождению кумаринового флуорофора на мультиридере VarioScan Flash (Thermo Scientific) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 460 нм. Измерения проводили по меньшей мере в двух независимых экспериментах.
Моделирование фармакокинетики и токсичности
Фармакокинетический и токсикологический профили 7-метилгуанина рассчитывали с помощью программы ACD/Percepta [49], которая позволяет предсказать in silico ADME-свойства (всасывание,
распределение, метаболизм, выведение) и токсичность с использованием QSAR-моделей, основанных на анализе похожих соединений из библиотеки экспериментальных данных. В случае 7-метилгуанина среди библиотечных соединений были ацикловир, кофеин, теобромин, теофиллин.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Компьютерный скрининг
Модель ПАРП-1, наиболее изученного представителя семейства ПАРП, построили на основе кристаллографической структуры каталитического фрагмента в комплексе с ингибитором (PDB ГО ^у, разрешение 2.2 А). Положение боковых цепей аминокислотных остатков оптимизировали, учитывая их ионизацию. Компьютерная библиотека производных природных азотистых оснований включала около 100 различных производных пурина и пиримидина, содержащих лактамную группу, с учетом возможности их препаративного синтеза. С помощью молекулярного докинга проведен компьютерный скрининг производных, способных связываться в активном центре ПАРП-1. Для более полного исследования конфор-мационного пространства осуществляли серию независимых запусков докинга каждого соединения библиотеки и использовали процедуру структурной фильтрации, которая позволяет отсеивать ложнопо-ложительные результаты докинга [47]. Как отмечено ранее, субстрат и известные ингибиторы ПАРП имеют общую структурную особенность: их амидная (или лактамная) группа образует две водородные связи с остатком Gly863. Данное взаимодействие, необходимое для эффективного связывания в активном центре ПАРП, было учтено в качестве критерия для структурной фильтрации. Наряду с этим при отборе потенциальных ингибиторов учитывали формирование благоприятных гидрофобных контактов и электростатических взаимодействий ингибитора в активном центре ПАРП-1. Компьютерный скрининг показал, что наиболее перспективным ингибитором ПАРП среди исследованных производных пурина и пиримидина является 7-метилгуанин (-Рйоск = 0.95, Д£са1с = -6.8 ккал/моль).
Определение геометрических характеристик 7-метилгуанина в активном центре ПАРП-1 и проверку устойчивости фермент-ингибиторного комплекса проводили при помощи МД. Образование двух водородных связей между лактамной группой 7-метилгуанина и остатком Gly863, а также п-стэкинг пуриновых колец с боковой цепью Туг907 и гидрофобное взаимодействие метильной группы в положении 7 с боковой цепью А1а898 наблюдали по всей МД-траектории (рис. 1). Обнаружено также
Рис. 1. Позиция молекулы 7-метилгуанина в активном центре ПАРП-1 и характерные взаимодействия, выявленные с помощью молекулярного моделирования: две водородные связи лактамной группы с Gly863 (показаны пунктирными линиями), электростатическое взаимодействие аминогруппы (показано штриховой линией), п-стэкинг пуриновых колец с Туг907, гидрофобный контакт метильной группы с А1а898
электростатическое взаимодействие между аминогруппой 7-метилгуанина в положении 2 и кислородом остова Gly263, не являющееся обычной водородной связью. Среднее расстояние N^^-^^863:0 было равно 2.42 А, средний угол NH2:N•••NH2:H•••Gly863:0 -137°, в то время как характерная длина водородной связи составляет 1.8-2.1 А, а угол - не менее 150°. Характеристики положения 7-метилгуанина в активном центре ПАРП-1 представлены в табл. 1.
Интересно, что ранее была показана умеренная ингибирующая активность в отношении ПАРП-1 структурного аналога 7-метилксантина [32], который отличается от 7-метилгуанина оксогруппой в положении 2 (рис. 2). При проведении нами компьютерного скрининга 7-метилксантин был исключен на стадии структурной фильтрации (-Рйоск = 0.45), что указывало на его менее эффективное связывание. При моделировании взаимодействия фермента с 7-метилгипоксантином, структурным аналогом без заместителя в положении 2, предсказанные параметры связывания (-Рйоск = 0.85, ДСса1с = -6.4 ккал/ моль) также были менее благоприятными. Анализ структуры комплексов ПАРП-1 с 7-метилгуанином и его структурными аналогами показал, что наличие аминогруппы в положении 2 существенно увеличивает эффективность связывания ингибитора в активном центре за счет электростатического вза-
Таблица 1. Дистанционные и угловые характеристики позиции 7-метилгуанина (7-MG) в активном центре ПАРП-1, определенные с помощью МД-симуляции. Средние значения приведены вместе со стандартным отклонением
Расстояние, А
7-MG:C0:0 ••• Gly863:H 2.0 ± 0.2
7-MG:NH:H ••• Gly863:0 1.9 ± 0.1
7-MG:NH2:H ••• Gly863:0 2.4 ± 0.4
7-MG:CH3:C ••• А1а898:СВ 4.0 ± 0.3
C(7-MG конд. кольца) ••• С(Туг907 бенз. кольцо)* 3.6 ± 0.2
Угол, град
7-MG:C0:0 ••• G1y863:H ••• G1y863:N 160 ± 11
7-MG:NH:N ••• 7-MG:NH:H ••• G1y863:0 159 ± 9
7-MG:NH2:N ••• 7-MG:NH:H ••• G1y863:0 137 ± 10
'Расстояние между геометрическим центром конденсированных колец 7-метилгуанина и центром бензольного кольца Туг907.
н,с
н,с
N ЧН;
7-Метилгуанин
7-Метилксантин
н,с
7-Метилгипоксантин
N МН2
7-Этилгуанин
Рис. 2. Химические структуры синтезированных и протестированных соединений
Таблица 2. Ингибирующий эффект 7-метилгуани-на и родственных соединений в отношении ПАРП-1 и ПАРП-2
Соединение 1С„, мкМ 50'
ПАРП-1 ПАРП-2
7-Метилгуанин 150 50
7-Метилксантин 800 160
7-Метилгипоксантин 780 620
7-Этилгуанин 230 90
имодействия с Gly863. Другим заместителем, обеспечивающим комплементарность к активному центру ПАРП-1, является метильная группа в положении 7, что подтверждает отсутствие ингибирующих свойств у немодифицированных ксантинов [32]. Следует отметить, что ингибирующий эффект не увеличивается при дальнейшем наращивании алкильной цепи в этом положении, о чем свидетельствуют расчетные параметры связывания 7-этилгуанина (-Рйоск = 0.7, дСса1С = -6.7 ккал/моль).
Ингибирующие свойства пуриновых производных
Мы синтезировали 7-метилгуанин, 7-метилксантин, 7-метилгипоксантин и 7-этилгуанин,чтобы протестировать их способность подавлять ПАРП и оценить влияние заместителей на активность ингибитора. Ингибирующие свойства 7-метилгуанина и родственных соединений изучали с использованием двух очи-
щенных белков семейства ПАРП - ПАРП-1 человека и ПАРП-2 мыши. Представленные в табл. 2 экспериментальные данные показывают, что 7-метилгуа-нин действительно является наиболее эффективным ингибитором ПАРП-1 и ПАРП-2 со значениями 1С50 150 и 50 мкМ. Замена 2-оксогруппы 7-метилксанти-на на аминогруппу приводит к пяти- и трехкратному увеличению способности ингибировать ПАРП-1 и ПАРП-2 соответственно. 7-Метилгуанин оказался эффективнее 7-этилгуанина, что свидетельствует об ограниченности участка связывания алкильного заместителя. Важно отметить, что все тестируемые пуриновые производные оказались более эффективными ингибиторами ПАРП-2, несмотря на очень похожую организацию участков связывания в ПАРП-1 и ПАРП-2. Можно предположить, что наблюдаемая селективность обусловлена различными траекториями доставки ингибитора в активный центр белков ПАРП.
Анализ цитотоксичности
Цитотоксичность традиционных противоопухолевых средств - цисплатина и доксорубицина, а также 7-метилгуанина, анализировали на линии клеток рака молочной железы человека НСС1937, которая считается чувствительной к ингибированию ПАРП из-за дефекта гена репарации ДНК BRCA1 [22, 50, 51]. Индуцированную препаратами гибель клеток оценивали по популяции Sub-G1 (соответствует популяции апоптотических клеток с фрагментирован-ной ДНК) на проточном цитометре (рис. 3). Обработка клеток 7-метилгуанином сама по себе не привела к увеличению числа клеток в фазе Sub-G1, которое составило около 2% (сопоставимо с контролем). Однако сравнение уровня клеточной гибели показало, что 7-метилгуанин сенсибилизирует НСС1937 к действию цисплатина и доксорубицина. При обработке клеток комбинацией 7-метилгуанина (150 мкМ) и цисплатина (70 мкМ) популяция клеток в фазе Sub-G1 увеличилась с 34 до 43%, а добавление 7-метилгуанина (150 мкМ) к доксорубицину (1 мкМ) увеличило популяцию Sub-G1 с 32 до 42%. Таким образом, изменение уровня клеточной гибели при добавлении 7-метилгуанина происходит схожим образом в случае цисплатина и доксорубицина.
Мы проанализировали также активацию каспа-зы-3 в клетках НСС1937, важного и обязательного события в программе апоптоза. Активная каспаза-3 расщепляет различные молекулы в клетке, что приводит к появлению апоптотической морфологии. Степень активации, измеренная по расщеплению специфического флуорогенного субстрата, коррелировала с уровнем клеточной гибели. Из рис. 4 видно, что активность каспазы-3 увеличивалась
Контроль
Cis (70 мкМ)
Dox (1 мкМ)
Г
Соип! 1» МО к 32.0%
а. |
а- Т*Т (1 >М1| 1
7-MG (150 мкМ)
Cis (70 мкМ) + 7-MG (150 мкМ) Dox (1 мкМ) + 7-MG (150 мкМ)
Рис. 3. Оценка популяции Sub-G1 клеток НСС1937, подвергнутых воздействию цисплатина (Cis), доксорубицина ^ох) и 7-метилгуанина (7-MG) в виде монопрепарата и при их комбинации в течение 72 ч. Область популяции Sub-G1 показана серым цветом
при добавлении 7-метилгуанина к цисплатину и док-сорубицину на 27-39%, однако сам 7-метилгуанин не стимулировал каспазную активность. Эти данные согласуются с уровнем клеточной гибели, определенным методом проточной цитометрии.
Профиль фармакокинетики и токсичности
В заключение мы оценили фармакокинетические свойства и токсикологический профиль 7-метилгуанина при помощи QSAR-моделирования на основе опубликованных данных его структурных аналогов (ацикловир, кофеин, теобромин, теофиллин). Так, абсорбция в кишечнике человека оценивается как очень высокая, а биодоступность при перо-ральном введении - близка к оптимальной (83%). Расчетная доля 7-метилгуанина, связанного с белками плазмы, составляет 17%, что не должно существенно влиять на его эффективность. Маловероятно связывание 7-метилгуанина с рецептором эстрогена альфа (нет риска репродуктивной токсичности), калиевым каналом hERG (нет риска кардиотоксич-ности), обратным транспортером Р-гликопротеином и ферментами семейства цитохрома Р450 (CYP3A4,
с о н в и
Ь го £ *
яз аа
I 5
ла ек ит
с о н
35 30 25 20 15 10 5
о а
о
? ? ?
* 1 * < * * 1
50 5 01 X
О 1Л и Г-ч — о а
5
Рис. 4. Увеличение активности каспазы-3 (относительно контроля) в клетках НСС1937, подвергнутых действию цисплатина (Cis), доксорубицина ^ох) и 7-ме-тилгуанина (7-MG) в виде монопрепарата и при их комбинации в течение 48 ч
0
CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, CYP1A2). Таким образом, предсказанные свойства свидетельствуют об эффективности и безопасности 7-метилгуанина для человека.
ВЫВОДЫ
Несмотря на способность повреждающих ДНК лекарственных средств убивать опухолевые клетки, токсичность этих средств и устойчивость клеток к химиотерапии остаются серьезной проблемой. Системы репарации ДНК, включающие ПАРП-1 и ПАРП-2, важны для нормального развития организма, однако в случае использования ДНК-повреждающих средств эти белки могут уменьшать терапевтический эффект. Метаболит нуклеиновых кислот 7-метилгуанин выявлен in silico в качестве нового ингибитора каталитической активности ПАРП и исследован экспериментально. Показано, что важное условие эффективного связывания пу-риновых производных - наличие аминогруппы в положении 2 и метильной группы в положении 7. В ПАРП-ингибирующей концентрации 7-метил-гуанин не токсичен, однако способен увеличивать
чувствительность BRCA1-дефицитных клеток рака молочной железы к распространенным химиотера-певтическим средствам (цисплатину и доксорубици-ну). 7-Метилгуанин является метаболитом нуклеиновых кислот, содержится в плазме крови человека и выводится с мочой [52]. Хотя 7-метилгуанин уступает по ингибирующей активности олапарибу и некоторым другим известным ингибиторам ПАРП, можно ожидать, что это природное соединение будет иметь более выгодный фармакокинетический и токсикологический профили по сравнению с синтетическими ингибиторами и будет рассматриваться в качестве нового перспективного компонента противоопухолевой терапии. •
Работа поддержана Министерством образования и науки России (соглашение № 14.604.21.0018, Ю RFMEFI60414X0018). Химический синтез пуринов выполнен при поддержке РФФИ (грант № 14-04-00835_а).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Cline S.D., Hanawalt P.C. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003. V. 4. P. 361-373.
2. Drenichev M.S., Mikhailov S.N. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2015. V. 34. P. 258-276.
3. Lautier D., Lagueux J., Thibodeau J., Ménard L., Poirier G.G. // Mol. Cell. Biochem. 1993. V. 122. P. 171-193.
4. Schreiber V., Dantzer F., Ame J.-C., de Murcia G. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2006. V. 7. P. 517-528.
5. Hassa P.O., Haenni S.S., Elser M., Hottiger M.O. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2006. V. 70. P. 789-829.
6. Hassler M., Ladurner A.G. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2012. V. 22. P. 721-729.
7. Masson M., Niedergang C., Schreiber V., Muller S., Menissier-de Murcia J., de Murcia G. // Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. P. 3563-3571.
8. Ryu K.W., Kim D.-S., Kraus W.L. // Chem. Rev. 2015. V. 115. P. 2453-2481.
9. Cazzalini O., Dona F., Savio M., Tillhon M., Maccario C., Perucca P., Stivala L.A., Scovassi A.I., Prosperi E. // DNA Repair (Amst.). 2010. V. 9. P. 627-635.
10. Ménissier de Murcia J., Ricoul M., Tartier L., Niedergang C., Huber A., Dantzer F., Schreiber V., Amé J.C., Dierich A., LeMeur M., et al. // EMBO J. 2003. V. 22. P. 2255-2263.
11. Ruf A., Mennissier de Murcia J., de Murcia G., Schulz G.E. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 7481-7485.
12. Karlberg T., Hammarström M., Schütz P., Svensson L., Schüler H. // Biochemistry. 2010. V. 49. P. 1056-1058.
13. Ruf A., de Murcia G., Schulz G.E. // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 3893-3900.
14. Banasik M., Komura H., Shimoyama M., Ueda K. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 1569-1575.
15. Jagtap P., Szabó C. // Nat. Rev. Drug Discov. 2005. V. 4. P. 421-440.
16. Ferraris D.V. // J. Med. Chem. 2010. V. 53. P. 4561-4584.
17. Ekblad T., Camaioni E., Schüler H., Macchiarulo A. // FEBS J. 2013. V. 280. P. 3563-3575.
18. Efremova A.S., Zakharenko A.L., Shram S.I., Kulikova I.V., Drenichev M.S., Sukhanova M.V., Khodyreva S.N., Myasoedov N.F., Lavrik O.I., Mikhailov S.N. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2013. V. 32. P. 510-528.
19. Ekblad T., Lindgren A.E.G., Andersson C.D., Caraballo R., Thorsell A.-G., Karlberg T., Spjut S., Linusson A., Schüler H., Elofsson M. // Eur. J. Med. Chem. 2015. V. 95. P. 546-551.
20. Kirsanov K.I., Kotova E., Makhov P., Golovine K., Lesovaya E.A., Kolenko V.M., Yakubovskaya M.G., Tulin A.V. // Onco-target. 2014. V. 5. P. 428-437.
21. Cepeda V., Fuertes M.A., Castilla J., Alonso C., Quevedo C., Soto M., Pérez J.M. // Recent Pat. Anticancer Drug Discov. 2006. V. 1. P. 39-53.
22. Martin S.A., Lord C.J., Ashworth A. // Curr. Opin. Genet. Dev. 2008. V. 18. P. 80-86.
23. Brock W.A., Milas L., Bergh S., Lo R., Szabó C., Mason K.A. // Cancer Lett. 2004. V. 205. P. 155-160.
24. Curtin N.J., Szabo C. // Mol. Aspects Med. 2013. V. 34. P. 1217-1256.
25. Farmer H., McCabe N., Lord C.J., Tutt A.N.J., Johnson D.A., Richardson T.B., Santarosa M., Dillon K.J., Hickson I., Knights C., et al. // Nature. 2005. V. 434. P. 917-921.
26. Boerner J.L., Nechiporchik N., Mueller K.L., Polin L., Heilbrun L., Boerner S.A., Zoratti G.L., Stark K., LoRusso P.M., Burger A. // PLoS One. 2015. V. 10. P. e0119614.
27. Milam K.M., Cleaver J.E. // Science. 1984. V. 223. P. 589-591.
28. Mateo J., Ong M., Tan D.S.P., Gonzalez M.A., de Bono J.S. // Nat. Rev. Clin. Oncol. 2013. V. 10. P. 688-696.
29. Madison D.L., Stauffer D., Lundblad J.R. // DNA Repair (Amst.). 2011. V. 10. P. 1003-1013.
30. Frampton J.E. // BioDrugs. 2015. V. 29. P. 143-150.
31. Virag L., Szabo C. // FASEB J. 2001. V. 15. P. 99-107.
32. Geraets L., Moonen H.J.J., Wouters E.F.M., Bast A., Hageman G.J. // Biochem. Pharmacol. 2006. V. 72. P. 902-910.
33. White A.W., Almassy R., Calvert A.H., Curtin N.J., Griffin R.J., Hostomsky Z., Maegley K., Newell D.R., Srinivasan S., Golding B.T. // J. Med. Chem. 2000. V. 43. P. 4084-4097.
34. Hornak V., Abel R., Okur A., Strockbine B., Roitberg A., Simmerling C. // Proteins. 2006. V. 65. P. 712-725.
35. Wang J., Wolf R.M., Caldwell J.W., Kollman P.A., Case D.A. // J. Comput. Chem. 2004. V. 25. P. 1157-1174.
36. Case D.A., Darden T.A., Cheatham T.E., III, Simmerling C.L., Wang J., Duke R.E., Luo R., Crowley M., Walker R.C., Zhang W., et al. // AMBER 10. University of California, San Francisco. 2008.
37. ACD/ChemSketch Freeware, version 8.17. Advanced Chemistry Development, Inc., http://www.acdlabs.com. 2005.
38. Stroganov O.V., Novikov F.N., Stroylov V.S., Kulkov V., Chilov G.G. // J. Chem. Inf. Model. 2008. V. 48. P. 2371-2385.
39. Granovsky A.A. Firefly, version 7.1.F, http://classic.chem. msu.su/gran/firefly/index.html. 2009.
40. Bayly C.I., Cieplak P., Cornell W.D., Kollman P.A. // J. Phys. Chem. 1993. V. 97. P. 10269-10280.
41. Humphrey W., Dalke A., Schulten K. // J. Mol. Graph. 1996. V. 14. P. 33-38.
42. Воеводин Вад.В., Жуматий С.А., Соболев С.И., Антонов
А.С., Брызгалов П.А., Никитенко Д.А., Стефанов К.С., Воеводин В.В. // Открытые системы. 2012. Т. 7. С. 36-39.
43. Jones J.W., Robins R.K. // J. Am. Chem. Soc. 1963. V. 85. P. 193-201.
44. Vidal A., Giraud I., Madelmont J.-C. // Synth. Commun. 2004. V. 34. P. 3359-3365.
45. Суханова М.В., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 686-698.
46. Amé J.C., Rolli V., Schreiber V., Niedergang C., Apiou F., Decker P., Muller S., Höger T., Ménissier-de Murcia J., de Murcia G. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 17860-17868.
47. Захаренко А.Л., Суханова М.В., Ходырева С.Н., Новиков Ф.Н., Стройлов В.С., Нилов Д.К., Чилов Г.Г., Швядас В.К., Лаврик О.И. // Молекуляр. биология. 2011. Т. 45. С. 565-569.
48. Kutuzov M.M., Khodyreva S.N., Amé J.-C., Ilina E.S., Sukhanova M.V., Schreiber V., Lavrik O.I. // Biochimie. 2013. V. 95. P. 1208-1215.
49. ACD/Percepta. Advanced Chemistry Development, Inc., http://www.acdlabs.com. 2012.
50. Benafif S., Hall M. // Onco Targets Ther. 2015. V. 8. P. 519-528.
51. Helleday T. // Mol. Oncol. 2011. V. 5. P. 387-393.
52. Topp H., Sander G., Heller-Schöch G., Schöch G.. // Anal. Biochem. 1987. V. 161. P. 49-56.
