CC BY
66
Список использованной литературы:
1. Анчеева Е.Ю. Элементный состав надземной части четырех видов рода звездчатка / Е.Ю. Анчеева, Л.С. Теслов // Фармация, 2014. №2. С. 22-242.
2. Горина Я. В. Фитохимическое исследование некоторых видов рода Stellaria / Я. В. Горина, Е. А. Краснов // Журнал Сибирского федерального университета. Химия, 2010. №3. С. 200-203.
3. Смирнова, Е.Б. Лекарственные растения западного Правобережья Саратовской области: рациональное использование и охрана / Е.Б. Смирнова, Н.Ю. Семенова, А.В. Невзоров // Экопрофилактика, оздоровительные и спортивно-тренировочные технологии: матер. Междунар. науч.-практич. конф. 1-3 октября 2015г. г. Балашов/ под. ред. Д.В. Воробьева, Н.В. Тимушкиной. - Саратов: Саратовский источник, 2015.С. 103-106.
© Невзоров А.В., Чермашенцева Н.В., Смирнова Е.Б., 2016
УДК 57.08
Полевщикова Елена Евгеньевна
Старший преподаватель кафедры Химии фармацевтического факультета Южно-Уральский государственный медицинский университет,
Челябинск, РФ Рябинин Вячеслав Евгеньевич д.б.н., профессор, профессор кафедры Биологической химии (биохимии) Южно-Уральский государственный медицинский университет,
Челябинск, РФ
ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ РЕЖИМОВ ДИАЛИЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ В КАЧЕСТВЕ ДИАЛИЗИРУЮЩЕГО РАСТВОРА ЦИТОЗОЛЯ ПЕЧЕНИ И РАСТВОРА АЛЬБУМИНА НА АППАРАТЕ «БИОИСКУССТВЕННАЯ ПЕЧЕНЬ» В УСЛОВИЯХ
МОДЕЛЬНОГО ЭКСПЕРИМЕНТА
Аннотация
В настоящей работе проведены исследования по изучению особенностей различных режимов диализа, проведена оценка соответствующей эффективности низкопоточного и высокопоточного альбуминового и цитозольного диализа на экспериментальном образце аппарата «Биоискусственная печень». Получены данные по влиянию этих режимов на функциональную активность цитозоля печени.
Ключевые слова
печеночная недостаточность, биоискусственная печень, альбуминовый диализ, цитозольный диализ,
низкопоточный и высокопоточный диализ.
Ежегодно от печеночной недостаточности умирает во всем мире несколько миллионов человек в год. Только 10% от общего числа нуждающихся в трансплантации печени получают адекватную хирургическую помощь. Поэтому существует огромная потребность в искусственных системах поддержки функции печени, как в России, так и за рубежом. При нарушении функции печени фармакологическая коррекция осложняется из-за нарушений микросомального окисления, которое играет ключевую роль в активации большинства лекарственных препаратов. Поэтому терапевтические стратегии при печеночной недостаточности сосредоточены на оптимизацию системы «искусственная печень», основанной на методах экстракорпоральной детоксикации [6, с.148]. Однако известная ограниченность и недостаточная
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №8/2016 ISSN 2410-700Х_
эффективность этих методов лечения требует их усовершенствования и разработки новых, патогенетически обоснованных способов детоксикации и нормализации обменных процессов [13, с. 64-73].
Целью настоящего исследования явилось изучение и сравнение эффективности и особенностей низкопоточного и высокопоточного альбуминового и цитозольного диализа на экспериментальном образце аппарата «Биоискусственная печень».
Экспериментальный образец аппарата «Биоискусственная печень» («БИП») был разработан и изготовлен ООО «Миасский завод медицинского оборудования» (г. Миасс, Россия) совместно с кафедрой биохимии ФГБОУ ВО «Южно-Уральский медицинский университет» Минздрава России (г. Челябинск), и предназначен для проведения экстракорпорального очищения крови в случаях острой печеночной недостаточности методами плазмосорбции, альбуминовой и цитозольной детоксикации [8,9,10]. Режимы работы, реализованные в аппарате, выполняются автоматически. Перфузионный контур организован как в традиционных гемодиализных аппаратах. В диализном контуре в качестве диализирующего раствора использовали 10% раствор донорского человеческого альбумина и свежеприготовленный цитозоль печени крысы с микросомальной и митохондриальной фракциями в режиме рециркуляции. Цитозоль печени (ЦП) готовили по оригинальной методике с использованием крысиной печени [7]. Для имитации интоксикации в модельный раствор (донорскую плазму) добавляли высокие концентрации аммиака, анилина, 2,4-динитрофенола и салицилат натрия. Принцип экстракорпоральной терапии на аппарате «БИП» заключался в том, что диализирующий раствор с помощью перфузионного насоса подавали на гемодиализатор по разъемам для диализной жидкости по принципу рециркуляции в замкнутом контуре, где он контактировал через полупроницаемую мембрану диализатора с модельным раствором в течение 2-3 часов. В экспериментах использовали низкопоточные Hemoflow F3 и высокопоточные Helixone FX40 гемодиализаторы (Fresenius). Отбор проб модельного раствора (МР) и диализирующего раствора (ДР) осуществляли через определенные промежутки времени для выявления динамики изменения концентраций веществ эндогенного и экзогенного происхождения. Содержание уровня аммиака определяли двумя методами: в донорской плазме (альбумине) использовали фотометрический метод Белкина А.Л. и Осадчей Л.П. [1, c.177]; в цитозоле печени определение проводили ферментным глутаматдегидрогеназным методом, используя набор реактивов Monotest® Ammonia Enzimatic UV-method фирмы Boehringer Mannheim (Австрия). Содержание анилина проводили экстракционным спектрофотометрическим методом [4, c. 343]. Уровень молекул средней массы проводили по Габриэлян Н.И. [2, с.138-140]. С помощью спектрофотометрических методов определяли концентрацию 2,4-динитрофенола (2,4-ДНФ) [11, c. 130-135] и концентрацию салицилата натрия [13, c. 1167-1168]. Функциональную активность цитозоля печени, используемого в качестве ДР на аппарате «БИП» оценивали, измеряя через определенные промежутки времени активности деметилазы диметиланилина, 2.6-дихлорфенолиндофенолредуктазы [3, c.49-62], АЛТ (набор реагентов «Трансаминаза-АЛТ-Ново», Вектор-Бест, Россия). А также, контролировали уровень общего белка и мочевины [5, c.272].
Проведенные исследования позволили изучить особенности различных режимов и оценить соответствующую эффективность низкопоточного и высокопоточного альбуминового и цитозольного диализа на экспериментальном образце аппарата «Биоискусственная печень», а также влияние этих режимов на функциональную активность цитозоля печени.
Данные по низкопоточному диализу показали (Таблица 1), что основной массоперенос осуществляется в течение первых 30-60 минут.
Таблица 1
Клиренс тестовых химических веществ при низкопоточном диализе (мл/мин) с использованием различных
диализирующих растворов (M±m), n=5
Время, мин 2,4-ДНФ Салицилат натрия Аммиак Анилин Средние молекулы
Физиологический раствор
30 0,41±0,03 3,84±0,32 3,6±0,3 3,28±0,22 3,38±0,24
60 0,11±0,01* 0,26±0,02* 0,7±0,05* 0,72±0,05* 1,1±0,11*
120 0,08±0,01* 0,02±0,01* 0,2±0,02* 0,47±0,03* 0,2±0,02*
180 0,02±0,01* 0,09±0,01* 0,18±0,02 0,2±0,01* 0,2±0,02
Раствор альбумина
Время, мин 2,4-ДНФ Салицилат натрия Аммиак Анилин Средние молекулы
30 5,96±0,43 4,13±0,41 3,23±0,27 4,95±0,5 5,36±0,54
60 0,35±0,03* 0,79±0,05* 0,93±0,07* 2,9±0,26* 0,73±0,07*
120 0,35±0,03 0,23±0,02* 0,44±0,03* 2,42±0,16* 0,42±0,03*
180 0,20±0,02* 0,01±0,001* 0,47±0,03 0,47±0,04* 0,07±0,01*
Цитозоль печени
30 3,91±0,33 4,24±0,33 5,41±0,45 4,97±0,36 4,07±0,31
60 0,34±0,02* 0,73±0,06* 0,88±0,07* 1,01±0,07* 1,12±0,09*
120 0,28±0,03* 0,02±0,01* 0,28±0,02* 0,22±0,01* 0,32±0,03*
180 0,21±0,02* 0,02±0,01 0,22±0,02* 0,18±0,02* 0,05±0,01*
* - статистически значимые отличия от предыдущего уровня по критерию U, P<0,05 2,4-ДНФ - 2,4-динитрофенол
Для доказательства эффективности альбуминового и цитозольного диализа было целесообразным их сопоставление с диализом, где в качестве ДР использовали физиологический раствор. Результаты проведенных экспериментов представлены в Таблице 1 и свидетельствуют о различной степени диализируемости изучаемых химических соединений при использовании низкопоточного диализатора Hemoflow F3 (Fresenius, Германия). При использовании в качестве диализирующей жидкости физиологического раствора с наибольшей эффективностью удаляются гидрофильные индикаторные вещества, а связанные с альбумином гидрофобные вещества (2,4-динитрофенол) практически не элиминируются (процент удаления составил 5%). В условиях низкопоточного альбуминового диализа наблюдали высокую эффективность элиминирования гидрофобных веществ: 2,4-ДНФ, анилина и МСМ (процент удаления составил 33,6%, 73% и 66% соответственно), а удаление гидрофильных индикаторных веществ (процент удаления 52-62%) было сопоставимо с результатами, полученными при использовании в качестве диализирующей жидкости физиологического раствора. На начальном этапе с наибольшей скоростью удаляются молекулы аммиака и анилина, имеющие небольшой размер и находящиеся в ионизированном виде, поэтому легко проходящие сквозь мембрану диализатора. Более медленно, но не менее эффективно идет удаление 2,4- ДНФ, салицилата натрия и МСМ. Это связано с особенностями взаимодействия данных маркеров со связывающими центрами молекулы альбумина: высокий аффинитет и малое число связывающих мест (N=2) у салицилата, слабый аффинитет и высокая емкость (N=10-30) у 2,4-ДНФ. Данные взаимодействия приводят к конформационной перестройке молекулы альбумина. МСМ, в силу разнообразия их молекулярной массы и природы, взаимодействуют с молекулой альбумина еще более сложным образом с реализацией разных механизмов и связыванием с помощью различных участков ППЦ альбумина. Полученные данные демонстрируют высокую скорость элиминации всех индикаторных веществ и обеспечивают высокий процент удаления всех маркеров из модельного раствора в ходе эксперимента на экспериментальном образце аппарата «БИП». Эффективность низкопоточного цитозольного диализа существенно превышает показатели диализа с использованием физиологического раствора, но по некоторым параметрам уступает альбуминовому диализу, однако наиболее эффективное удаление аммиака достигается при использовании цитозоля печени в качестве ДР(процент удаления составил 64,3%). Сравнительная характеристика клиренсов тестовых химических соединений при низкопоточном диализе демонстрирует возможность проведения избирательной элиминации в зависимости от характера интоксикации и/или особенностей течения заболевания.
Результаты экспериментов по высокопоточному диализу с использованием альбумина в качестве диализирующего раствора свидетельствуют о высокой скорости удаления исследуемых маркерных соединений (Таблица 2).
Таблица 2
Клиренс тестовых химических веществ при высокопоточном диализе (мл/мин) с использованием
различных диализирующих растворов (M±m), n=5
Время, мин 2,4-ДНФ Салицилат натрия Аммиак Анилин Средние молекулы
Раствор альбумина
30 10,7±0,89 6,3±0,57 5,8±0,48 5,7±0,38 6,4±0,53
60 0,3±0,02* 0,4±0,03* 0,7±0,05* 2,2±0,18* 0,7±0,06*
120 0,2±0,02* 0,2±0,01* 0,7±0,07 0,4±0,03* 0,4±0,03*
Время, мин 2,4-ДНФ Салицилат натрия Аммиак Анилин Средние молекулы
180 0,2±0,02 0,2±0,02 0,7±0,06 0,03±0,01* 0,2±0,01*
Цитозоль печени
30 2,7±0,23 4,55±0,46 5,47±0,5 5,6±0,37 2,94±0,21
60 0,69±0,07* 0,67±0,04* 0,25±0,02* 1,25±0,08* 0,29±0,02*
120 0,19±0,02* 0,02±0,01* 0,07±0,01* 0,27±0,02* 0,2±0,01*
180 0,21±0,01 0,02±0,01 0,07±0,01 0,14±0,01* 0,01±0,003*
* - статистически значимые отличия от предыдущего уровня по критерию U, P<0,05 2,4-ДНФ - 2,4-динитрофенол
Были получены более высокие значения клиренса по сравнению с низкопоточным альбуминовым диализом: клиренс 2,4-ДНФ, салицилата натрия, аммиака, анилина и МСМ через 30 минут увеличивался в среднем на 44,3%, 35%, 44,2%, 14,5% и 16,3% соответственно. Использование высокопоточных диализаторов (High-Flux) с большим размером пор позволяет выводить из плазмы крови 60-70% низко- и среднемолекулярных веществ за первые 30 минут контакта с 10% раствором альбумина, что связано с более эффективным лигандным переносом через мембрану веществ, связанных с сывороточным альбумином. Анализ полученных данных по высокопоточному диализу с использованием в качестве ДР цитозоля печени не показал существенных отличий в динамике удаления тестовых химических соединений из плазмы или их связывания с цитозолем по сравнению с низкопоточным диализом (Таблица 2).
В ходе исследования получены результаты о влиянии данных режимов диализа на функциональную активность цитозоля печени. В течение всей процедуры низкопоточного диализа ЦП сохранял высокую функциональную активность, на что указывают стабильные активности ферментов (Таблица 3): увеличение активности деметилазы диметиланилина и 2,6-дихлорфенолиндофенолредуктазы отражает усиление активности микросомальной системы окисления и метаболизирования ксенобиотиков. Отсутствие изменений активности АЛТ в процессе эксперимента свидетельствует с одной стороны о полноте гомогенизации и эффективности дифференциального центрифугирования гомогената печени, с другой стороны - является индикатором сохранности ферментативных систем цитозоля печени. Почти двукратное увеличение концентрации мочевины свидетельствует об усилении биосинтеза мочевины и коррелирует с изменением содержания аммиака в обоих контурах. Уменьшение концентрации общего белка через час после начала диализа можно объяснить усилением в этот период реакций протеолиза и последующей стабилизации этого процесса. При высокопоточном режиме диализа в отличие от низкопоточного наблюдалось почти двукратное снижение активности деметилазы диметиланилина, 2,6-дихлорфенолиндофенолредуктазы и значительные колебания в активности АЛТ (таблица 3).
Таблица 3
Функциональная активность цитозоля печени крысы при различных видах диализа плазмы с тестовыми
химическими соединениями (M±m), n=5
Измеряемый показатель 0 мин 30 мин 60 мин 120 мин 180 мин
Низкопоточный диализ
ДМА, нмоль/мин/мг 21,33±0,99 13,37±1,22* 19,22±1,37* 20,51±1,71 20,17±1,55
2,6-ДХФИФ, нмоль/мин/мг 28,56±3,01 25,69±2,57 34,33±3,43* 34,54±2,66 34,71±2,48
белка
АЛТ, Ед/л 121,4±9,85 114,5±11,45 91,8±7,65* 115,1±7,67* 107,1±7,65
Мочевина, ммоль/л 4,01±0,19 3,6±0,26 4,4±0,29* 7,7±0,51* 7,5±0,51
Общий белок, мг/мл 8,9±1,47 9,3±0,78 6,9±0,58* 6,7±0,56 6,5±0,49
Высокопоточный диализ
ДМА, нмоль/мин/мг 18,19±1,82 9,04±0,75* 7,65±0,7* 8,76±0,88 6,95±0,46*
2,6-ДХФИФ, нмоль/мин/мг 34,91±2,49 19,83±1,32* 18,33±1,41 19,18±1,37 19,88±1,99
белка
АЛТ, Ед/л 446,1±31,86 114,2±9,5* 269,1±20,69* 73,3±6,11* 47,1±3,93*
Мочевина цитозоля, ммоль/л 0,47±0,03 2,1±0,16* 2,4±0,2 2,5±0,25 3,9±0,3*
Общий белок, мг/мл 7,43±0,74 14,12±1,41* 14,8±1,06 14,35±1,44 14,26±1,1
* - статистически значимые отличия от предыдущего уровня по критерию U, P<0,05
ДМА-деметилаза диметиланилина 2,6-ДХФИФ - 2,6-дихлорфенолиндофенолредуктаза
АЛТ - аланиновая трансаминаза
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №8/2016 ISSN 2410-700Х_
Такие изменения активности ферментов могут быть связаны с увеличенной проницаемостью мембран для различных низко - и среднемолекулярных соединений плазмы крови, способных вызывать аллостерическое ингибирование белковых молекул. В то же время, как и при низкопоточном диализе наблюдалось увеличение концентрации мочевины в процессе контакта с плазмой крови (таблица 3): через 30 минут содержание мочевины увеличивается в 4,4 раза, а через 180 минут - в 8,3 раза, что свидетельствует о способности цитозоля включать экзогенный аммиак в синтез мочевины. О том, что увеличение концентрации мочевины в цитозоле не является результатом диализа мочевины из плазмы, свидетельствует отсутствие равновесных концентраций через 180 минут.
Результаты изучения низко - и высокопоточного цитозольного диализа на аппарате «Биоискусственная печень» показали возможность использования обоих вариантов для экстракорпоральной детоксикации и нормализации обменных процессов при некотором преимуществе низкопоточного диализа, способствующего сохранению высокой активности ферментов цитозоля печени. Исследования низко - и высокопоточного альбуминового диализа на аппарате «Биоискусственная печень» также показали возможность использования обоих вариантов для экстракорпоральной детоксикации, но наибольшей эффективностью обладает высокопоточный режим. Таким образом, в условиях альбуминового диализа целесообразно использование высокопоточного режима, а в условиях цитозольной терапии -низкопоточного.
Список использованной литературы:
1. Белкин А.Л., Осадчая Л.П. Определение концентрации аммиака в небольших количествах крови // Лаб. дело. 1977. № 3. С. 177.
2. Габриэлян Н.И., Липатова В.И. Опыт использования показателя средних молекул в крови для диагностики нефрологических заболеваний у детей // Лаб. Дело. 1984. № 3. С.138-140.
3. Карузина И.И., Арчаков А.И. Выделение микросомной фракции печени и характеристика её окислительных систем // Современные методы в биохимии.- М., 1977.- С. 49 - 62.
4. Коренман И.М. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений // М.: Химия, 1970. С.343.
5. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии.- М.: Высшая школа, 1980.- 272 с.
6. Рябинин В. Е. и др. Использование искусственных систем жизнеобеспечения и клеточных технологий при лечении заболеваний печени. - Издательство «ОАО Челябинский Дом печати», - Челябинск. - 2007. 148с.
7. Рябинин В.Е., Асылгужин М.М., Уставщиков С.С. Материал В.Е. Рябинина для искусственной печени, способ его использования и искусственная печень. Патент на изобретение №2135194.-1999.
8. Рябинин В.Е., Полевщикова Е.Е. Аппарат для диализа. Патент на полезную модель № 56191 РФ. 10.09.2006.
9. Рябинин В.Е., Полевщикова Е.Е., Супрун В.И., Егоров А.П. Аппарат для альбуминовой и цитозольной детоксикации // Медицинская техника. - 2014. - №3. - С. 14-17.
10.Рябинин В.Е., Супрун В.И., Ткачев С.И. Использование искусственных систем жизнеобеспечения и клеточных технологий при лечении заболеваний печени. - Челябинск, 2007. - 131 с.
11.Шорманов В.К. Экстракционно-фотометрическое определение нитрофенолов в биологических жидкостях // Журнал аналитической химии. - 2002. - Т.57, №2. - С.130-135.
12.Farid N. A. et al. Improved colorimetric determination of salicylic acid and its metabolites in urine //Clinical chemistry. - 1975. - Т. 21. - №. 8. - С. 1167-1168.
13.Jan Stange. Extracorporeal liver support.// Organogenesis. 2011 Jan-Mar; 7(1): 64-73.
© Полевщикова Е.Е., Рябинин В.Е., 2016
