CC BY
14
24 ^tl ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА
Том 17, № 8. 2019
УДК 616.24-002-07:616.98:578.828.6HIV В.В. БЕЛОУСОВ1, А.У. САБИТОВ1, Е.В. ЦЫГАНКО2
1Уральский государственный медицинский университет МЗ РФ, г. Екатеринбург 2Городская клиническая больница №40, г. Екатеринбург
Значимость полимеразной цепной реакции орофарингеальных смывов в диагностике пневмоний, вызванных Pneumocystis jirovecii у ВИЧ-инфицированных
Контактная информация:
Белоусов Виталий Витальевич — ассистент кафедры инфекционных болезней и клинической иммунологии Адрес: 620028, г. Екатеринбург, ул. Репина, д. 3, тел. +7-922-159-07-47, e-mail: vitalB@icloud.com
Цель исследования — оценить эффективность метода ПЦР-исследования ротоглоточных смывов в диагностике пневмоцистоза у ВИЧ-инфицированных, госпитализированных в специализированный инфекционный стационар г. Екатеринбурга.
Материал и методы. В исследование включены 323 ВИЧ-инфицированных пациента в возрасте от 23 до 35 лет. Критериями включения в исследование были наличие клинических и рентгенологических признаков поражения нижних дыхательных путей при ВИЧ-инфекции. Окончательный диагноз пневмоцистной пневмонии устанавливался на основании совокупности клинико-лабораторных показателей, результатов компьютерной томографии легких и аутопсийных данных. Полученные результаты использовались для оценки эффективности ПЦР-исследования орофарингеальные смывов.
Результаты. ПЦР-исследование ротоглоточных смывов для диагностики пневмоцистной пневмонии показало чувствительность — 90,3%, специфичность — 94,7%. Прогностическая значимость положительного результата составила 75,8%, отрицательного результата — 98,1%.
Заключение. Полученные данные позволяют использовать ПЦР-исследование ротоглоточных смывов для диагностики P. Jirovecii в случаях, когда инвазивные процедуры сбора материалы, такие как бронхоальвеолярный лаваж, и бронхоскопия, недоступны или противопоказаны.
Ключевые слова: ВИЧ-инфекция, пневмоцистная пневмония, малоинвазивная диагностика.
(Для цитирования: Белоусов В.В., Сабитов А.У., Цыганко Е.В. Значимость полимеразной цепной реакции орофарингеальных смывов в диагностике пневмоний, вызванных Pneumocystis jirovecii у ВИЧ-инфицированных. Практическая медицина. 2019. Том 17, № 8, С. 24-27)
DOI: 10.32000/2072-1757-2019-8-24-27
V.V. BELOUSOV1, A.U. SABITOV1, E.V. TSYGANKO2
1Urals State Medical University of the MH of RF, Yekaterinburg 2City Clinical Hospital №40, Yekaterinburg
Significance of oropharyngeal lavages polymerase chain reaction in diagnosing pneumonia caused by Pneumocystis jirovecii in the HIV-infected
Contact:
Belousov V.V. — Assistant of the Department of Infectious Diseases and Clinical Immunology
Address: 3 Repin Str., Yekaterinburg, Russian Federation, 620028, tel. +7-922-159-07-47, e-mail: vitalB@icloud.com
Objective — to evaluate the effectiveness of the PCR testing of oropharyngeal lavages for diagnosing pneumocystosis in HIV-infected patients hospitalized in a specialized Infectious Diseases Hospital in Yekaterinburg.
Material and methods. The study included 323 HIV-infected patients aged 23 to 35 years who were treated in the Infectious Diseases Hospital in Yekaterinburg from 2012 to 2017. The criteria for inclusion in the study were the presence of clinical and radiological signs
Том 17, № 8. 2019
PRACTICAL MEDICINE ^ 25
of lower respiratory tract damage in HIV infection. The final diagnosis of Pneumocystis pneumonia was established on the basis of a combination of clinical and laboratory parameters, the results of computed tomography of the lungs and autopsy data. The results were used to evaluate the effectiveness of PCR studies of oropharyngeal lavages.
Results. A PCR study of oropharyngeal swabs for the diagnosis of pneumocystic pneumonia showed sensitivity of 90.3% and specificity of 94.7%. The prognostic significance of a positive result was 75.8%, of a negative result — 98.1%.
Conclusion. The data obtained allow the use of a PCR study of oropharyngeal lavages to diagnose P. Jirovecii in cases where invasive procedures for collecting materials, such as bronchoalveolar lavage and bronchoscopy are not available or are contraindicated.
Key words: HIV-infection, pneumocystis pneumonia, minimally invasive diagnosis.
(For citation: Belousov V.V., Sabitov A.U., Tsyganko E.V. Significance of oropharyngeal lavages polymerase chain reaction in diagnosing pneumonia caused by Pneumocystis jirovecii in the HIV-infected. Practical Medicine. 2019. Vol. 17, № 8, P. 24-27)
Pneumocystis jirovecii (P. Jirovecii) — это патогенный гриб, являющийся возбудителем пневмоцист-ной пневмонии у пациентов с иммунодефицитами разной этиологии, в том числе вызванным вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Диагноз пневмо-цистной пневмонии устанавливается на основании клинических признаков, лабораторных данных и результатах инструментальных методов исследования [1]. «Золотым стандартом» этиологической диагностики является обнаружение цист и вегетативных форм P. Jirovecii методом микроскопии или иммунофлюоресценции в диагностическом материале, полученном при бронхоскопии или бронхоаль-веолярном лаваже [1]. Чувствительность и специфичность указанного метода более 95% [3, 4]. Схожую эффективность демонстрирует исследование материала, полученного при трансбронхиальной биопсии, открытой биопсии легких [5, 6]. Все методы забора респираторного материала являются инвазивными, обладают набором побочных эффектов и противопоказаны у пациентов с выраженной дыхательной недостаточностью. Использование менее инвазивных способов забора материала, таких как индуцированная мокрота или ротоглоточные смывы демонстрировало снижение чувствительности микроскопических и иммунофлюоресцентных методов исследования с 78% до 45% [4, 7].
Внедрение полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения P. jirovecii в респираторных пробах привело к значительному увеличению чувствительности диагностики, в том числе при использовании менее инвазивных методик забора материала [8]. Литературные данные об эффективности исследования респираторного материала методом ПЦР — противоречивы. Часть авторов указывают на высокую чувствительность и специфичность полимеразной цепной реакции для диагностики пневмоцистозов: 89% и 94% соответственно, другие регистрируют снижение чувствительности и специфичности ПЦР-исследования (44% и 77% соответственно) из-за попадания в долю положительных результатов пациентов с бессимптомным носительством P. jirovecii (от 9 до 69%) и возможность ложноотрицательно-го результата у пациентов с низкой концентрацией возбудителя в верхних отделах респираторного тракта [8-10]. Неоднозначные результаты исследований диагностической значимости молекулярно-генетических методов исследования ротоглоточных смывов объясняется различиями в выборке пациентов [11].
Эпидемиология вторичных поражений легких отличается в зависимости от регионов [1]. В приведенных выше исследованиях распространенность
носительства Р. jiroveciiу ВИЧ-инфицированных пациентов варьировала от 9 до 69% [1, 3-5, 7]. Эпидемиологическая структура вторичных поражений легких, доступность ВААРТ и вторичной профилактики так же зависели от региона, в котором проходило исследование [1]. Охват ВААРТ (до 90%) и благоприятная эпидемиологическая ситуация по туберкулезу явилась причиной преобладания грибковых (в том числе вызванных Р. Jirovecii) поражений легких у ВИЧ-инфицированных в Западных странах. В России пневмоцистозы занимают в структуре ВИЧ-ассоциированных пневмоний третье место после бактериальных инфекций, туберкулеза легких. Разница в эпидемиологии вторичных заболеваний делает невозможным использование зарубежных диагностических алгоритмов и данных об эффективности диагностических тестов отечественными специалистами. Актуальным является проведение исследований эффективности различных диагностических тестов с учетом региональных особенностей в структуре вторичных заболеваний легких у ВИЧ-инфицированных. Особенно актуальным, учитывая сложности дифференциального диагноза между туберкулезом и пневмоцистозом у ВИЧ-инфицированных, становятся исследование эффективности малоинвазивных методов обнаружения Р. Jirovecii у ВИЧ-инфицированных пациентов.
Цель исследования — оценить эффективность метода ПцР-исследования ротоглоточных смывов в диагностике пневмоцистоза у ВИЧ-инфицированных, госпитализированных в специализированный стационар г. Екатеринбурга.
Материал и методы
В исследование включены 323 пациента с вторичными заболеваниями легких на фоне ВИЧ-инфекции в стадии 4Б-В, 5-ая по классификации В.И. Покровского (2010 г.), в возрасте от 23 до 37 лет, проходивших лечение в инфекционном стационаре г. Екатеринбурга с 2012 по 2017 гг. Средний уровень СD4-лимфоцитов равнялся 75,3 (45,2) кл/мкл. ВААРТ получали 68 (21,0%) пациентов. Отсутствие эффективности терапии выявлено у 50 (73,5%) пациентов, получающих ВААРТ (отсутствие вирусологического и иммунологического ответа), у 9 (13,2%) ВААРТ начата в течение 1 месяца до начала исследования. Профилактику пневмоцистоза в виде приема стандартной дозы триметоприма-суль-фометоксазола получали 63 (37,1%).
Этиологический диагноз пневмонии устанавливался на основании клинической картины. Предварительный диагноз подтверждался лучевыми
26 ^TL ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА Том 17, № 8. 2019
Таблица 1. Результаты ПЦР-исследования орофарингеальных смывов ВИЧ-инфицированных с вторичным поражением легких
Table 1. Results of PCR-testing of oropharyngeal lavages of the HIV patients with secondary lesion of lungs
Клинико-лабораторный диагноз
ПЦР орофарингеальных смывов Пневмоцистная пневмония Пневмонии другой этиологии
ПЦР+ P. jirovecii 47 15
ПЦР-P. jirovecii 5 271
методами исследования, в том числе и компьютерной томографией легких — 289 (89,4%) пациентов, принявших участие в исследовании. У 63 (18,8%) пациентов были получены смывы бронхоальвео-лярного лаважа. Летальность в исследуемой группе составила 26,9% (87 случаев). Расхождений пато-логоанатомического и клинического диагнозов не было.
В зависимости от этиологии вторичного поражения легких участники разделены на 2 группы.
Пациенты с пневмониями непневмоцистозной этиологии (271 человек) отнесены к группе 1. Среди этих пациентов большую долю, 138 (50,9%) пациентов, занимали пациенты с бактериальным поражение легких на фоне ВИЧ-инфекции, туберкулезное поражение легких — у 127(46,8%) пациентов и занимает второе место. У оставшихся 6 (2,2%) участников исследования диагностированы пневмонии другой не пневмоцистозной этиологии (цитомегаловирусная инфекция (3 человека), генерализованный криптококкоз (2 человека), атипичные микобактериозы (1 случай).
В группу 2 попали 52 (16%) пациента с ВИЧ-ассоциированной пневмоцистной пневмонией. Этиологический диагноз устанавливался на основании клинической картины: подострое начало заболевания с частого кашля, субфебрильной температуры и с медленно нарастающей острой дыхательной недостаточностью. Предварительный диагноз подтверждался лучевыми методами исследования, в том числе и компьютерной томографией легких — 50 (96,1%). Наиболее частым рентгенологическим симптомом стало обнаружение зон снижения воздушности легочной ткани по типу «матового стекла». У 21 (40,3%) пациентов были получены смывы бронхоальвеолярного лаважа с последующим обнаружением Р. jirovecii методом непрямой иммуноф-люоресценции («ПневмоцистоФлюоАГдиагности-
ка»). Летальность в исследуемой группе составила 13,4% (7 случаев). Патологоанатомическими находками стали типичные для пневмоцистной пневмонии на фоне ВИЧ-инфекции изменения в легких: пенистый эозинофильный инфильтрат содержащий цисты возбудителя.
Для уточнения этиологии вторичного поражения легких и исключения микстинфицирования в исследовании использовалась полимеразная цепная реакция для выявления ДНК цитомегаловируса и ДНК mycobacterium tuberculosis complex, c использованием наборов «АмплиСенс», в респираторных пробах.
С целью оценки эффективности ПЦР исследования на P. Jirovecii у всех пациентов (323) при поступлении, до начала эмпирической терапии забирались орофарингеальные смывы. Для этого пациентов просили прополоскать зев стерильным раствором натрия хлорида 0,9% и сплюнуть в стерильный контейнер. Из каждого образца проводили выделение тотальной ДНК с использованием набора «ДНК Сорб-Б». Полученные после экстракции образцы анализировались на наличие ДНК Pneumocystis jirovecii с использованием тест системы «Ампли Сенс». В данной тест-системе генетической мишенью служит ген, кодирующий большую субъединицу митохондриальной рРНК Pneumocystis jirovecii. Качество выполнения теста оценивается при помощи эндогенного внутреннего контроля, в качестве которого используется ДНК гена В-глобина человека.
Все пациенты дали информированное добровольное согласие на участие в исследовании.
Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы Biostat, Statistica 6.0. Определялось процентное выражение ряда данных (%), средняя арифметическая (М), средняя ошибка средней арифметической (т). Сравнитель-
Таблица 2. Результаты ПЦР-исследования орофарингеальных смывов ВИЧ-инфицированных с вторичным поражением легких
Table 2. Results of PCR-testing of oropharyngeal lavages of the HIV patients with secondary lesion of lungs
Чувствительность Специфичность Прогностическая ценность
Положительная Отрицательная
90,3% 94,7% 75,8% 98,1%
Том 17, № В. 2019
PRACTICAL MEDICINE ^ 27
ная оценка статистических данных проводилась с помощью непараметрических методов: критерия x2. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.
Эффективность диагностического теста оценивалась по следующим показателям:
1) Чувствительность = а/(а+с);
2) Специфичность = d/(b+d);
3) ПЦ+ = а/(а+Ь);
4) ПЦ- = d/(c+d),
Где a — число истинноположительных результатов; b — число ложноположительных результатов; с — число ложноотрицательных результатов; d — число истинноотрицательных результатов. ПЦ+ определяется вероятностью получения положительного результата у больного человека. ПЦ-определяется вероятностью получения ошибочного отрицательного результата.
Результаты
В группе ВИЧ-инфицированных пациентов с установленным диагнозом пневмоцистная пневмония РНК P. Jirovecii в орофарингеальных пробах была выделена у 47 человек (90,3%). Обследование 5 пациентов с клинически установленным диагнозом пневмоцистная пневмония дало отрицательный результат.
В группе ВИЧ-инфицированных пациентов с пневмониями другой этиологии (271 человек), результаты ПЦР-исследования орофарингеальных смывов на P. jirovecii были отрицательными у 256 (94.4%). У 15 (5,5%) участников исследования были получены положительные результаты ПЦР-исследования орофарингеальных смывов при этом рентгенологических или клинических признаков пневмоцистной пневмонии обнаружено не было.
Обсуждение
ПЦР-исследование орофарингеальных смывов на P. Jirovecii показало высокую чувствительность и специфичность. Различия в распространенности пневмоцистоза не повлияли на прогностическую значимость положительного и отрицательно результатов (75,8% и 98,1% соответственно). Полученные данные позволяют использовать ПЦР-исследование орофарингеальных смывов для диагностики P. Jirovecii в случаях, когда инвазив-ные процедуры сбора материалы, такие как брон-хоальвеолярный лаваж, и бронхоскопию, недоступны или противопоказаны.
Ложноположительные результаты ПЦР-исследования орофарингеальных смывов 15 пациентов чаще наблюдались у пациентов с низким иммунным статусом CD4 <10 кл/мкл, что статистически ниже среднего уровня CD4 клеток у пациентов учавствовавших в исследовании — 75,3 (45,2) (p<0.05). Такую взаимосвязь можно объяснить течением микст-инфекции (туберкулез легких + пнев-моцистная пневмония, бактериальная пневмония + пневмоцистная пневмония) у пациентов с терминальной стадией ВИЧ-инфекции. Гистологическое исследования аутопсийного материала, полученного у пациентов с ложноположительными результатами ПЦР-тестирования, выявило цисты p. jirovecii в тканях легких. Значимость обнаружения P. Jirovecii в этой группе не однозначна, так как вклад именно пневмоцистоза в патологические процессы в легочной ткани требует уточнения. Летальность в этой
группе была самой высокой, из 15 пациентов с лож-ноположительным результатом умерло 14 (93,3%), патологоанатомический диагноза во всех случаях был диссеминированный туберкулез легких.
Ложноотрицательные результаты статистически чаще наблюдались у пациентов, получающих профилактику оппортунистических инфекций (три-метроприм-сульфаметоксазол) на догоспитальном этапе более 1 месяца до начала исследования, а также у пациентов у которых забор материала проводился на фоне этиотропной терапии пневмоци-стоза назначенной амбулаторно (p<0.05).
Заключение
ПЦР орофарингеальных смывов позволяет избежать затратных инвазивных процедур, позволяет в кратчайшие сроки установить этиологический диагноз и назначить соответствующую терапию, что является принципиально важным в условиях повышенной заболеваемости туберкулезом. К недостаткам метода можно отнести снижение специфичности результатов у пациентов с низким иммунным статусом в терминальной стадии ВИЧ-инфекции из-за возможной полиэтиологичности оппортунистических инфекций у этой группы пациентов. Еще одним ограничением являются снижение чувствительности у пациентов, получавших профилактическую или лечебную терапию до выполнения исследования, из-за снижения количества возбудителя в верхних отделах респираторного тракта.
Белоусов В.В.
https://orcid.org/0000-0001-5613-126X
ЛИТЕРАТУРА
1. Benito N., Moreno A., Miro J.M., Torres A. Pulmonary infections in HIV-infected patients: an update in the 21st century // European Respiratory Journal. - Mar 2012. - 39 (3). - P. 730-745. DOI: 10.1183/09031936.00200210
2. Hviid C.J., Lund M., S0rensen A., et al. Detection of Pneumocystis jirovecii in oral wash from immunosuppressed patients as a diagnostic tool // PLoS ONE. - 2017. - 12 (3). - P. e0174012. https://doi. org/10.1371/journal.pone.0174012
3. Elvin K.M., Bjorkman A., Linder E., et al. Pneumocystis carinii pneumonia: detection of parasites in sputum and bronchoalveolar lavage fluid by monoclonal antibodies // BMJ. — 1988. — 297 (6645). — P. 381-4.
4. Joseph A. Kovacs, Valerie L.Ng., Valerie L. NG, et al. Diagnosis of Pneumocystis carinii Pneumonia: Improved Detection in Sputum with Use of Monoclonal Antibodies // N. Engl. J. Med. — 1988. — 318. — P. 589-593. DOI: 10.1056/NEJM198803103181001
5. Harris J.R., Marston B.J., Sangrujee N., et al. Cost-effectiveness analysis of diagnostic options for pneumocystis pneumonia (PCP) // PLoS One. — 2011. — 6 (8). — P. e23158.
6. Самитова Э.Р., Ермак Т.Н., Токмалаев А.К., и др. Диагностика пневмоцистной пневмонии у больных ВИЧ-инфекцией // Инфекционные болезни. — 2007. — Т. 5, №4. — С. 66-68.
7. Chouaid C., Roux P., Lavard I., et al. Use of the polymerase chain reaction technique on induced-sputum samples for the diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia in HIV-infected patients. A clinical and cost-analysis study // Am. J. Clin. Pathol. — 1995 Jul. — 104 (1). — P. 72-5.
8. Olsson M., Elvin K., Lofdahl S., Linder E. Detection of Pneumocystis carinii DNA in sputum and bronchoalveolar lavage samples by polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. — 1993 Feb. — 31 (2). — P. 221-6.
9. Helweg-Larsen J., Jensen J.S., Benfield T., et al. Diagnostic use of PCR for detection of Pneumocystis carinii in oral wash samples // J. Clin. Microbiol. — 1998. — 36 (7). — P. 2068-72.
10. Low Sensitivity of a Nested Polymerase Chain Reaction in Oropharyngeal Washings for the Diagnosis of Pneumocystis Pneumonia in HIV-Infected Patients Nyamande, Kennedy et al. // CHEST. — 2005. — Vol. 128 , Is. 1. — P. 167-171. https://doi.org/10.1378/ chest.128.1.167
11. Weig M., Klinker H., Bogner B.H., et al. Usefulness of PCR for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia in different patient
