CC BY
6
Научная статья/Research Article
УДК 619:577.21:001.608.1:616-022.14:636.2
DOI: 10.36718/1819-4036-2022-12-127-133
Наталья Александровна Безбородова1^, Вероника Валентиновна Кожуховская2, Антонина Павловна Порываева3, Евгения Николаевна Шилова4, Елена Владимировна Печура5
и3А5Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр УрО РАН, Екатеринбург, Россия
[email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected]
ЗНАЧЕНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В ВЫЯВЛЕНИИ ИНФЕКЦИОННЫХ АГЕНТОВ У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Целью нашей работы являлось выявление методом ПЦР бактериальных и вирусных инфекционных агентов в биологическом материале от коров и телят при разном клиническом проявлении заболеваний. Биологический материалы от животных поступали в ПЦР-лабораторию из 23 сельскохозяйственных организаций Уральского региона. Всего исследовано 808 проб, из них в 11,9 % случаев обнаружены геномы патогенов: ДНК Mycoplasma bovis в 2,4 % проб, РНК Bovine virus diarrhoea в 2,3 % проб, ДНК Mycoplasma spp. и Chlamydia spp.в 2 % проб, единично встречались Mycoplasma bovigenitalium, Bovine herpesvirus (type 1), Chlamydophila abortus, Chlamydophila pecorum. Из 80 проб в 36,2 % биоматериалов были обнаружены специфические участки ДНК Cl. difficile - 31,2 % проб, Cl. perfringens - 20,0 % проб, Cl. Difficile + Cl. Perfringens - 25,0 % биопроб. У Cl. difficile были обнаружены токсины: CDTтоксин у 41,0 % клостридий, токсин В у 6,0 % патогенов, реже токсин А. В отдельных случаях в биоматериале от погибших телят были обнаружены клостридии (Cl. perfringens, Cl. difficile В), что подтвердило диагноз - инфекционная анаэробная энтеротоксемия телят. В биоматериале от павших коров были выявлены бактерии (E. coli, Salmonella enterica spp. entericaserogroup C (0:9, 2), ДНК Cl. Perfringens и Cl. difficile CDT), что подтвердило диагноз - острая кишечная инфекция. Все обнаруженные патогены были представлены в виде моноинфекции и единично в виде микст-инфекций. С помощью ПЦР удалось обнаружить ДНК и РНК инфекционных агентов при разном клиническом проявлении заболеваний бактериальной и вирусной этиологии в стадах крупного рогатого скота на территории Уральского региона.
Ключевые слова: ДНК, РНК, ПЦР-диагностика, Mycoplasma spp., Chlamydia spp., Bovine herpesvirus 1, Bovine virus diarrhoea
Для цитирования: Значение полимеразной цепной реакции в выявлении инфекционных агентов у крупного рогатого скота / Н.А. Безбородова [и др.] // Вестник КрасГАУ. 2022. № 12. С. 127-133. DOI: 10.36718/1819-4036-2022-12-127-133.
© Безбородова Н.А., Кожуховская В.В., Порываева А.П., Шилова Е.Н., Печура Е.В., 2022 Вестник КрасГАУ. 2022. № 12. С. 127-133. Bulliten KrasSAU. 2022;(12):127-133.
Natalia Alexandrovna Bezborodova1®, Veronika Valentinovna Kozhukhovskaya2, Antonina Pavlovna Poryvaeva3, Evgenia Nikolaevna Shilova4, Elena Vladimirovna Pechura5
12,3,45Ural Federal Agrarian Research Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences,
Yekaterinburg, Russia
THE IMPORTANCE OF PCR IN THE INFECTIOUS AGENTS DETECTION IN CATTLE
The aim of our work was to identify bacterial and viral infectious agents in biological material from cows and calves with different clinical manifestations of diseases by PCR. Biological materials from animals were sent to the PCR laboratory from 23 agricultural organizations in the Ural Region. A total of 808 samples were studied, of which genomes of pathogens were found in 11.9 % of cases: Mycoplasma bovis DNA in 2.4 % of samples, Bovine virus diarrhoea RNA in 2.3 % of samples, Mycoplasma spp. and Chlamydia spp DNA in 2 % of samples, Mycoplasma bovigenitalium, Bovine herpesvirus (type 1), Chlamydophila abortus, Chlamydophila pecorum were found singly. Out of 80 samples in 36.2 % of biomaterials, specific DNA sites of Cl. difficile were found - 31.2 % of samples, Cl. perfringens - 20.0 % of samples, Cl. difficile + Cl. perfringens - 25.0 % of biosamples. Toxins were found in Cl. difficile: CDT toxin in 41.0 % of clostridia, toxin B in 6.0 % of pathogens, less often toxin A. In some cases, clostridia (Cl. perfringens, Cl. difficile B) were found in the biomaterial from dead calves, which confirmed the diagnosis - infectious anaerobic enterotoxemia of calves. Bacteria (E. coli, Salmonella enterica spp. entericaserogroup C (0:9, 2), Cl. perfringens and Cl. difficile CDT DNA) were detected in the biomaterial from dead cows, which confirmed the diagnosis of acute intestinal infection. All detected pathogens were presented in the form of monoinfection and singly in the form of mixed infections. Using pCr, it was possible to detect DNA and RNA of infectious agents in various clinical manifestations of diseases of bacterial and viral etiology in cattle herds in the Ural Region.
Keywords: DNA, RNA, PCR diagnostics, Mycoplasma spp., Chlamydia spp., Bovine herpes virus1, Bovine virus diarrhea
For citation: The importance of pcr in the infectious agents detection in cattle / N.A. Bezborodova [et al.] // Bulliten KrasSAU. 2022;(12): 127-133. (In Russ.). DOI: 10.36718/1819-4036-2022-12-127-133.
Введение. Возникновение любого заразного заболевания крупного рогатого скота сопровождается серьезными экономическими убытками. При обнаружении больных особей нужно немедленно проводить диагностические исследования на определение патогенного агента, вызывающего заболевание, и последующие своевременные лечебно-профилактические мероприятия [1, 2].
Инфекционные болезни вызывают микроорганизмы (вирусы, бактерии), попадающие в организм крупного рогатого скота различными путями. Ряд возбудителей обладают политропизмом и вызывают сходные клинические признаки, что затрудняет диагностику заболевания. Такие заболевания, как хламидийная и микоплазменные инфекции, инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота (ИРТ КРС), вирусная диарея крупного рогатого скота (ВД КРС) и клостридиозы,
протекают с поражением респираторной, репродуктивной, пищеварительной систем и имеют разные формы течения заболевания - от острых до латентных [3, 4]. Молодняк крупного рогатого скота переболевает чаще в острой форме с выраженными клиническими признаками, а у взрослого поголовья клиническая картина имеет стертый характер, заболевания протекают хронически и бессимптомно [5, 6].
Панель диагностических тестов по определению инфекционных заболеваний включает серологические, иммуноферментные, микробиологические, вирусологические и молекулярно-генети-ческие исследования. Все перечисленные методы имеют специфические особенности [2, 7]. Метод ПЦР позволяет выявлять генетический материал некультивируемых патогенных агентов, идентифицировать геномы возбудителя, проводить типизацию и видовую идентификацию ви-
русных и бактериальных молекул при скрытых формах течения заболеваний [8].
Для сохранения эпизоотического благополучия в стадах крупного рогатого скота необходимо проведение мониторинговых исследований, которые позволяют определить спектр возбудителей, циркулирующих в стадах крупного рогатого скота, и своевременно провести профилактические мероприятия [1, 9]. На этом основаны программы оздоровительных и противоэпизо-отических мероприятий для сохранения здоровья сельскохозяйственных животных и получения продукции животноводства [4, 10].
Цель исследований - выявление бактериальных и вирусных инфекционных агентов в биологическом материале от коров и телят методом ПЦР.
Материалы и методы. Исследования проводились в рамках Государственного задания Минобрнауки России в ФГБНУ УрФАНиЦ УрО РАН. Биологические пробы от коров и телят были направлены на исследования из 23 сельскохозяйственных предприятий Уральского региона в период с 2017 по 2021 г. Биологические пробы: молоко, цельная кровь, соскобы из слизистой цервикального канала, с носовой полости, кусочки плаценты, кал; суставная жидкость, смывы с конъюнктивы и слизистой оболочки носовой полости у молодняка; образцы органов и тканей (кусочки гортани, носовой перегородки, легкого, трахеи) от павших телят; внутренние органы от абортированных плодов.
Биоматериал от животных, подозрительных на клостридиальную инфекцию, поступил в лабораторию в количестве 80 проб, отобранных из 10 ферм за период с 2020 по 2021 г. Биологический материал: навоз, смывы с раневых поверхностей копытец; внутренние органы от погибших телят (кусочки печени, почек, сердца, легких и селезенки).
В общей сложности было исследовано 808 проб биоматериала.
В ПЦР использовали набор для выделения ДНК «Diatom DNA Prep 200» (Россия), набор для выявления ДНК Mycoplasma spp., Mycoplasma bovis и Mycoplasma bovigenitalium (Россия), ИРТ крупного рогатого скота «Gen Pak DNA PSR Test BHV1» (Россия), ВД крупного рогатого скота (Россия), Chlamydia spp., C. abortus, C. pecorum (Россия), наборы «РеалБест-Вет ДНК Clostridium difficile/Clostridium perfringens», «РеалБест-Вет ДНК Clostridium difficile tcdA/tcdB/CDT» (Россия).
Амплификацию проводили на Rotor-Gene 3000 (Австралия), QuantStudio 5 (США), SWIFT Maxi PROESCO (США). Электрофорез с применением мини-камер: Mini-Sub Cell GT (США), CHEMIDOC XRS+ (США).
Результаты и их обсуждение. Проведенные нами исследования 808 биоматериалов методом ПЦР показали, что ДНК и РНК патогенных возбудителей обнаружены в 96 пробах (12,9 %). ДНК Mycoplasma bovis выявлена в 2,4 % проб, РНК Bovine virus diarrhoea (BVD) - в 2,3 % проб, геномы Mycoplasma spp. и Chlamydia spp. - в 2 %, генетический материал Mycoplasma bovigenitalium, Bovine herpes virus (type 1) (BHV-1), Chlamydophila abortus, Chlamydophila pecorum выявлен единично (рис.).
При анализе выявления возбудителей установлено, что в вагинальных соскобах от коров, в образцах последа и в материалах от абортированных плодов аминокислотные последовательности Bovine herpes virus (type 1) обнаружены в 1 % случаев от числа исследованных проб, РНК Bovine virus diarrhoea - в 2,3 % случаев.
Единично в пробах суспензии органов от абортированного плода и в последе от коровы присутствовали аминокислотные последовательности BVD и BHV-1. Что говорит о циркуляции вируса диареи крупного рогатого скота и герпес-вируса 1-го типа в сельскохозяйственных предприятиях Уральского региона в форме латентных, бессимптомных и хронических заболеваний.
В проведенных нами исследованиях биопроб от коров и телят на наличие ДНК бактерий рода Mycoplasma spp. диагностировали в 2 % случаев, геномы Mycoplasma bovis в 2,4 % случаев и Mycoplasma bovigenitalium в 1,2 % случаев. Mycoplasma bovis была выделена из образцов синовиальной жидкости от телят, из смывов с носоглотки телят, вагинальных соскобов у коров и биоматериалов от абортированных плодов. ДНК Mycoplasma bovigenitalium были обнаружены в смывах с носоглотки телят и цервикальных соскобах от коров в 1,2 % проб. Одновременное присутствие ДНК Mycoplasma bovis/Mycoplasma bovigenitalium было обнаружено в 3 образцах (смыв с носоглотки теленка, соскоб с влагалища у коровы, суспензия из органов абортированного плода). Данные диагностических исследований говорят о том, что среди молодняка и взрослого поголовья крупного рогатого скота происходит постоянная циркуляция двух видов микоплазм - Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium.
Частота встречаемости геномов возбудителей
[ИМЯ КАТЕГОРИИ] 87,1%
■ " 2%
2%
Положительные пробы 12,9%
= Отрицательные пробы
Mycoplasma spp. r Chlamydia spp. " Mycoplasma bovigenitalium Bovine herpes virus (type 1) ^ Chlamydophila abortus ■ Chlamydophila pecorum " Mycoplasma bovis 1 Bovine virus diarrhoea
Спектр возбудителей, выделенных в образцах биоматериала (n = 808)
В 2 % проб были выделены геномы Chlamydia spp. из соскобов со слизистых оболочек влагалища от коров, абортировавших на разных сроках беременности. ДНК Chlamydophila abortus встречали единично только из биологических проб от абортировавших коров (соскобы со слизистой оболочки влагалища и пробы плаценты). Chlamydophila pecorum была обнаружена в 1 % проб вагинальных соскобов коров, в смывах с конъюнктивы и носоглотки у телят с признаками кератоконъюнктивита и пневмонии.
Нами выявлены микст-инфекции при разном сочетании патогенов. Так, в смывах носоглотки телят присутствовали ДНК Mycoplasma bovigenitalium + Chlamydophila pecorum, Chlamydophila pecorum+ BVD. В суспензии органов от абортированного плода выявлена ассоциация BHV-1 + BVD + Mycoplasma bovigenitalium + Mycoplasma bovis; в суспензиях органов от абортированных плодов Mycoplasma bovigenitalium + BVD, BHV-1 + BVD. Полученные данные свидетельствуют об активной циркуляции возбудителей бактериальных и вирусных инфекций в обследуемых стадах крупного рогатого скота.
В биологических пробах от животных в 36,2 % образцов были обнаружены специфические участки ДНК клостридий: Cl. difficile - 31,2 % проб, Cl. perfringens - 20,0 % проб, Cl. Difficile + Cl. perfringens - 25,0 % биопроб. Геномы Cl. difficile и Cl. perfringens чаще обнаруживали в биопробах кала - 23,2 %, в образцах молока -8,0 %, реже в биоматериале от погибших коров и
телят - 5,0 %. Выявленные Cl.difficile обладали токсигенностью в 48,0 % случаев. Бинарный токсин (CDT) присутствовал у 41,0 % клостридий. Токсинотип В выявлен у 6,0 % анаэробов. Реже встречали токсинотип А, а также сочетание нескольких токсинотипов A/B/CDT в одной пробе в 6,0 % случаев, единично Cl. difficile A/B, A/CDT, B/CDT. Остальные Cl. difficille были отнесены к токсин-отрицательным.
В отдельном случае с помощью ПЦР-диагностики в биоматериале от погибших телят были обнаружены основные патогены -Cl. Perfringens и Cl. difficile В, что подтвердило диагноз - инфекционная анаэробная энтероток-семия телят. В биоматериале от павших коров были выявлены бактерии E. coli и Salmonella enterica spp. enterica serogroup C (0 : 9, 2), а также ДНК Cl. perfringens и Cl. difficile CDT, что подтвердило диагноз - острая кишечная инфекция у погибших животных.
В пробах молока от коров с признаками воспалительного процесса молочной железы были обнаружены геномы Cl. difficille A/B/CDT - 31,2 % проб и Cl. perfringens - 12,5 % проб, ДНК Staphylococcus spp. в 40,0 % проб, E. Coli / S. agalactiae в 30,0 % проб, ДНК S. aureus в 26,6 % проб.
Проведенные нами лабораторные исследования показали высокую выявляемость клостри-дий в биоматериале. В некоторых образцах была
выделена полимикробная инфекция, которая включала аэробные и анаэробные бактерии.
Заключение. В результате проведенных ПЦР-исследований было выявлено, что в поступивших биообразцах присутствовали геномы возбудителей инфекционных заболеваний в 11,9 % случаев.
Наибольшее количество образцов биоматериала при обследовании коров с нарушением воспроизводства содержали геномы Mycoplasma bovis (в 2,4 % случаев) и BVD (в 2,3 % проб). В 2 % проб были выделены геномы Chlamydia spp. (Chlamydophila abortus и Chlamydophila pecorum) и ДНК бактерий рода Mycoplasma spp. (Mycoplasma bovis и Mycoplasma bovigenitalium). ДНК герпес-вируса первого типа была выявлена в 1 % проб. Также в пробах единично выявлено сочетание генетического материала нескольких инфекционных возбудителей: Mycoplasma bovis / Mycoplasma bovigenitalium; Mycoplasma bovigenitalium / Chlamydophila pecorum; BHV-1 / BVD / Mycoplasma bovigenitalium / Mycoplasma bovis; Chlamydophila pecorum / BVD; Mycoplasma bovigenitalium / BVD / BHV-1).
Полученные результаты показывают наличие циркуляции данных патогенов в молочных стадах Уральского региона.
При диагностике анаэробных инфекций в 36,2 % образцов от животных были обнаружены специфические участки ДНК Cl. difficile - 31,2 % проб, Cl. perfringens - 20,0 % проб, Cl. Difficile + Cl. perfringens - 25,0 % биопроб. Cl. difficile обладали токсигенностью в 48,0 % случаев. CDT-токсин присутствовал у 41,0 % клостридий. Ток-синотип В выявлен у 6,0 % анаэробов. Единично токсинотип А. Остальные Cl. difficille были отнесены к токсин-отрицательным.
Таким образом, проведенные ПЦР-исследо-вания подтверждают необходимость проведения постоянных мониторинговых исследований у крупного рогатого скота на наличие инфекционных патогеных агентов. ПЦР-метод позволяет своевременно выявлять животных вирусо- и бактерионосителей. Детализация этиологического пейзажа возбудителей инфекционных заболеваний крупного рогатого скота и выявление биологических особенностей инфекционных агентов обеспечат эффективность противоэпи-зоотических, лечебно-профилактических и оз-
доровительных мероприятий как в конкретном
животноводческом предприятии, так и на территории субъекта в целом.
Список источников
1. Патоморфологические изменения в системе «мать-плацента-плод» у коров при хла-мидиозе / О.В. Соколова [и др.] // Ветеринария. 2020. № 12. С. 9-12.
2. Юров К.П., Гулюкин М.И. Контроль и пути оздоровления скота племенных хозяйств и племенных предприятий от инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи // Российская сельскохозяйственная наука. 2018. № 1. С. 59-63.
3. Красиков А.П., Рудаков Н.В., Заболот-ных М.В. Понятие паразитоценозов, смешанных и ассоциативных инфекций животных // Вестник ОмГАУ. 2016. № 4 (24). С. 158-165.
4. Нефедченко А.В., Гпотова Т.И, Гпотов А.Г. Комплексный подход к определению этиологической структуры респираторных болезней крупного рогатого скота в молочных хозяйствах // Вестник КрасГАУ. 2017. № 1 (124). С. 65-71.
5. Полимеразная цепная реакция в диагностике латентных, бессимптомных и хронических форм инфекционных заболеваний крупного рогатого скота / Н.А. Безбородова [и др.] // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. 2019. № 4. С. 30-33.
6. Патогенность нецитопатогенных изолятов вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек для серонегативных телят / А.Г. Глотов [и др.] // Вопросы вирусологии. 2014. № 4 (59). С. 46-49.
7. Значение лабораторных исследований в системе эпизоотологической характеристики и оптимизации эпизоотологического надзора за острыми респираторными вирусными инфекциями крупного рогатого скота / Е.В. Печура [и др.] // Ветеринарный фармакологический вестник. 2020. № 4(13). С. 151-158.
8. Красиков А.П., Алексеева И.Г. Комплексная диагностика инфекционных болезней круп-
Вестник, КрасТЯУ. 2022. № 12
ного рогатого скота // Электронный научно-методический журнал Омского ГАУ. 2015. № 1. С. 9.
9. Программы контроля инфекционных факторов, влияющих на репродуктивную функцию высокопродуктивных молочных коров / И.А. Шкуратова [и др.] // Ветеринария и кормление. 2020. № 2. С. 54-57.
10. Сравнительная характеристика клинических проявлений генитальной формы инфекционного ринотрахеита у коров и нетелей в условиях специфической вакцино-профилактики / М.В. Ряпосова [и др.] // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. 2017. № 3. С. 59-62.
References
1. Patomorfologicheskie izmeneniya v sisteme «mat'-placenta-plod» u korov pri hlamidioze / O.V. Sokolova [i dr.] // Veterinariya. 2020. № 12. S. 9-12.
2. Yurov K.P., Gulyukin M.I. Kontrol' i puti ozdo-rovleniya skota plemennyh hozyajstv i plemen-nyh predpriyatij ot infekcionnogo rinotraheita i virusnoj diarei // Rossijskaya sel'skohozyajst-vennaya nauka. 2018. № 1. S. 59-63.
3. KrasikovA.P., RudakovN.V, Zabolotnyh M.V. Ponyatie parazitocenozov, smeshannyh i associativnyh infekcij zhivotnyh // Vestnik OmGAU. 2016. № 4 (24). S. 158-165.
4. NefedchenkoA.V., Glotova T.I., Glotov A.G. Kompleksnyj podhod k opredeleniyu 'etiologi-cheskoj struktury respiratornyh boleznej krupnogo rogatogo skota v molochnyh hozyaj-
stvah // Vestnik KrasGAU. 2017. № 1 (124). S. 65-71.
5. Polimeraznaya cepnaya reakciya v diagnos-tike latentnyh, bessimptomnyh i hronicheskih form infekcionnyh zabolevanij krupnogo roga-togo skota / N.A. Bezborodova [i dr.] // Vopro-sy normativno-pravovogo regulirovaniya v veterinarii. 2019. № 4. S. 30-33.
6. Patogennost' necitopatogennyh izolyatov virusa virusnoj diarei-bolezni slizistyh obolochek dlya seronegativnyh telyat / A.G. Glotov [i dr.] // Voprosy virusologii. 2014. № 4 (59). S. 46-49.
7. Znachenie laboratornyh issledovanij v sisteme 'epizootologicheskoj harakteristiki i optimizacii 'epizootologicheskogo nadzora za ostrymi respiratornymi virusnymi infekciyami krupnogo rogatogo skota / E.V. Pechura [i dr.] // Vete-rinarnyj farmakologicheskij vestnik. 2020. № 4(13). S. 151-158.
8. Krasikov A.P., Alekseeva I.G. Kompleksnaya diagnostika infekcionnyh boleznej krupnogo rogatogo skota // 'Elektronnyj nauchno-metodi-cheskij zhurnal Omskogo GAU. 2015. № 1. S. 9.
9. Programmy kontrolya infekcionnyh faktorov, vliyayuschih na reproduktivnuyu funkciyu vysokoproduktivnyh molochnyh korov / I.A. Shkuratova [i dr.] // Veterinariya i kormle-nie. 2020. № 2. S. 54-57.
10. Sravnitel'naya harakteristika klinicheskih proyav-lenij genital'noj formy infekcionnogo rinotraheita u korov i netelej v usloviyah specificheskoj vakcinoprofilaktiki / M.V. Ryaposova [i dr.] // Voprosy normativno-pravovogo regulirovaniya v veterinarii. 2017. № 3. S. 59-62.
Статья принята к публикации 07.09.2022 / The article accepted for publication 07.09.2022. Информация об авторах:
Наталья Александровна Безбородова1, старший научный сотрудник отдела геномных исследований и селекции животных, кандидат ветеринарных наук
Вероника Валентиновна Кожуховская2, младший научный сотрудник лаборатории микробиологических и молекулярно-генетических методов диагностики
Антонина Павловна Порываева3, ведущий научный сотрудник лаборатории вирусных болезней, доктор биологических наук
Евгения Николаевна Шилова4, старший научный сотрудник лаборатории вирусных болезней, доктор ветеринарных наук
Елена Владимировна Печура5, старший научный сотрудник лаборатории вирусных болезней, кандидат ветеринарных наук
Information about the authors:
Natalia Alexandrovna Bezborodova1, Senior Researcher, Department of Genomic Research and Animal Breeding, Candidate of Veterinary Sciences
Veronika Valentinovna Kozhukhovskaya2, Junior Researcher, Laboratory of Microbiological and Molecular Genetic Diagnostic Methods
Antonina Pavlovna Poryvaeva3, Leading Researcher, Laboratory of Viral Diseases, Doctor of Biological Sciences
Evgenia Nikolaevna Shilova4, Senior Researcher, Laboratory of Viral Diseases, Doctor of Veterinary Sciences
Elena Vladimirovna Pechura5, Senior Researcher, Laboratory of Viral Diseases, Candidate of Veterinary Sciences
