CC BY
39
УДК 619:618:636.2:591.2
Ключевые слова: полимеразная цепная реакция, крупный рогатый скот, биологический материал, ДНК, инфекционные заболевания
Key words: polymerase chain reaction, cattle, biological material, DNA, infectious diseases
Безбородова Н.А., Кожуховская В.В.
ЗНАЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ
КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
THE IMPORTANCE OF MOLECULAR-BIOLOGICAL METHODS FOR DIAGNOSIS
OF CATTLE INFECTIOUS DISEASES
ФГБНУ «Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения РАН» Адрес: 620142, Россия, г. Екатеринбург, Белинского ул., д. 112 A. Тел. +7 343 257-20-44, факс 8 (343) 257-82-63. E-mail: info@urnivi.ru
Ural Federal Agrarian Scientific Research Center, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences,
Federal State Budgetary Scientific Institution Address: 620142, Russia, Ekaterinburg, Belinskogo st., 112 A. Tel. +7 343 257-20-44, fax 8 (343) 257-82-63.
E-mail: info@urnivi.ru
Безбородова Наталья Александровна, к. в. н., ст. науч. сотрудник лаборатории микробиологических
и молекулярно-генетических исследований
Bezborodova Natalya A., PhD of Veterinary Science, Senior Researcher of the Laboratory of Microbiological
and Molecular Genetic Studies Кожуховская Вероника Валентиновна, аспирант, лаборант лаборатории микробиологических и молекулярно-генетических исследований
Kozhukhovskaya Veronika V., Post-Graduate Student, Assistant of the Laboratory of Microbiological
and Molecular Genetic Studies
Аннотация. В настоящее время наиболее информативным методом диагностики вирусных и бактериальных инфекций крупного рогатого скота является полимеразная цепная реакция. Данный метод особенно эффективен при выявлении патогенного возбудителя при бессимптомных и субклинических формах течения инфекционного процесса. Целью данной работы стало определение генетических маркеров инфекционных возбудителей в биопробах от крупного рогатого скота с подозрением на ассоциированные инфекционные болезни. Методом ПЦР было исследовано 343 пробы биологического и патологического материала от крупного рогатого скота на инфекционный ринотрахеит (ИРТ), вирусную диарею (ВД), хламидиоз и микоплазмоз.
У обследованных животных установлены моноинфекции вирусной (1,8 %) или бактериальной этиологии (7,6 %). В 1,2 % случаев были выявлены положительные пробы на ИРТ крупного рогатого скота. В 7,6 % случаев была выявлена ДНК бактерий рода микоплазма. В 0,6 % случаев ДНК возбудителя вирусной диареи. Применение ПЦР в комплексной лабораторной диагностике инфекционных болезней способствует адекватной оценке антигенной нагрузки на организм животного, что позволяет применять эффективные схемы лечения с последующей их коррекцией. Выявление больных и инфицированных животных инфекционными агентами при проведении диагностических исследований позволяет своевременно предотвращать распространение болезни.
Summary. Currently, PCR is the most informative method for diagnosis of viral and bacterial cattle infections. This method is particularly effective in identifying the pathogen in asymptomatic and subclinical forms of the course of the infectious process. The aim of this work was to identify genetic markers of infectious agents in cattle biological samples from cattle suspected in associated infectious diseases. 343 samples of biological and pathological material from cattle for infectious rhinotracheitis, viral diarrhea, chlamydia, and mycoplasmosis were investigated by PCR method.
Viral (1,8 %) or bacterial monoinfection (7,6 %) was diagnosed in animals. Positive samples for infectious bovine rhinotracheitis were found in 1,2 %o of cases. Mycoplasma DNA was detected in 7,6 %o of the samples. DNA of viral diarrhea causative agent was found only in 2 samples (0,6 %).
Using PCR promote in process ofproper assessment of antigenic load at the animal body during laboratory diagnosis of infectious allows to apply an effective treatment and to correct the last. Animals infected by viral or bacterial agents can be detected when conducting diagnostic studies, and this allow to prevent disease expansion.
Введение
Болезни крупного рогатого скота, вызываемые бактериями, вирусами и их ассоциациями, являются одной из актуальных проблем в ветеринарии. Возбудители заразных болезней, такие как вирус инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирус диареи крупного рогатого скота (ВД), хламидии, микоплазмы широко распространены на территории Российской Федерации [2, 3, 12]. Клинические формы заболеваний, обусловленные этими возбудителями, варьируют от острых, приводящих к летальному исходу, до субклинических и бессимптомных [3, 6, 10]. Они наносят значительный экономический ущерб животноводческой отрасли сельского хозяйства. Экономические потери складываются из снижения молочной продуктивности, нарушения воспроизводительной функции животных и гибели молодняка [6, 8, 11].
Для успешного перехода к высокопродуктивному и экологически чистому агро-хозяйству необходимо внедрение эффективных программ лечебно-профилактических и оздоровительных мероприятий по защите животных от инфекционных болезней. Диагностика инфекционных болезней крупного рогатого скота является неотъемлемой частью таких комплексных программ.
В настоящее время наиболее информативным методом диагностики вирусных и бактериальных инфекций крупного рогатого скота является молекулярно-биологический метод - полимеразная цепная реакция (ПЦР). Высокая специфичность метода обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов. Метод ПЦР обладает высокой чувствительностью, дающей возможность обнаружить единичные фрагменты бактериальных или вирусных нуклеиновых кислот [1, 3, 5]. Метод ПЦР особенно эффективен при выявлении возбудителей внутриклеточных инфекций, труднокультивируемых, некультивируемых или требующих сложной питательной среды. Применение ПЦР-диагностики также очень
эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью. Кроме того, при болезнях, вызванных вирусно-бактериальными ассоциациями, при бессимптомных и субклинических формах течения инфекционного процесса метод ПЦР является зачастую единственным, позволяющим определить этиологический агент заболевания [1, 10].
Цель работы - определить генетические маркеры инфекционных возбудителей в биопробах от крупного рогатого скота с подозрением на ассоциированные инфекционные болезни.
Материалы и методы
Исследования выполнены в рамках направления 160 Программы ФНИ государственных академий наук на 2013-2020 г.г. по теме «Разработка теоретических основ для создания и внедрения программы мониторинга, диагностики, лечебно-профилактических и оздоровительных мероприятий по защите животных от эпизоотически значимых инфекционных болезней» (№ 0773-2018-0001) в лаборатории микробиологических и молекулярно-генетических исследований ФГБНУ УрФАНИЦ УрО РАН.
Биоматериалы для исследования моле-кулярно-биологическими методами были отобраны у крупного рогатого скота разных физиологических групп из 15-ти сельскохозяйственных организаций, находящихся на территории Уральского региона.
От животных (телят, коров, быков-производителей) с подозрением на заболевания, вызванные ассоциациями вирусных и бактериальных патогенов, отбирали биоматериалы для исследований: соскобы со слизистой оболочки носовой полости, влагалища, цер-викального канала, препуция; пробы спермы, синовиальной жидкости; кусочки плаценты; патологические материалы от абортированных плодов - пробы паренхиматозных органов (печени, селезенки, лимфатических узлов, легких, почек).
Выделение ДНК возбудителя из биологического материала и постановку ПЦР проводили в соответствии с инструкциями производителя по применению тест-систем.
В работе использовали набор реагентов для выделения ДНК «Diatom DNA Prep 200» (компания ООО «ИзоГен», Москва), набор для определения хламидиоза крупного рогатого скота «ПЦР-Хламидия - фактор» (компания ООО «ФакторМед», Москва), набор для определения инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота «Gen Pak DNA PSR Test BHV1» (ООО «ИзоГен», Москва), наборы для определения вируса диареи крупного рогатого скота, микоплазмоза (ООО «Интер-ЛабСервис», Москва). Для проведения амплификации использовали термоциклер Appliede Biosystems 2720 (Сингапур). Исследования проводили в элекрофорезном варианте с применением агарозного геля и мини-камеры Mini-Sub Cell GT (Bio-Rad, США) с визуализацией под ультрафиолетовым излучением в камере CHEMIDOC XRS+ с интерпретацией результатов с помощью гель-документации Gel Doc XR+ (Bio-Rad, США). Исследования в режиме реального времени с применением амплификатора Rotor-Gene 3000 (Corbett Life Science, Австралия).
Методом ПЦР было исследовано 343 пробы биологического и патологического материала от крупного рогатого скота на инфекционный ринотрахеит (Bovine herpes virus, type 1), вирусную диарею (Bovine virus diarrhoea), хламидиоз (Clamydia spp.) и ми-коплазмоз (Mycoplasma spp.).
Результаты и обсуждение
Результаты исследований биопроб от крупного рогатого скота с подозрением на ассоциированные инфекционные болезни методом ПЦР представлены на рисунке 1.
90,60%
□ Mycoplasma sppi ■ ИРТ
□ ВД □ Отрицательные пробы
Рис. 1. Результаты исследований биопроб от крупного рогатого скота с подозрением на ассоциированные инфекционные болезни методом ПЦР (n=343).
В 1,2 % случаев были выявлены положительные пробы на инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота. ДНК вируса ИРТ выделено из соскобов с носовых ходов от телят, из проб плаценты от абортировавших коров и паренхиматозных органов от абортированных плодов. Полученные результаты подтвердили наличие внутриутробной инфекции у обследованных телят и латентной формы заболевания у коров.
В 7,6 % случаев из соскобов носовых ходов от телят, соскобов со слизистой оболочки влагалища и биопроб плаценты от абортировавших коров, из паренхиматозных органов абортированных плодов была выявлена ДНК бактерий рода микоплазмы (Mycoplasma spp.). Как известно, в норме микоплазма обитает на слизистой оболочке респираторных и мочеполовых органов животных в качестве облигатного паразита. Под воздействием негативных факторов внешней среды, снижающих иммунную защиту у сельскохозяйственных животных, количество микробов резко увеличивается, что приводит к развитию инфекционного процесса. У коров в большинстве случаев данный возбудитель вызывает заболевания со стороны органов размножения, которое, в большинстве случаев, протекает либо в субклинической, либо в латентной форме [5, 10, 11]. Проведенные нами диагностические исследования согласуются с результатами, полученными другими авторами.
При исследовании биоматериалов ДНК возбудителя вирусной диареи была выявлена только в 2-х биопробах (сперма от быков-производителей). Известно, что вирус ВД представлен двумя биотопами -нецитопатогенным и цитопатогенным [3]. У взрослых животных клинические проявления заболевания, как правило, отсутствуют, и в большинстве случаев у них диагностируется латентная или пер-систентная формы инфекции. Животные с этими формами являются «скрытыми» вирусоносителями [3, 6]. Выявление вируса ВД в сперме быков-производителей методом ПЦР дает возможность заранее предупредить распространение инфек-
ции среди поголовья крупного рогатого скота.
В исследованном биологическом материале методом ПЦР не удалось обнаружить ДНК Clamydia spp. Повторно проведенные исследования подтвердили отрицательные результаты, что может свидетельствовать об отсутствии данных возбудителей у обследованных животных.
Необходимо отметить, что во всех исследованных образцах был выявлен генетический материал только одного возбудителя инфекционного заболевания. Ассоциаций бактериальных и вирусных патогенов не наблюдалось.
Заключение
Таким образом, проведенными исследованиями не установлена ассоциированная форма инфекционных болезней. У обследованных животных в 9,4 % случаев диагностировались моноинфекции либо вирусной (1,8 %), либо бактериальной (7,6 %) этиологии. В 90,6 % случаев этиологический агент заболевания установлен не был, поскольку в исследованиях применялся узкий спектр диагностических тест-систем для выявления участка ДНК возбудителей болезней крупного рогатого скота.
Высокая чувствительность и специфичность ПЦР-метода позволила выявить ДНК возбудителей при латентных и персистент-ных формах течения болезни, при которых репродукция возбудителя в организме животного минимальна.
Применение ПЦР-метода в комплексной лабораторной диагностике инфекционных болезней способствует адекватной оценке антигенной нагрузки на организм животного, что позволяет применять эффективные лечебные схемы и производить их коррекцию в процессе лечения. Кроме того, выявление животных вирусо- или бактерионосителей позволяет своевременно предупреждать распространение инфекции.
Список литературы
1. Афонюшкин В.Н., Юшков Ю.Г., Городов B.C. Перспективы использования методов генодиагностики в ветеринарной практике // БИО журнал для спе-
циалистов птицеводческих и животноводческих хозяйств. 2003. № 12. С. 31-32.
2. Будулов Н.Р. Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота в Республике Дагестан: особенности распространения, клинические проявления и организация ветеринарно-профилактических мероприятий // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2008. № 3. С. 78-83.
3. Вялых И.В., Порываева А.П., Шилова Е.Н. Мониторинг заболеваемости крупного рогатого скота вирусной диареей в Уральском регионе // Эколого-биологические проблемы использования природных ресурсов в сельском хозяйстве. Матер. Междунар. науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов, 2017. С. 166-169.
4. Донник И.М. Молекулярно-генетические и им-муно-биохимические маркеры оценки здоровья сельскохозяйственных животных // Вестник РАН. 2017. № 4. С. 362-366.
5. Красиков А.П., Алексеева И.Г. Комплексная диагностика инфекционных болезней крупного рогатого скота // Электронный научно-методический журнал Омского ГАУ 2015. № 1. С. 9.
6. Моисеева К.В., Козлова Н.А., Шилова Е.Н. Проявление хламидиоза крупного рогатого скота в Свердловской области // Эколого-биологические проблемы использования природных ресурсов в сельском хозяйстве. 2014. С. 102-105.
7. Мониторинг распространения вирусной диареи крупного рогатого скота в сельскохозяйственных предприятиях Уральского региона. Методические рекомендации / Е.Н. Шилова [и др.]. Екатеринбург: Ира УТК, 2014. 14 с.
8. Плешаков В.И., Лукьянов И.А. Серологический и молекулярно-биологический мониторинг вирусных болезней крупного рогатого скота в хозяйствах Омской области // Ученые записки КГАВМ. 2011. С. 86-88.
9. Порываева А.П. Методы клинико-лабораторной диагностики острых респираторных вирусных инфекции у крупного рогатого скота / А.П. Порываева, Е.В. Печура, И.В. Вялых [и др.] // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. 2017. № 3. С. 55-58.
10. Ряпосова М.В. Сравнительная характеристика клинических проявлений генитальной формы инфекционного ринотрахеита у коров и нетелей в условиях специфической вакцинопрофилактики // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. 2017. № 3. С. 59-62.
11. Смирнова Л.И., Племяшов К.В., Темникова Л.В. Выделение и дифференциация неферментирую-щих урогенитальных микоплазм от крупного рогатого скота // Ветеринария. 2008. № 8. С. 9.
12. Шилова Е.Н., Донник И.М., Ряпосова М.В. Клиническое проявление инфекционного ринотрахе-ита крупного рогатого скота в племенных организациях Уральского региона // Аграрный вестник Урала. 2011. № 6. С. 24-26.
