CC BY
15Ветеринарный врач. 2022. № 6. С. 14 - 19. The Veterinarian. 2022; (6): 14 - 19.
Научная статья
УДК 619:577.21:001.608.1:616-022.14:636.2 DOI: 10.33632/1998-698Х_2022_6_14
Значение ПЦР в выявлении инфекционных агентов у крупного рогатого скота
Наталья Александровна Безбородова, Вероника Валентиновна Кожуховская, Антонина Павловна Порываева, Евгения Николаевна Шилова, Елена Владимировна Печура
Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук, Екатеринбург, Россия
Автор, ответственный за переписку: Безбородова Наталья Александровна, [email protected] Аннотация.
Целью нашей работы являлось выявление методом ПЦР бактериальных и вирусных инфекционных агентов в биологическом материале от коров и телят при разном клиническом проявлении заболеваний. Биологический материал от животных поступали в ПЦР лабораторию из 23 сельскохозяйственных организаций Уральского региона. Всего исследовано 808 проб, из них в 11,9% случаев обнаружены геномы патогенов: ДНК Mycoplasma bovis в 2,4 % проб, РНК Bovine virus diarrhoea в 2,3 % проб, ДНК Mycoplasma spp. и Chlamydia spp. в 2 % проб, единично встречались Mycoplasma bovigenitalium, Bovine herpes virus (type 1), Chlamydophila abortus, Chlamydophila pecorum. Из 80 проб в 36,2% биоматериалов были обнаружены специфические участки ДНК Cl.difficile - 31,2 % проб, Cl.perfringens - 20,0 % проб, Cl.difficile+Cl.perfringens - 25,0 % биопроб. У Cl.difficile были обнаружены токсины: CDT токсин у 41,0 % клостридий, токсин В у 6,0 % патогенов, реже токсин А. Все обнаруженные патогены были представлены в виде моноинфекции и, единично в виде микст-инфекций. С помощью ПЦР удалось обнаружить ДНК и РНК инфекционных агентов при разном клиническом проявлении заболеваний бактериальной и вирусной этиологии в стадах крупного рогатого скота на территории Уральского региона.
Ключевые слова: ДНК, РНК, ПЦР-диагностика, Mycoplasma spp., Chlamydia spp., Bovine herpes virus 1, Bovine virus diarrhoea
The importance of PCR in the detection of infectious agents in cattle
Natalya A. Bezborodova, Veronika V. Kozhukhovskaya, Antonina P. Poryvaeva, Evgenia N. Shilova, Elena V. Pechura
Ural Federal Agrarian Scientific Research Centre, Ural Branch of the Russian Academy of Science, Yekaterinburg, Russia
Corresponding author: Natalya Alexandrovna Bezborodova, [email protected]
Abstract. The aim of our work was to identify bacterial and viral infectious agents in biological material from cows and calves with different clinical manifestations of diseases by PCR. Biological material from animals was supplied to the PCR laboratory from 23 agricultural organizations of the Ural region. A total of 808 samples were examined, of which pathogen genomes were found in 11.9% of cases: Mycoplasma bovis DNA in 2.4% of samples, Bovine virus diarrhoea RNA in 2.3% of samples, Mycoplasma spp. DNA. and Chlamydia spp. in 2% of the samples, Mycoplasma bovigenitalium, Bovine herpes virus (type 1), Chlamydophila abortus, Chlamydophila pecorum were isolated. Of 80 samples, 36.2% of biomaterials contained specific DNA sites Cl.difficile - 31.2% of samples, Cl.perfringens - 20.0% of samples, Cl.difficile+Cl.perfringens - 25.0% of bioassays. Toxins were found in Cl.difficile: CDT toxin in 41.0% of clostridium, toxin B in 6.0% of pathogens, less often toxin A. All detected pathogens were presented in the form of monoinfection and, occasionally, in the form of mixed infections. UsingWith the help of PCR, it was possible to detect DNA and RNA of infectious agents with different clinical manifestations of diseases of bacterial and viral etiology in cattle herds of the Ural region.
Keywords: DNA, RNA, PCR diagnostics, Mycoplasma spp., Chlamydia spp., Bovine herpes virus 1, Bovine virus diarrhea
Введение. Возникновение любого заразного заболевания крупного рогатого скота сопровождается серьезными экономическими убытками. При обнаружении больных особей нужно немедленно проводить диагностические исследования на определение патогенного агента, вызывающего заболевание, и последующие своевременные лечебно-профилактические мероприятия
[7, 10].
Инфекционные болезни вызывают микроорганизмы (вирусы, бактерии), попадающие в организм крупного рогатого скота различными путями. Ряд возбудителей обладает политропизмом и вызывает сходные клинические признаки, что затрудняет диагностику заболевания. Такие заболевания как хламидийная и микоплазменные инфекции, инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота (ИРТ КРС), вирусная диарея крупного рогатого скота (ВД КРС) и клостридиозы протекают с поражением респираторной, репродуктивной, пищеварительной систем, и имеют разные формы течения заболевания от острых до латентных [3, 4]. Молодняк крупного рогатого скота переболевает чаще в острой форме с выраженными клиническими признаками, а у взрослого поголовья клиническая картина имеет стертый характер, заболевания протекают хронически и бессимптомно [1, 5].
Панель диагностических тестов по определению инфекционных заболеваний включает серологические, иммуноферментные, микробиологические, вирусологические и молекулярно-генетические исследования. Все перечисленные методы имеют специфические особенности [6, 10]. Метод ПЦР позволяет выявлять генетический материал не культивируемых патогенных агентов, идентифицировать геномы возбудителя, проводить типизацию и видовую идентификацию вирусных и бактериальных молекул при скрытых формах течения заболеваний [2].
Для сохранения эпизоотического благополучия в стадах крупного рогатого скота необходимо проведение мониторинговых исследований, которые позволяют определить спектр возбудителей, циркулирующих в стадах крупного рогатого скота, и своевременно провести профилактические мероприятий [7, 9]. На этом основаны программы оздоровительных и противоэпизоотических мероприятий для сохранения здоровья сельскохозяйственных животных и получения продукции животноводства [4, 8].
Цель наших исследований - выявление бактериальных и вирусных инфекционных агентов в биологическом материале от коров и телят методом ПЦР.
Материалы и методы. Работа проводилась в рамках Государственного задания Минобрнауки России в ФГБНУ УрФАНИЦ УрО РАН. Биологические пробы от коров и телят были направлены на исследования из 23 сельскохозяйственных предприятий Уральского региона в период с 2017 года по 2021 год. Биологические пробы: молоко, цельная кровь, соскобы из слизистой цервикального канала, с носовой полости, кусочки плаценты, кал; суставная жидкость, смывы с конъюнктивы и слизистой оболочки носовой полости у молодняка; образцы органов и тканей (кусочки гортани, носовой перегородки, легкого, трахеи) от павших телят; внутренние органы от абортированных плодов.
Биоматериал от животных подозрительных на клостридиальную инфекцию поступил в лабораторию в количестве 80 проб, отобранных из 10 ферм за период с 2020 года по 2021 год. Биологический материал: навоз, смывы с раневых поверхностей копытец; внутренние органы от погибших телят (кусочки печени, почек, сердца, легких и селезенки).
В общей сложности было исследовано 808 проб биоматериала.
В ПЦР использовали набор для выделения ДНК «Diatom DNA Prep 200» (Россия), набор для выявления ДНК Mycoplasma spp., Mycoplasma bovis и Mycoplasma bovigenitalium (Россия), ИРТ крупного рогатого скота «Gen Pak DNA PSR Test BHV1» (Россия), ВД крупного рогатого скота (Россия), Chlamydia spp., C. abortus, C. pecorum (Россия), наборы «РеалБест-Вет ДНК Clostridium difficile/Clostridiumperfringens», «РеалБест-Вет ДНК Clostridium difficile tcdA/tcdB/CDT» (Россия).
Амплификацию проводили на Rotor-Gene 3000 (Австралия), QuantStudio 5 (США), SWIFT Maxi PROESCO (США). Электрофорез с применением мини-камер: Mini-Sub Cell GT (США), CHEMIDOC XRS+ (США).
Результаты исследований. Проведенные нами исследования методам ПЦР 808 биоматериалов показали, что ДНК и РНК патогенных возбудителей обнаружена в 96 пробах (12,9%). ДНК Mycoplasma bovis выявлена в 2,4% проб, РНК Bovine virus diarrhoea (BVD) в 2,3% проб, геномы Mycoplasma spp. и Chlamydia spp. в 2 %, генетический материал Mycoplasma bovigenitalium, Bovine herpes virus (type 1) (BHV-1), Chlamydophila abortus, Chlamydophila pecorum выявлен единично (рисунок 1).
Частота встречаемости геномов возбудителей
Отрицательные пробы 87,1%
= Отрицательные пробы <- Mycoplasma spp. ■■ Chlamydia spp. • Mycoplasma bovigenitalium Bovine herpes virus (type 1) s Chlamydophila abortus Chlamydophila pecorum Mycoplasma bovis Bovine virus diarrhoea
2,3%
2%
2%
Положительны е пробы 12,9%
Рисунок 1. Спектр возбудителей, выделенных в образцах биоматериала (n=808)
При анализе выявления возбудителей установлено, что в вагинальных соскобах от коров, в образцах последа и в материалах от абортированных плодов аминокислотные последовательности Bovine herpes virus (type 1) обнаружены в 1% случаев от числа исследованных проб, РНК Bovine virus diarrhoea - в 2,3% случаев.
Единично, в пробах суспензии органов от абортированного плода и в последе от коровы присутствовали аминокислотные последовательности BVD и BHV-1. Что говорит о циркуляции вируса диареи крупного рогатого скота и герпес вируса 1 типа в сельскохозяйственных предприятиях Уральского региона в форме латентных, бессимптомных и хронических заболеваний.
В проведенных нами исследованиях биопроб от коров и телят на наличие ДНК бактерий рода Mycoplasma spp. диагностировали в 2 % случаев, геномы Mycoplasma bovis в 2,4 % случаев и Mycoplasma bovigenitalium в 1,2% случаев. Mycoplasma bovis была выделена из образцов синовиальной жидкости от телят, из смывов с носоглотки телят, вагинальных соскобов у коров и биоматериалов от абортированных плодов. ДНК Mycoplasma bovigenitalium были обнаружены в смывах с носоглотки телят и цервикальных соскобах от коров в 1,2% проб. Одновременное присутствие ДНК Mycoplasma bovis/Mycoplasma bovigenitalium было обнаружено в 3 образцах (смыв с носоглотки теленка, соскоб с влагалища у коровы, суспензия из органов абортированного плода). Данные диагностических исследований говорят о том, что среди молодняка и взрослого поголовья крупного рогатого скота происходит постоянная циркуляция двух видов микоплазм - Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium.
В 2 % проб были выделены геномы Chlamydia spp. из соскобов со слизистых оболочек влагалища от коров, абортировавших на разных сроках беременности. ДНК Chlamydophila abortus встречали единично только из биологических проб от абортировавших коров (соскобы со слизистой оболочки влагалища и пробы плаценты). Chlamydophila pecorum была обнаружена в 1 % проб вагинальных соскобов коров, в смывах с конъюнктивы и носоглотки у телят с признаками кератоконъюнктивита и пневмонии.
Нами выявлены микст-инфекции при разном сочетании патогенов. Так в смывах носоглотки телят присутствовали ДНК Mycoplasma bovigenitalium + Chlamydophila pecorum, Chlamydophila pecorum+ BVD. В суспензии органов от абортированного плода выявлена ассоциация BHV-1 + BVD +Mycoplasma bovigenitalium+Mycoplasma bovis; в суспензиях органов от абортированных плодов Mycoplasma bovigenitalium+ BVD, BHV-1+ BVD. Полученные данные свидетельствует об активной циркуляции возбудителей бактериальных и вирусных инфекций в обследуемых стадах крупного рогатого скота.
В биологических пробах от животных в 36,2% образцах были обнаружены специфические участки ДНК клостридий: Cl.difficile - 31,2 % проб, Cl.perfringens - 20,0 % проб, Cl.difficile+Cl.perfringens - 25,0 % биопроб. Геномы Cl.difficile и Cl.perfringens чаще обнаруживали в биопробах кала - 23,2 %, в образцах молока - 8,0 %, реже в биоматериале от погибших коров и телят -5,0 %. Выявленные Cl.difficile обладали токсигенностью в 48,0 % случаев. Бинарный токсин (CDT) присутствовал у 41,0 % клостридий. Токсинотип В выявлен у 6,0 % анаэробов. Реже встречали токсинотип А, а также сочетание нескольких токсинотипов A/B/CDT в одной пробе в 6,0% случаев, единично Cl.difficile A/B, A/CDT, B/CDT. Остальные Cl.difficille были отнесены к токсин-отрицательным.
В отдельном случае с помощью ПЦР-диагностики в биоматериале от погибших телят были обнаружены основные патогены - Cl.perfringens и Cl.difficile В, что подтвердило диагноз -инфекционная анаэробная энтеротоксемия телят. В биоматериале от павших коров были выявлены бактерии E.coli и Salmonella enterica spp. enterica serogroup C (0:9, 2), а также ДНК Cl.perfringens и Cl.difficile CDT, что подтвердило диагноз - острая кишечная инфекция у погибших животных.
В пробах молока от коров с признаками воспалительного процесса молочной железы были обнаружены геномы Cl. difficille A/B/CDT - 31,2% проб и Cl.perfringens - 12,5% проб, ДНК Staphylococcus spp. в 40,0% проб, E. coli/S.agalactiae в 30,0% проб, ДНК S.aureus в 26,6% проб.
Проведенные нами лабораторные исследования показали высокую выявляемость клостридий в биоматериале. В некоторых образцах была выделена полимикробная инфекция, которая включала аэробные и анаэробные бактерии.
Выводы и предложения. В результате проведенных ПЦР исследований было выявлено, что в поступивших биообразцах присутствовали геномы возбудителей инфекционных заболеваний в 11,9 % случаев.
Наибольшее количество образцов биоматериала при обследовании коров с нарушением воспроизводства содержало геномы Mycoplasma bovis (в 2,4 % случаев) и BVD (в 2,3 % проб). В 2 % проб были выделены геномы Chlamydia spp. (Chlamydophila abortus и Chlamydophila pecorum) и ДНК бактерий рода Mycoplasma spp. (Mycoplasma bovis и Mycoplasma bovigenitalium). ДНК герпес вируса первого типа была выявлена в 1 % проб. Так же в пробах единично выявлено сочетание генетического материала нескольких инфекционных возбудителей: Mycoplasma bovis / Mycoplasma bovigenitalium; Mycoplasma bovigenitalium / Chlamydophila pecorum; BHV-1 / BVD / Mycoplasma bovigenitalium / Mycoplasma bovis; Chlamydophila pecorum / BVD; Mycoplasma bovigenitalium / BVD; BHV-1 / BVD).
Полученные результаты показывают наличие циркуляции данных патогенов в молочных стадах Уральского региона.
При диагностике анаэробных инфекций, в 36,2% образцов от животных были обнаружены специфические участки ДНК Cl.difficile - 31,2 % проб, Cl.perfringens - 20,0 % проб, Cl.difficile+Cl.perfringens - 25,0 % биопроб. Cl.difficile обладали токсигенностью в 48,0 % случаев. CDT токсин присутствовал у 41,0 % клостридий. Токсинотип В выявлен у 6,0 % анаэробов. Единично токсинотип А. Остальные Cl.difficille были отнесены к токсин-отрицательным.
Таким образом, проведенные ПЦР-исследования подтверждают необходимость проведения постоянных мониторинговых исследований у крупного рогатого скота на наличие инфекционных патогеных агентов. ПЦР-метод позволяет своевременно выявлять животных вирусо - и бактерионосителей. Детализация этиологического пейзажа возбудителей инфекционных заболеваний крупного рогатого скота и выявление биологических особенностей инфекционных агентов обеспечат эффективность противоэпизоотических, лечебно-профилактических и оздоровительных мероприятий как в конкретном животноводческом предприятии, так и на территории субъекта в целом [1, 2, 9].
Литература
1. Полимеразная цепная реакция в диагностике латентных, бессимптомных и хронических форм инфекционных заболеваний крупного рогатого скота / Н. А. Безбородова, В. В. Кожуховская, М. В. Петропавловский [и др.] // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. -2019. - № 4. - С. 30-33.
2. Красиков, А. П. Комплексная диагностика инфекционных болезней крупного рогатого скота / А. П. Красиков, И. Г. Алексеева // Электронный научно-методический журнал Омского ГАУ. - 2015. - №1. - С. 9.
3. Красиков, А. П. Понятие паразитоценозов, смешанных и ассоциативных инфекций
животных // А. П. Красиков, Н. В. Рудаков, М. В. Заболотных // Вестник ОмГАУ. - 2016. - № 4 (24). - С.158-165.
4. Нефедченко, А. В. Комплексный подход к определению этиологической структуры респираторных болезней крупного рогатого скота в молочных хозяйствах / А. В. Нефедченко, Т. И. Глотова, А. Г. Глотов // Вестник Краснодарского государственного аграрного университета. -2017. - № 1 (124). - С. 65-71.
5. Патогенность нецитопатогенных изолятов вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек для серонегативных телят / А.Г. Глотов , Т. И. Глотова, Ю. Н. Зайцева [и др.] // Вопросы вирусологии. - 2014. - № 4 (59). - С.46-49.
6. Значение лабораторных исследований в системе эпизоотологической характеристики и оптимизации эпизоотологического надзора за острыми респираторными вирусными инфекциями крупного рогатого скота / Е. В. Печура, О. Г. Петрова, А. П. Порываева, В. В. Кожуховская // Ветеринарный фармакологический вестник. - 2020. - № 4(13). - С. 151-158.
7. Патоморфологические изменения в системе «мать-плацента-плод» у коров при хламидиозе / О. В. Соколова, И. А. Шкуратова, Л. И. Дроздова Л. В. Халтурина // Ветеринария. -2020. - № 12. - С. 9-12.
8. Сравнительная характеристика клинических проявлений генитальной формы инфекционного ринотрахеита у коров и нетелей в условиях специфической вакцинопрофилактики / М. В. Ряпосова, А. П. Порываева, Д. М. Кадочников, У. В. Сивков // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - 2017. - № 3. - С. 59-62.
9. Шкуратова, И. А. Программы контроля инфекционных факторов, влияющих на репродуктивную функцию высокопродуктивных молочных коров / И. А. Шкуратова, Е. Н. Шилова, О. В. Соколова [и др.] // Ветеринария и кормление. - 2020. - № 2. - С. 54-57.
10. Юров, К. П. Контроль и пути оздоровления скота племенных хозяйств и племенных предприятий от инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи / К. П. Юров, М. И. Гулюкин // Российская сельскохозяйственная наука. - 2018. - № 1. - С. 59—63.
References
1. Bezborodova, N.A. Polymerase chain reaction in the diagnosis of latent, asymptomatic and chronic forms of infectious diseases in cattle / N. A. Bezborodova, V. V. Kozhukhovskaya, M. V. Petropavlovsky et al. // Issues of legal regulation in veterinary medicine. - 2019. - No. 4. - S. 30-33.
2. Krasikov A.P., Alekseeva I.G. Complex diagnostics of infectious diseases in cattle // Electronic scientific and methodological journal of the Omsk State Agrarian University. 2015. No. 1. C.9.
3. Krasikov, A.P. The concept of parasitocenoses, mixed and associative infections of animals // Krasikov A.P., Rudakov N.V., Zabolotnykh M.V. // Vestnik OmGAU No. 4 (24). 2016. P.158-165.
4. Nefedchenko A. V. An integrated approach to determining the etiological structure of respiratory diseases in cattle in dairy farms / A. V. Nefedchenko, T. I. Glotova, A. G. Glotov // Bulletin of the Krasnodar State Agrarian University. 2017. No. 1 (124). pp. 65-71.
5. Pathogenicity of non-cytopathogenic virus isolates of viral diarrhea-mucosal disease for seronegative calves / A G. Glotov, T.I. Glotova et al.// Questions of virology. 2014. No. 4 (59). pp.46-49.
6. Pechura, E.V. The value of laboratory research in the system of epizootological characteristics and optimization of epizootological surveillance of acute respiratory viral infections in cattle / E. V. Pechura, O. G. Petrova, A. P. Poryvaeva et al. // Veterinary Pharmacological Bulletin. - 2020. - No. 4(13). - S. 151-158.
7. Sokolova O.V. Pathological changes in the system "mother-placenta-fetus" in cows with chlamydia / O. V. Sokolova, I. A. Shkuratova, L. I. Drozdova et al. // Veterinary. - 2020. - No. 12. - P. 9-12.
8. Comparative characteristics of the clinical manifestations of the genital form of infectious rhinotracheitis in cows and heifers under specific vaccination / M.V. Ryaposova [et al.] // Issues of legal regulation in veterinary medicine. 2017. No. 3. S. 59-62.
9. Shkuratova, I.A. Control programs for infectious factors affecting the reproductive function of highly productive dairy cows / I. A. Shkuratova, E. N. Shilova, O. V. Sokolova et al. // Veterinary and feeding. - 2020. - No. 2. - P. 54-57.
10. Yurov K.P. Control and ways of improving livestock of breeding farms and breeding enterprises from infectious rhinotracheitis and viral diarrhea / K.P. Yurov, M.I. Gulyukin // Russian agricultural science. 2018. No. 1. S. 59-63.
Вклад авторов:
Безбородова Н. А. - научное руководство; концепция исследования; развитие методологии; участие в разработке учебных программ и их реализации; написание исходного текста; итоговые выводы. Кожуховская В. В. - доработка текста, итоговые выводы.
Порываева А.П. - участие в разработке учебных программ и их реализации; доработка текста, итоговые выводы.
Шилова Е.Н. - участие в разработке учебных программ и их реализации; доработка текста, итоговые выводы.
Печура Е.В. - участие в разработке учебных программ и их реализации; доработка текста, итоговые выводы.
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Contribution of the authors:
Bezborodova N.A. - scientific management; research concept; development of methodology; participation in the development of training programs and their implementation; writing the original text; final conclusions. Kozhukhovskaya VV - participation in the development of training programs and their implementation; revision of the text, final conclusions.
Poryvaeva A.P. - participation in the development of training programs and their implementation; revision of the text, final conclusions.
Shilova E.N. - participation in the development of training programs and their implementation; revision of the text, final conclusions.
Pechura E.V. - participation in the development of training programs and their implementation; revision of the text, final conclusions.
Contribution of the authors: the authors contributed equally to this article. The authors declare no conflicts of interests.
© Безбородова Н.А., Кожуховская В.В., Порываева А.П., Шилова Е.Н., Печура Е.В., 2022
