CC BY
9
DOI 10.31718/2077-1096.20.4.115 УДК 57.086.13:602:579.61
Висеканцев 1.П., Петров 1.В., Буряк 1.А., Марценюк В.П.
ЖИТТеЗДАТНКТЬ ТА АДГЕЗ1Я ДО ЕРИТРОЦИТ1В ЛЮДИНИ ПРОБ1ОТИЧНИХ ШТАМ1В М1КРООРГАН1ЗМ1В П1СЛЯ 1ММОБ1Л1ЗАЦ11 В АЛЬГ1НАТНОМУ ГЕЛ1 I ЗБЕР1ГАННЯ ЗА Р1ЗНИХ НИЗЬКИХ ТЕМПЕРАТУР
1нститут проблем крюбюлогм i крюмедицини НАН Украши, XapKiB
Дослiдження присвячене розробц технологш довгострокового збергання iMMo6mi3oeaHux в гелевих носях проботиюв при pi3Hux низьких температурах. Мета досл'дження - вивчити збереженсть та адгезивну активнсть мiкроорганiзмiв-пробiотикiв псля 'шмобШзаци в альгнатному гелi i зберi-гання за рiзниx низьких температур протягом 24 мся^в (термiн спостерiгання). Об'екти i методи досл'дження. Проботичн штами мiкроорганiзмiв Escherihcia coli M-17 (E. coli M-17), Lactobacillus acidophilus 1MB B-2637 (L. acidophilus), Saccharomyces cerevisiae 1MB Y-505 (S. cerevisiae) були /ммо6-л1'зован1' в 1%-му альгнатному гелi без добавок або з додаванням лактози, сахарози, знежиреного молока та захисного сахарозо-молочно-лактозного середовища. Зразки заморожували iз неконтро-льованими швидкостями охолодження в холодильних камерах з температурами -20, -40, -75 °С. П'д час заморожування до -196 °С зразки охолоджували до -40 °С з> швидк/'стю 1 град. /хв, а потiм занурювали у рiдкий азот. Зразки збергали при вказаних температурах протягом 24 мся^в (тер-мн спостерiгання). В процес збергання частину гранул в'д'гр'тали на водянй бан i розчиняли у 4%-му ЕДТА. Життездатнсть мiкроорганiзмiв визначали за здатнстю мкробних клтин утворю-вати колони на агаризованих середовищах. Адгезивну активнсть визначали за здатнстю мкроор-ган'зм'в адгезувати до еритроцит!в людини 0(1) групи, Rh(+). Отриманi результати та обговорен-ня. На етап'1 охолодження до -20, -40, -75, -196 °С та псля наступного збергання при -196 °С iм-мобiлiзованi мiкроорганiзми в усх видах гелю не гинули. При -20, -40, -75 °С в бльшостi зразк'т за-гибель клтин починалася м'ж 1-им та 3-им мсяцями збергання. Через 24 мсяц було встановлено, що найбльш стйкими до збергання за цих температур були бактери L. acidophilus, а найбльш чу-тливими - др'жджi S. cerevisiae. Показники життездатностi усх мiкроорганiзмiв, iммобiлiзованиx у 1%-му гелi без добавок, були мiнiмальними. Додавання до складу альгнатного гелю дисахарид 'т лактози, сахарози, сахарозо-молочно-лактозного середовища середовища та молока пдвищувало кропротективн!' властивостi альгнатного гелю. Найбльш високу життездатнсть iммоблзова-них мiкроорганiзмiв спостергали у гелi з додаванням сахарозо-молочно-лактозного середовища середовища. 3i зниженням температури збергання в'д -20 до -75 °С кльксть життездатних м/кро-бних клiтин в усх зразках гелю пдвищувалася. lммобiлiзацiя в гелевих носях та збергання протягом 24 мся^в не впливали на адгезивн властивостi проботиюв E. coli M-17, L. аcidophilus, S. cerevisiae. Змiни показник'т життездатностi мкробних клтин пов'язанi з вираженстю пошкоджую-чих ф/'зико-х/'м/'чних фактор'т, як супроводжують процеси кристал'зацИ води при температурах -20, -40, -75 °С. Анал'зуеться захисна дя добавок до складу альгнатного гелю. Висновки. П'д час довгострокового збергання за рiзниx низьких температур на життездатнсть iммобiлiзованиx в гелевих гранулах мiкроорганiзмiв впливають видова кр1'орезистентн1'сть мiкроорганiзмiв, темпе-ратурн режими i термiни збергання, склад гелевого нося. Процеси 'шмобШзаци та збергання за низьких температур не змiнювали адгезивну активнсть iммобiлiзованиx мiкроорганiзмiв. Ключовi слова: пробютики, iммобiлiзацiя, альгшатний гель, низькотемпературне збер^ання.
Зв'язок публжаци з плановими науково-дослiдними роботами. Дане дослiдження е частиною 6/6омчоГ (НАН УкраГни) науково-6осл/6ноГ роботи «Вивчення меxанiзмiв ^опои/мвжень мiкроорганiзмiв, iммобiлiзованиx в гелевих ноаях з рiзними фiзико-xiмiчними властивостями, п/6 час низькотемпературного зберiгання та лiофiлiзацii», № державноГреестрацп 0118U001187.
Вступ активы добавки [5]. Серед цих препара^в найбн
.„■,-■ льшого поширення набули пробютики i симбю-
1Мкробюм людини та тварин вiдiграe суттеву паи»Ш| "^ии|итли
. к- тики, до складу яких входять живi пробютичш
роль у пщтриманш або вщновленш iмунних, бю- . 3 . . ^
■ ' г, штами мiкроорганiзмiв.
хiмiчних i метаболiчних ланцюпв гомеостазу [1, ки^^'опютт.
2 3] За сучасними вимогами до пробютичних пре-
, В останн десятил^тя серед населення рзних фара™ ^Ф^^™^^™ пдеихж бути
. . 0 ^ ^ фено- i генотипово класиф^ованими, апатоген-
регюшв Землi та стьськогосподарських тварин ^ ^ ' ...
^ ■ ними, життездатними, здатними до адгезп до
значно поширилися дисбютичш стани шлунково- ' г . . ' H "... H H
^ /nm-TN , ■ кишкового ештелш i до колоызаци кишечнику,
кишкового тракту (ШКТ), що повязано iЗ неконт- к к к ^ "
■ бути абсолютно безпечними для оргашзму лю-
рольованим зростанням ктькосп пошкоджуючих "ини або тварин [6 7' 81 к '
екзогенних i ендогенних факторiв [2, 4]. дини тв рин [ , ,
Для лiкууваH^^я i профiл£3гтPики[ ди^ичних E0lдпоE3,дПP, б^^TOpцiйHi (фармаколоГiчнi та е^
. . . ^ ^ ... . теринарш пробiотичнi препарати, лiкувально-
станiв, вщновлення i регуляцi' мiкробiому засто- ■ ■
совуют ь Дробiотичн i р|эепар1а"ги, яPкi на сьогодш ба0фOiЛаKTИlHHi пр)од^кти ><арч.узванпя' бормоы до. ^ ^ кк. бавки, якi мiстять мiкр00рганiзми-пр0бi0тики, по-подiляють на пять груп: пробютики, пребютики, .' к кк м ^
к- к- к- ■ виннi забезпечувати збереженiсть життездатно-
симбi0тики, метабi0тики, пробi0тичнi бi0логiчно j v
CTi i бюлопчних властивостей пробютиш пщ час зберiгання до реалiзацiТ та захищати MiKpo6Hi клiтини вiд пошкоджуючоТ дп фiзико-хiмiчних фа-кторiв захисних бар'eрiв ШКТ. Все бiльше уваги дослщники i бiотехнологи придiляють розробц препаратiв пробiотикiв, iммобiлiзованих в ноаях i3 полiсахаридних гелiв [9, 10]. Таю препарати мають низку переваг над класичними формами (саше, капсули, шгулки, люф^зована маса та iH.) [2, 11, 12].
Збер^ають пробiотичнi препарати, продукти i добавки в умовах ппотермп, за рiзних низьких температур та в люф^зованому стан [13, 14]. Тех-нологiТ збер^ання пробiотикiв, iммобiлiзованих в гелевих ноаях, знаходяться в станi розробки.
Мета дослщження
вивчити збереженiсть та адгезивну активнють мiкроорганiзмiв-пробiотикiв пiсля iммобiлiзацiТ в альпнатному гелi i зберiгання за рiзних низьких температур протягом 24 мюя^в (термiн спосте-рiгання).
Об'екти i методи дослiдження
Об'ектами дослiдження були пробiотичнi штами мiкроорганiзмiв Escherichia coli M-17 (да-лi E. coli M-17), Lactobacillus acidophilus 1MB B-2637 (далi L. acidophilus), Saccharomyces cerevisiae 1MB Y-5051 (далi S. cerevisiae). Штам E. coli M-17 був отриманий iз ВсеросшськоТ ко-лекцiТ промислових мiкроорганiзмiв НДЦ «Курчатовский институт» - «ГосНИИгенетика» (Москва, РФ), L. acidophilus та S. cerevisiae - iз Депозита-рш мiкроорганiзмiв 1нституту мiкробiологiТ i вiру-сологп iм. Д.К. Заболотного НАН УкраТни (КиТв, УкраТна).
E. coli M-17 вирощували на скошеному ага-ризованому середовищi "Nutrient Agar" ("Biolife", lталiя) протягом 24 год. при 37 °С, L. acidophilus - на середовищi MRS ("HiMedia", 1цфя) протягом 48 год. при 37 °С, S. cerevisiae - на сусло-агарi iз вмiстом цукру за Балшгом 8 ° [15] протягом 48 год. при 30 °С.
Для основи гелевих гранул використовували альпнат натрш "Alginic acid sodium salt" ("Sigma-Aldrich", Нiмеччина). Модифкацш складу альп-натного гелю проводили додаванням до його складу лактози («Альпавю», Нмеччина), сахаро-зи ("Sudzuker", Нiмеччина), середовища СМЛ [16], молока (молоко 1,5% ультрапастеризоване «Селянське», ДСТУ 2661:2010, ТОВ «Люст-дорф», УкраТна).
Bихiднi розчини 2%-го альпнату натрiю з додаванням вказаних компонент стерилiзували методом тiндалiзацiТ [17]. Перед iммобiлiзацieю мiкробнi клiтини змивали з поверхнi скошених агаризованих середовищ, вiдмивали вiд залиш-кiв середовищ i суспендували у дистильованш водi. Miкробнi суспензiТ змшували у сшввщно-шеннi 1:1 з 2%-ним розчином альгiнату натрiю зi вказаними вище добавками або без них. Гелевi гранули з iммобiлiзованими клiтинами формува-
ли методом юнотропного гелеутворення [18]. Стабiлiзували гранули у 0,2М розчинi CaCl2 протягом 20 хвилин при 37 °С. По™ гранули про-мивали дистильованою водою, пiдсушували i вносили по 100 гранул в крiопробiрки об'емом 5,0 мл ("Nunc", США).
В дослщженш були використанi наступнi 5 ви^в альгiнатного гелю:
№1: 1% альпнатний гель без добавок;
№2: 1% альпнатний гель + 10% лактози;
№3: 1% альпнатний гель + 10% сахарози;
№4: 1% альпнатний гель + середовище СМЛ (кшцева концентра^я лактози - 1%, сахарози -5%, молока - 5% (v/v));
№5: 1% альпнатний гель + 5% молока (v/v).
Юнцева концентра^я мiкробних штин в гелях становила 109 кл / мл.
До температур -20, -40, -75 °С зразки замо-рожували з неконтрольованими швидкостями охолодження на полицях морозильних камер. Пщ час заморожування до -196 °С зразки охо-лоджували до -40 °С у програмному заморожу-ван бiооб'eктiв "Cryoson" (Нiмеччина) зi швидкю-тю 1 град. / хв., а потiм занурювали у рщкий азот. Зразки зберiгали за вказаних температур протягом 24 мюя^в. Для збер^ання зразкiв використовували побутовi холодильнi камери "Nord" (Украша) (-20±3,0 °С), "UGUR" (Туреччи-на) (-40±2,0 °С), "JOUAN" (Францiя) (-75±1,5 °С). Для зберiгання зразкiв у рщкому азотi використовували низькотемпературне сховище бю-об'eктiв ХБ-0,5 (РФ). Через 24 год. та 1, 3, 6, 12, 24 мюя^в вщбирали частину зразш i вiдiгрiвали Тх на водянiй банi при 30 °С. Гелевi гранули роз-чиняли у 4%-му ЕДТА ("BASF", Нмеччина), мк-робнi клiтини тричi вiдмивали фiзiологiчним розчином. Пюля вiдмивання визначали життездат-нiсть i адгезивну активнють кл^ин до еритроци-тiв людини. За контролi були показники житте-здатностi i адгезивно!' активност мiкроорганiзмiв до та пюля зберкання за низьких температур протягом 24 год.
Життездатнють мiкробних кл^ин визначали «чашковим методом» Коха за здатнютю клiтин до колонiеутворення на агаризованих середо-вищах [19].
Збереженють поверхневих адгезивних структур пробютиш вивчали фотометричним методом визначення бактерюфксуючо'Г здатностi еритроцитiв [20]. Пюля розчинення гелевих гранул i процедури вщмивання готували суспензп кл^ин пробiотикiв у фiзiологiчному розчинi iз концентрацiею 109 кл / мл. В експериментах використовували суспензп вщмитих формал^зо-ваних еритроцитiв людини 0 (I) групи Rh (+) [21]. Концентра^я еритроци^в складала 108 кл / мл. В силкошзоваш пробiрки вносили по 2,5 мл мк-робних суспензiй та 1,0 мл суспензп еритроци-тiв. За контроль були пробiрки з мiкробними су-спензiями, в якi замють еритроцитiв вносили фн зiологiчний розчин. Пробiрки струшували протягом 30 хв. за температури 37 °С та 50 обер^в
платформи за хвилину в термостатованш установи для вирощування мiкроорганiзмiв «УВМТ -12 - 250» (НПО «Типко - Элион», РФ). Потiм npo6ip^ центрифугували при 1000 об. / хв. про-тягом 2 хв. для осадження еритроци^в, вщбира-ли надосад i визначали його оптичну щтьнють з використанням 96-лункового планшету "TPP" (Швейцарiя) та мiкропланшетного аналiзатора "Lisa Scan EM" ("Erba Lachema s.r.o.", Чехiя). Mi-кробофiксуючу активнють еритроцитiв (МФАЕ), тобто характеристику фксацп мiкроорганiзмiв на еритроцитах, оцiнювали за формулою та шкалою, також запропонованими в робот [20].
Пщ час статистично''' обробки експеримента-льних даних обчислювали 'х середне арифме-тичне (m) i стандартне вщхилення M. Результа-ти подавали у виглядi m+M [22]. Для визначення статистично''' достовiрностi вiдсутностi або наяв-ностi вiдмiнностей у двох рiзних наборах отри-маних числових характеристик використовували t-критерш Ст'юдента: якщо обчислене значення критерш перевищувало критичне (табличне) значення на рiвнi значущостi р<0,05, то вщмш-ностi, що спостеркалися, вважали статистично достовiрними на вщповщному рiвнi (р<0,05). Статистичну обробку отриманих даних проводили за допомогою пакету програм MS Excel, а також програми «Statistica 6.0».
Результати дослщження та ix обговорення
Було встановлено, що вс iммобiлiзованi клн тини пiсля охолодження за вказаними умовами до температур -20, -40, -75, -196 °С не гинули. Пюля наступного зберкання протягом 24 мю при температурi -196 °С життездатнiсть клiтин у вах
зразках також достовiрно не змшювалася.
Бактерп L. acidophilus, iммобiлiзованi в гелi №1, починали гинути при температурах -20, -40 °С з першого мiсяця зберiгання. Ктькють житте-здатних клiтин в цих зразках через 1 мюяць ста-новила 68,2 та 71,5 %, вiдповiдно. Достовiрне зниження показникiв життездатност у всiх iнших зразках починало вщбуватися мiж третiм та шо-стим мiсяцями зберiгання. Через 24 мюяц зберн гання при температурах -20, -40, -75 °С показ-ники життездатностi бактерiй L. acidophilus, iм-мобiлiзованих в гелi №1, складали 17,4; 29,3; 63,3%, вщповщно (рис. 1). Показники в гелi №2 -38,0; 39,8; 73,1%, вщповщно. Показники в гелi №3 - 32,0; 44,3; 72,0%, вщповщно. Показники в гелi №4 - 49,6; 52,2; 79,0%, вщповщно, а в гелi №5 - 41,5; 41,5; 68,2%, вщповщно.
Бактерп E. coli M-17, iммобiлiзованi в гелi №1, починали гинути при -20 °С на першому мн сяц зберiгання, при -40 °С - мiж першим та тре-тiм мiсяцями. Кiлькiсть життездатних кл^ин в цих зразках знизилася до 63,9 та 69,1 %, вщповщно. У вах шших зразках при температурах -20, -40, -75 °С показники життездатност почали знижуватися мiж третiм та шостим мiсяцями зберiгання. Через 24 мюяц зберiгання при температурах -20, -40, -75 °С показники життезда-тностi бактерiй E. coli M-17, iммобiлiзованих в гелi №1, складали 11,2; 28,6; 60,2%, вщповщно (рис. 2). Показники в гелi №2 - 26,7; 35,4; 66,1% i в гелi №3 - 28,9; 38,6; 64,8%. Показники в гелi №4 - 36,9; 45,2; 80,5%, а в ^i №5 - 29,5; 37,1; 70,1%.
Рис. 1. Життездатнсть бактерй E. coli M-17, 'шмоб'л'зованих в ностх з альгНатного гелю, псля зберiгання протягом 24 мюяц/в за температур -20, -40, -75 i -196 °С. yci eid MiHHoemi docmoeipHi (p<0,05), OKpiM eiöMiHHoemeu мiж пока-зниками жиmmeздаmнocmi клimuH, що збе^галися при-196 °С протягом 12 i 24 мюяц/в.
Рис. 2. Життездатнють бактер1й L. acidophilus, iMMo6mi3oeaHux в ноаях з альгiнатного гелю, пюля зберiгання протягом 24 мюяц/в за температур -20, -40, -75 i -196 °С. Ую eidMiHHO^i do^oeipHi (p<0,05), oKpiM вiдмiннoстей мiж показниками життездатнoстi клiтин, що збеpiгалися при-196 °С протягом 12 i 24 мюяц^в.
Дрiжджi S. cerevisiae, iMM06mi30BaHi в гелях №№1-3, починали гинути при температурах -20, -40, -75 °С на першому мюяц зберкання, iMM06rni30Barn в гелях №№4-5 - мiж тре™ та шостим мюяцями. Через 24 мюяц зберкання при температурах -20, -40, -75 °С показники життездатност дрiжцжiв S. cerevisiae, iммобiлi-зованих в гелi №1, складали 6,0; 14,0; 34,7%, вiдповiдно (рис. 3). Показники життездатност в гелi №2 - 18,9; 21,9; 52,5% i в гелi №3 - 19,5; 32,1; 54,8%. Показники в гелi №4 - 36,1; 50,3; 62,3 % i в гелi №5 - 25,3; 41,3; 58,3%.
В експериментах з вивчення адгезивно! активное^ пробютиш по вщношенню до еритроцитiв було встановлено видовi вiдмiнностi адгезивного потен^алу штамiв мiкроорганiзмiв, якi були об'ектами дослщження. Згiдно шкали оцiнки [20], МФАЕ для цих мiкроорганiзмiв була високою (E. coli M-17) (рис. 4) та середньою (L. acidophilus, S. cerevisiae) (рис. 5, 6). До iммобiлiзацil та до зберкання за низьких температур МФАЕ для E. coli M-17 становила 40,0±3.
Процеси iммобiлiзацil в рiзних варiантах аль-гiнатного гелю (1%-ний гель альпнату без добавок та з додаванням до його складу лактози, са-харози, середовища СМЛ та молока), охоло-дження до температур -20, -40, -75, -196 °С та зберкання за цих температур протягом 24 мюя-^в не впливали на здатнють та вираженють адгезивно! активностi E. coli M-17, L. acidophilus, S. cerevisiae (рис. 4-6).
Отриман результати свщчать про те, що в процеа довгострокового зберкання за рiзних ни-
зьких температур на життездатнють iммобiлiзо-ваних в гелевих гранулах пробютиш впливають видова крiорезистентнiсть мiкроорганiзмiв, тем-пературнi режими i термши зберiгання, склад ге-левого ноая. G ще один фактор, який в бтьшос-тi дослiджень в галузi крюбюлоги впливае на збереженють бiологiчних об'ектiв пiд час замо-рожування - швидкiсть охолодження [23, 24]. В представленому дослщжены ми використовува-ли неконтрольованi режими повтьного охолодження в холодильних камерах до -20, -40, -75 °С та заморожування до -196 °С зi швидкiстю 1 град. / хв. на першому еташ. Ц режими охолодження забезпечили вихщну життездатнiсть iм-мобiлiзованих мiкроорганiзмiв пюля процесу заморожування до вказаних температур. Найбтьш чутливими до наступного зберкання при -20, -40, -75 °С були iммобiлiзованi дрiжцжi S. cerevisiae. Показники життездатностi бактерш E. coli M-17 та L. acidophilus були вищими. Це пов'язано iз видовими вщмшностями в будовi клiтин та 'х функцiональними особливостями.
На вах термiнах зберiгання, починаючи з першого мiсяця, у вах зразках гелю життездат-нiсть мiкробних клiтин була тим вищою, чим ни-жче температура зберiгання. Це повнютю вщпо-вiдае загальноприйнятим положенням про ме-ханiзми крiопошкоджень i крiозахисту бiологiчних об'ектiв [23, 25, 26]. Температура зберкання -20 °С вiдноситься до мiнiмально низьких температур (-11 + -20 °С), якi для бiльшостi розчинiв електролтв е евтектичними [23, 25, 27].
Рис. 3. Життездатнсть дрiжджiв S. cerevisiae, 'шмоб'л'зованих в носях з альгНатного гелю,
псля збергання протягом 24 мюяц/в за температур -20, -40, -75 i -196 °С. yci eidMiHHOcmi docmoeipHi (p<0,05), OKpiM eidMiHHoemeü мiж показниками життездатноcmi клтин, що збеpiгалиcя при-196 °С протягом 12 i 24 мюяц^в.
Рис. 4. Адгезивна акmивнicmь бакmеpiй E. coli M-17 до еpиmpoциmiв.
Рис. 5. Адгезивна активнiсть бактерй L. acidophilus до еритроцитiв.
Рис. 6. Адгезивна активнiсть дрiжджiв S. се^Шае до еритроцитiв.
Протягом усього термшу збер^ання за ^еТ температури на кл^ини дiе як холодовий фактор, так i низка пошкоджуючих фiзико-хiмiчних факторiв, поява яких пов'язана iз процесами по-заклiтинноТ та внутршньокттинноТ кристалiзацiТ води [23, 26]. В той же час на фон зупинки ме-таболiчних реакцш в клiтинах вiдбуваються ка-таболiчнi процеси [25, 27]. Вiдповiдно, у вах зра-зках гелю за температури -20 °С спостерiгали максимальну загибель iммобiлiзованих клiтин. Температура збер^ання -40 °С вiдноситься до
помiрно низьких температур (вiд -21 °С до -60 °С). При цих температурах основна маса поза-кттинноТ та внутрiшньоклiтинноТ води замерзае [24, 25]. В закристалiзованiй льодовiй матриц зберiгаються мiкрофази iз концентрованими розчинами солей. Метаболiчнi процеси в кланах вiдсутнi, але частина кттин пошкоджуеться пiд дiею рiдких мiкрофаз та холодового фактору. Показники життездатност у всiх зразках в про-цесi зберiгання були бiльш високими при -40 °С у порiвняннi з температурою -20 °С. Температу-
ра зберкання -75 °С вiдноситься до зони низьких температур (вщ -61 до -195 °С). Пiд час зберкання за температури -75 °С метаболiчнi та катаболiчнi процеси в штинах вiдсутнi. Позаклн тинна вода, втьна та бiльша частина зв'язано! внутршньокттинно! води знаходяться в замо-роженому станi зi стiйкою кристалiзацieю. Вщпо-вiдно, у зразках, як зберiгалися при цiй температура були найбiльш високi показники житте-здатностi клiтин. Але в процеа зберкання час-тина клiтин загинула. Найбтьш iмовiрно, це пов'язано з наступними чинниками. 1снуе декть-ка фракцш води, зв'язаних iз бiополiмерами. Фракци води, якi знаходяться на поверхн або в замкнутих порожнинах бiополiмерiв, пiд час за-морожування мають розмиту зону кристалiзацiï впритул до -70, -80 °С [27]. Також показано, що на вщмшу вщ простих сольових розчинiв в uni-тинних суспензiях, якi мютять високомолекулярнi розчиненi речовини, залишкова високонцентро-вана сумiш розчинених речовин, витюнених кри-сталами льоду в малi об'еми рщко1 фази, переходить у скловидну матрицю в дiапазонi температур вiд -100 до -120 °С [28, 29, 30]. Завдяки збереженню вказаних кристалiзацiйних процеав пiд час перебування зразкiв при -75 °С у части-ни кл^ин виникли летальнi пошкодження.
При температурах -20, -40, -75 °С кл^ини знаходилися весь термiн зберкання пiд дiею вказаних вище пошкоджуючих факторiв, кть-кiсть та вираженють яких залежала вщ температури зберкання. Внаслiдок цього частина кл^ин в процесi зберiгання гинула. Осктьки хiмiчнi та бiохiмiчнi реакци в кл^инах та фiзико-хiмiчнi змн ни в заморожених зразках вщбуваються повть-но, то кiлькiсть нелетальних пошкоджень клiтин накопичуеться зi збiльшенням термов зберкан-ня до критичних значень i переходить в летальн пошкодження. Це явище демонструе динамка змш показниш життездатностi клiтин: 100%-а збереженють кл^ин пiсля охолодження та зберн гання протягом перших 1-3 мюя^в i поступове збiльшення кiлькостi загиблих кл^ин протягом наступних термiнiв.
Температуру зберкання -196 °С (крюконсер-вування) вщносять до ультранизьких. При цш температурi уся внутрiшньоклiтинна i позаклн тинна вода замерзае. Призупиненi уа хiмiчнi i фiзичнi процеси, за виключенням переходiв еле-ктронiв в атомах молекул мiж орбiталями. Кл^и-ни знаходяться в станi холодового анабюзу [23, 25, 26]. Пщ час крiоконсервування нелетальнi та летальн пошкодження клiтин вiдбуваються лише на етапах заморожування та вiдiгрiву. В на-шому дослiдженнi використан режими охоло-дження-вiдiгрiву у поеднанн з крiозахисними властивостями гелевих носив забезпечили 100%-у збереженють життездатност iммобiлiзо-ваних мiкробних клiтин протягом усього термшу спостереження.
Додавання до складу альпнатного гелю ди-сахаридiв лактози i сахарози, середовища СМЛ
та молока пщвищувало крюзахисы властивостi гелевих носив. Враховуючи механiзми крюзахи-сно'Г ди дисахаридiв як позаклiтинних крюпротек-торiв [25, 26], можна вважати, що лактоза i сахароза, внесет до складу гелю, за рахунок гщра-таци зменшують ктькють вiльноï поза^тинно! води, а за рахунок осмотично'Г дiï - вмют внутрн шньоклiтинноï води. В результат зменшуються крiопошкодження клiтин пiд час кристалiзацiйних процесiв. Механiзми крiозахисноï ди молока в складi гелю потребують окремого дослiдження. Найбiльш iмовiрно, молоко стаб^зуе клiтиннi стiнки. Пiд час використання середовища СМЛ спостеркали сумюну захисну дiю молока, саха-рози i лактози.
Результати дослщження адгезивно1 активно-стi мiкроорганiзмiв свiдчать, що iммобiлiзацiя клiтин в альпнатному гелi без добавок та в гелi з додаванням до його складу лактози, сахарози i молока, охолодження iммобiлiзованих мiкроор-ганiзмiв до -20, -40, -75 °С i зберiгання за цих температур протягом 24 мюя^в не впливають на поверхневi структури, якi забезпечують здат-нiсть мiкробних клiтин до адгези до еритроцитiв людини. Слщ очiкувати, що структури, якi забезпечують адгезш пробiотичних штамiв мiкроорга-нiзмiв до поверхневих структур слизовоГ оболон-ки кишечнику, також зберкаються в умовах кон-сервування, використаних у дослщженнк
Окремо слiд розглянути значення отриманих результатв для розробки технологш довгостро-кового зберiгання комерцшних пробiотичних препаратiв, продуктiв лкувально-
профтактичного харчування i кормових добавок на основi iммобiлiзованих мiкроорганiзмiв-пробiотикiв. Найбтьш ефективним виявилося зберiгання при -196 °С. Але цей метод консер-вування потребуе спецiального крiогенного об-ладнання, гарантованого постачання рiдкого азоту, техычного персоналу зi спецiальною освн тою, низки заходiв iз безпеки експлуатаци крю-генного обладнання. Пщ час зберiгання при -20 °С вiдбуваються значнi втрати життездатних клн тин. Найбiльш перспективними для використання в медицину ветеринарiï, торпвельних мережах i в стьському господарствi е режими зберн гання при -40 та -75 °С. Для цього потрiбно ви-готовляти iммобiлiзованi препарати та харчовi продукти з високою вихщною кiлькiстю життездатних кл^ин i використовувати в якост носiïв гелi, модифiкованi додаванням до 1х складу крiопротективних речовин.
Висновки
Пiд час довгострокового зберкання за низьких температур на життездатнють iммобiлiзова-них в гелевих гранулах мiкроорганiзмiв впливають 1х видова крiорезистентнiсть, температурнi режими i термш зберiгання, склад гелевого ноая. В порiвняннi iз пробютичними штамами E. coli та L. acidophilus дрiжцжi S. cerevisiae бтьш чутливi до дiï пошкоджуючих чинниш, якi супро-
воджують процес збер^ання за температур -20, -40, -75 °С. Пщ час повтьного заморожування до температур -20, -40, -75, -196 °С iммобiлi-зованi в альгiнатному гелi з добавками та без них кл^ини E. coli, L. acidophilus та S. cerevisiae не гинуть. Починаючи з 1-3-го мюя^в збер^ання при -20, -40, -75 °С частина кл^ин гине, найбн льше - при -20 °С, найменше - при -75 °С. Пiд час збер^ання при -196 °С iммобiлiзованi мiкро-бнi клiтини не гинуть.
Додавання до складу 1%-го альпнатного гелю дисахарифв, знежиреного молока, середовища СМЛ (лактози 1%, сахарози 2%, молока 5%) пщвищуе його крюпротективш властивостк
lммобiлiзацiя в альпнатному гелi та збер^ан-ня протягом 24 мюя^в (термiн спостер^ання) не впливають на адгезивнi властивост пробютич-них штамiв E. coli, L. acidophilus, S. cerevisiae по вщношенню до еритроципв людини.
Перспективи подальших дослiджень
Отриманi результати можуть бути основою подальших дослiджень по обфунтуванню пара-метрiв технологiчних процеав довгострокового зберiгання пробiотичних штамiв мiкроорганiзмiв, iммобiлiзованих в гелевих носiях.
Лтература
1. Drannik GN, Kurchenko AI, Drannik AG. Immunnaya sistema slizistyih, fiziologicheskaya mikroflora i probiotiki [Mucosal immune system, physiological microflora and probiotics]. K: Poligraf plyus; 2009. 143 s. (Russian)
2. Edeas M, Konturek PC, editors. Towards Clinical Evolution. Abstract book of the 7th World Congress on Targeting Microbiota 2019; 2019 Oct 10-11; Krakov, Poland: International Society of Microbiota, 2019.
3. Kolesnikova OV. Kyshkova mikrobiota i metabolichnyi syndrom: shcho yikh obiednuie? [The intestinal microbiota and metabolic syndrome: the unifying factors]. Suchasna hastroenterolohiia. 2016; 2: 61-70. (Ukrainian). Available from: http://nbuv.gov.ua/UJRN/SGastro_2016_2_9.
4. Tkachenko EI. Disbioz kishechnika: rukovodstvo po diagnostike i lecheniju [Intestinal dysbiosis: a guide for diagnosis and treatment]. SPb: InformMed; 2009. 276 s. (Russian)
5. Bondarenko AV. Korektsiia dysbiotychnykh staniv i stabilizatsiia mikrobioty [Correction of dysbiotic states and microbiota stabilization]. Problemy bezperervnoi medychnoi osvity ta nauky. 2014; 2: 77-80. (Ukrainian)
6. Floch MH. Recommendations for Probiotic Use in Humans - 2014 Update. Pharmaceuticals (Basel). 2014 Oct 10; 7(10): 999-1007. doi: 10.3390/ph7100999
7. Guarner F, Khan AG, Garisch J, Eliakim R, Gangl A, Thomson A, et al. World Gastroenterology Organisation Global Guidelines: probiotics and prebiotics. J Clin Gastroenterol. 2012 Jul; 46(6): 468-81. doi: 10.1097/MCG.0b013e3182549092
8. Singh VP, Sharma J, Babu S, Rizwanulla, Singla A. Role of probiotics in health and disease: a review. J Pak Med Assoc. 2013 Feb; 63(2): 253-7.
9. Gbassi GK, Vandamme T. Probiotic Encapsulation Technology: From Microencapsulation to Release into the Gut. Pharmaceutics. 2012 Feb 6; 4(1): 149-163. doi: 10.3390/pharmaceutics4010149
10. Mitropoulou G, Nedovic V, Goyal A, Kourkoutas Y. Immobilization Technologies in Probiotic Food Production. Int J Nutr Metab. 2013 Oct 28; 2013: 716861. https://doi.org/10.1155/2013/716861
11. Yeung TW, Ugok EF, Tiani KA, McClements DJ, Sela DA. Microencapsulation in Alginate and Chitosan Microgels to Enhance Viability of Bifidobacterium longum for Oral Delivery. Front Microbiol. 2016 Apr 19; 7: 94. doi: 10.3389/fmicb.2016.00494
12. Terpou A, Papadaki A, Lappa IK, Kachrimanidou V, Bosnea LA, Kopsahelis N. Probiotics in Food Systems: Significance and Emerging Strategies Towards Improved Viability and Delivery of Enhanced Beneficial Value. Nutrients. 2019 Jul 13; 1(7): 591. doi: 10.3390/nu11071591
13. Kalinichenko SV, Babych YeM, Ryzhkova TA, Maslii IH, Korotkykh OO, Danilina SS, ta in. Suchasnyi stan rozrobky ta zastosuvannia probiotychnykh, prebiotychnykh ta synbiotychnykh preparativ [State of the art in development and use of probiotic, prebiotic and synbiotic drugs]. Annaly Mechnykovskoho instytutu. 2013; 3: 5-12. (Ukrainian). Available from: http://nbuv.gov.ua/UJRN/ami_2013_3_3
14. Tanimomo J, Delcenserie V, Taminiau B, Daube G, Saint-Hubert C, Durieux A. Growth and Freeze-Drying Optimization of Bifidobacterium crudilactis. Food Nutr Sci. 2016 Jun 29; 7(7): 61626. http://dx.doi.org/10.4236/fns.2016.77063
15. Afanas'eva OV. Mikrobiologicheskiy kontrol hlebopekarnogo proizvodstva [Microbiological control of bakery production]. M: Pischevaya promyishlennost; 1976. 144 s. (Russian)
16. Patent Ukrainy № 56674. Sposib konservuvannia kultury Bifidobacterium bifidum LVA-3 [Method for preservation of Bifidobacterium bifidum LVA-3 culture]. / Pavlenko NV, Holtsev AM, Vysekantsev IP, Shchehlov AV, Ananina HIe, Hrysha IH, vynakhidnyky. Instytut problem kriobiolohii i kriomedytsyny NAN Ukrainy, patentovlasnyk. 2011 Ver 25. (Ukrainian)
17. Labinskaja AC. Mikrobiologija s tehnikoj mikrobiologicheskih issledovanij [Microbiology with microbiological research technique]. 4th ed. M: Medicina; 1978; 23 s. (Russian)
18. Tsen JH, Huang HY, Lin YP, King AE. Freezing resistance improvement of Lactobacillus reuteri by using cell immobilization. J Microbiol Methods. 2007 Sep; 70(3): 561-4. doi: 10.1016/j.mimet.2007.06.004
19. Lusta KA, Fihte BA. Metody opredelenija zhiznesposobnosti mikroorganizmov [Methods for determining the viability of microorganisms]. Pushhino: ONTI NCBI AN SSSR; 1990. 186 s. (Russian)
20. Ivonin AG, Oborin VA. Razrabotka i perspektivyi primeneniya fotometricheskogo metoda opredeleniya bakteriofiksiruyuschey aktivnosti eritrotsitov v veterinarii [Development and prospects of application of photometric method for determining the bacteriofixing activity of erythrocytes in veterinary medicine]. Izvestiya Orenburgskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. 2008; 3(19): 80-2. (Russian)
21. Brilis VI, Brilen TA, Lentsner HP. Metodika izucheniya adgezivnogo protsessa mikroorganizmov [Methodology for studying the adhesive process of microorganisms]. Laboratornoe delo. 1986; (4): 210-212. (Russian)
22. Mironov AN, redaktor. Rukovodstvo po provedeniju doklinicheskih issledovanij lekarstvennyh sredstv [Guidelines for conducting preclinical trials of drugs]. M: Grif i K; 2012. Part I; 944 s. (Russian)
23. Gordienko EA, Pushkar NS. Fizicheskie osnovyi nizkotemperaturnogo konservirovaniya kletochnyih suspenziy [Physical basis of low-temperature preservation of cell suspensions]. K: Nauk. dumka; 1994. 143 s. (Russian)
24. Goltsev AN, redaktor. Aktualnyie problemyi kriobiologii i kriomeditsiny [Actual problems of cryobiology and cryomedicine]. Kharkov; 2012. s. 9-44. (Russian)
25. Belous AM, Grischenko VI. Kriobiologiya [Cryobiology]. K: Naukova dumka; 1994. 430 s. (Russian)
26. Fuler B, Grin K, Grishhenko VI. Kriokonservirovanie dlja sozdanija banka kletok: sovremennye koncepcii na rubezhe XXI stoletija [Cryopreservation for cell banking: contemporary concepts at the turn of the 21st century]. Probl kriobiol. 2003; (2): 62-83. (Russian)
27. Nardid OV. Vlijanie nizkih temperatur na belkovye sistemy [The effect of low temperatures on protein systems]. Probl kriobiol kriomed. 2014 Jun; 24(2): 83-101. (Russian) Available from: http://cryo.org.ua/journal/index.php/probl-cryobiol-cryomed/article/view/555
28. Boutron P, Mehl P, Kaufann A, Angibaud P. Glass forming tendency and stability of the amorphous state in the aqueous solutions of linear polyalcohols with four carbons. Cryobiology. 1986 Oct 01; 23(5): 453-469. DOI: 10.1016/0011-2240(86)90031-3
29. MacFarlane D. Physical aspects of vitrification in aqueous solutions. Cryobiology. 1987 Jun; 24(3): 181-195. https://doi.org/10.1016/0011 -2240(87)90022-8
30. Rall W, Reid D, Farrant J. Innoccuous biological freezing during warming. Nature. 1980 Jul 31; 286(5772): 511-4. doi: 10.1038/286511a0
Реферат
ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ И АДГЕЗИЯ К ЭРИТРОЦИТАМ ЧЕЛОВЕКА ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ ПОСЛЕ ИММОБИЛИЗАЦИИ В АЛЬГИНАТНЫХ ГЕЛЯХ И ХРАНЕНИЯ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУРАХ Высеканцев И.П., Петров И.В., Буряк И.А., Марценюк В.Ф.
Ключевые слова: пробиотики, иммобилизация, альгинатный гель, низкотемпературное хранение.
Исследование посвящено разработке технологий длительного хранения иммобилизованных в ге-левых носителях пробиотиков при различных низких температурах. Цель исследования - изучить сохранность и адгезивную активность микроорганизмов-пробиотиков после иммобилизации в альгинат-ном геле и хранения при различных низких температурах в течение 24 месяцев (срок наблюдения). Объекты и методы исследования. Пробиотические штаммы микроорганизмов Escherihcia coli M-17 (E. coli M-17), Lactobacillus acidophilus 1MB B-2637 (L. acidophilus), Saccharomyces cerevisiae 1MB Y-505 (s. cerevisiae) были иммобилизованны в 1%-ном альгинатном геле без добавок или с добавлением лактозы, сахарозы, обезжиренного молока и защитной сахарозо-молочно-лактозной среды. Образцы замораживали с неконтролируемыми скоростями охлаждения в холодильных камерах с температурами -20, -40, -75 °С. Во время замораживания до -196 °С образцы охлаждали до -40 °С со скоростью 1 град. / мин, а затем погружали в жидкий азот. Образцы хранили при указанных температурах в течение 24 месяцев (срок наблюдения). В процессе хранения часть гранул отогревали на водяной бане и растворяли в 4% ЭДТА. Жизнеспособность определяли по способности микробных клеток образовывать колонии на агаризованных средах. Адгезивную активность определяли по способности микроорганизмов адгезировать к эритроцитам человека 0 (I) группы, Rh (+). Полученные результаты и обсуждение. После охлаждения до -20, -40, -75, -196 °С и последующего хранения при -196 °С иммобилизованные микроорганизмы во всех видах геля не погибали. При -20, -40, -75 °С в большинстве образцов гибель клеток начиналась между первым и 3-м месяцами хранения. Через 24 месяца было установлено, что наиболее устойчивыми к хранению при этих температурах были бактерии L. acidophilus, а наиболее чувствительными - дрожжи S. cerevisiae. Показатели жизнеспособности всех микроорганизмов, иммобилизованных в 1%-ном геле без добавок, были минимальными. Добавление в состав альгинатного геля дисахаридов лактозы, сахарозы, сахарозо-молочно-лактозной среды и молока повышало криопротективные свойства альгинатного геля. Наиболее высокую жизнеспособность иммобилизованных микроорганизмов наблюдали в геле с добавлением сахарозо-молочно-лактозной среды. С понижением температуры хранения от -20 до -75 °С количество жизнеспособных микробных клеток во всех образцах геля повышалась. Иммобилизация в гелевых носителях и хранение в течение 24 месяцев не влияли на адгезивные свойства пробиотиков E. coli M-17, L. аcidophilus, S. cerevisiae. Изменения показателей жизнеспособности микробных клеток связаны с выраженностью повреждающих физико-химических факторов, сопровождающих процессы кристаллизации воды при температурах -20, -40, -75 °С. Анализируется защитное действие добавок в состав альгинатного геля. Выводы. Во время длительного хранения при различных низких температурах на жизнеспособность иммобилизованных в гелевых гранулах микроорганизмов влияют видовая криорезистентность микроорганизмов, температурные режимы и сроки хранения, состав гелевого носителя. Процессы иммобилизации и хранения при низких температурах не меняли адгезивную активность иммобилизованных микроорганизмов.
Summary
VIABILITY OF PROBIOTIC STRAINS OF MICROORGANISMS AND THEIR ADHESION TO HUMAN ERYTHROCYTES AFTER
IMMOBILIZATION IN ALGINATE GEL AND STORAGE AT DIFFERENT LOW TEMPERATURES
Vysekantsev I.P., Petrov I.V., Buriak I.A., Martsenyuk V.P.
Key words: probiotics, immobilization, alginate gel, low-temperature storage.
The research was focused on the development of technologies for long-term storage of probiotics immobilized in gel carriers at various low temperatures. The aim of the research was to investigate the viability and adhesive activity of probiotic microorganisms after immobilization in an alginate gel and storage at various low temperatures for 24 months (observation period). Probiotic strains of the microorganisms Escherichia coli M-17 (E. coli M-17), Lactobacillus acidophilus IMB B-2637 (L. acidophilus), Saccharomyces cerevisiae IMB Y-505 (S. cerevisiae) were immobilized in 1% alginate gel either without additives or supplemented with lactose, sucrose, skimmed milk and protective SML medium. The samples were frozen at uncontrolled cooling rates in refrigerators with temperatures of -20, -40, -75 °C. When then frozen down to -196 °C, the samples were cooled to -40 °C at the rate of 1 deg / min, and then immersed in liquid nitrogen. The samples were stored at the indicated temperatures for 24 months (observation period). During storage, part of the granules was thawed in a water bath and dissolved in 4% EDTA solution. The viability of microorganisms was determined by the ability of microbial cells to form colonies on agar media. Adhesive activity was determined by the ability to adhere to human erythrocytes 0(I) group, Rh (+). When cooled down to -20, -40, -75, -196 °C and after subsequent storage at -196 °C, immobilized microorganisms in all varieties of gel did not die. In most samples cells died between 1 and 3 months of storage at -20, -40, -75 °C. After 24 months, it was found that the most resistant to storage at these temperatures were the bacteria
L. acidophilus, and the most sensitive were the yeast S. cerevisiae. The viability of all microorganisms immobilized in 1 % gel without additives was minimal. The addition of disaccharides of lactose, sucrose, SML medium and milk to the alginate gel increased the cryoprotective properties of the alginate gel. The highest viability of immobilized microorganisms was observed in the gel with SML medium. As the storage temperature decreased from -20 to -75 °C, the number of viable microbial cells in all gel samples increased. Immobilization in gel carriers and storage for 24 months did not affect the adhesive properties of probiotics E. coli M-17, L. acidophilus, S. cerevisiae. The changes in the viability of microbial cells are associated with the severity of damaging physicochemical factors that accompany the processes of water crystallization at temperatures of -20, -40, -75 °C. The protective effect of additives in the composition of the alginate gel is analyzed. The viability of microorganisms immobilized in gel granules during long-term storage at different low temperatures is influenced by the species cryoresistance of microorganisms, temperature regimens and storage duration, the composition of the gel carrier. The processes of immobilization and storage at low temperatures did not change the adhesive activity of immobilized microorganisms.
DOI 10.31718/2077-1096.20.4.124
УДК 616.314-018.4-003.93-085.272.2:612.015.31]-073.756.8-036-092.9
Ган 1.В., Фурдичко А.1., Льчишин М.П., Федун 1.Р., Пороховська Н.В.
ХАРАКТЕРИСТИКА ВПЛИВУ ОСТЕОТРОПНИХ ПРЕПАРАТ1В НА РЕГЕНЕРАЦ1Ю К1СТКОВО1 ТКАНИНИ НА ОСНОВ1 АНАЛ1ЗУ КАЛЬЦ1Й-ФОСФОРНОГО ОБМ1НУ В ЕКСПЕРИМЕНТ1 ТА КЛ1Н1ЧНО-РЕНТГЕНОЛОГ1ЧНИХ ОБСТЕЖЕНЬ ПАЦ1£НТ1В
Л^вський нацюнальний медичний ушверситет iменi Данила Галицького
Лкування хворих на хронiчний перодонтит е однею з важливих I не повнстю вирiшеною проблемою сучасноУ стоматологй, що спонукало до пошуку нових ефективних методв лкування. Метою нашого дослдження було о^нити ефективнсть впливу на '¡нтенсившсть регенера^йних процес'т в кiстковiй тканин композицИ на основI г1дрокс1апатиту кальцю в експериментi, аналiзуючи ре-зультати каль^й-фосфорного обману, а також проанал1зувати ефективнсть лкування хворих на хронiчний гранулюючий пер'юдонтит з набутою широкою верхвкою кореня зуба, розпрацьованою компози^ею та порiвняти з результатами використання загальноприйнятого матер1алу мiнерал триоксид агрегат. Матерiали та методи дослдження. Ус тварини були розподтеы на 4 досл1дн1 групи, яким створили деструкцю к1стково( тканини та заповнили !!' дослджуваними матер'алом, о^м групи порiвняння. Виведення з експерименту проводили на 14 та 90 добу. У гомогенатI кст-ковоТ тканини дослджували вмст кальцию та фосфору. 59 хворих розпод 'тено на двI групи: у дослI-дый групi проводили пломбування апкальноТ длянки кореня запропонованою нами компози^ею, а у групi порiвняння - пломбування верхвки кореня матер'алом мiнерал триоксид агрегат. Результа-ти та Ух обговорення. На 14 добу спостергали найбльше зниження '¡ошв кальцю та фосфору у 2-й дослЮнш групi у 1,8 раза, а у 4-й - лише у 1,3 раза. На 90 добу вмст iонiв кальцю та фосфору все ще залишався нижчим вдносно показникв групи контролю у 1,6 та 1,5 раза вдповдно, а у 4-й групi у 1,01 та 1,1 раза. Анал'з результат'¡в лкування хворих через 6 мся^в свдчить про зниження зна-чення !ндексу у дослЮнш групi в 1,4 раза, а в контрольн1'й - в 1,1 раза. Через 12 мся^в у дослЮнш групi!ндекс зменшився в 1,9 раза, а у групi порiвняння лише в 1,4 раза. Висновок. Експерименталь-но, кл1н1чно та рентгенологiчно доведено, що запропонована композиця ефективнше стимулюе процеси б1орев1тал1зацИ та регенерацн тканин перодонту порiвняно ¡з загальноприйнятим препаратом мiнерал триоксид агрегат.
Ключов1 слова: хронлчний гранулюючий перюдонтит, композиц1я на основ! пдрошапатиту кальц1ю, регенерац1я, кальцй фосфорний обм1н, шдекс стану деструкцп верх1вкового перюдонтиту (СДВП).
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота е фрагментом теми дослiдження кафедри тера-певтичноГ стоматологи Львiвського нацонального медичного ушверситету iменi Данила Галицького "Розробка та вдоско-налення методiв дiагностики, профлактики та лкування пародонту, ка^есу та його ускладнень", № держ. реестрацп
0120U002139.
Хрошчш форми перюдонтиту займають ваго-ме мюце серед уах стоматолопчних захворю-вань та залишаються актуальною проблемою сучасно' медицини. У працездатного населення молодого вку спостер^аеться помина тенден^я до збтьшення випадюв захворювань на хрошчш форми перюдонтиту. Це зумовлено складнютю дiагностики та досить часто вщсутнютю трива-
Вступ
лих позитивних результат пюля проведеного ендодонтичного лкування [1, 2]. Довготривалий безсимптомний переб^ хрошчних форм перн одонтиту спричиняе наростання деструкцшних процеав не лише в тканинах перюдонту та аль-веолярнш кютц^ але й сприяе резорбцп цементу та дентину кореня, що зумовлюе утворення на-бутоТ широкоТ верхiвки кореня зуба. Головними завданнями пщ час лкування хворих на хрошч-
