CC BY
78
3. Гашев С.Н. Млекопитающие в системе экологического мониторинга (на примере Тюменской области) [Электронный ресурс]: автореф. дисс. ... на соискание ученой степени доктора биологических наук. - Тюмень, 2003. - Режим доступа: www.tmnlib.ru.
4. Мэггаран Э. Экологическое разнообразие и его измерение. - М., 1992. - 181 с.
5. Новиков Г.А. Полевые исследования по экологии наземных позвоночных. - М., 1959. - С. 299-452.
6. Формозов А.Н. Звери, птицы и их взаимосвязи со средой обитания. - М., 1977. - 183 с.
7. Caacuteceres N., Naacutepoli R., Casella J., Hannibal W. Influence of multi-scale landscape structure on the occurrence of carnivorous mammals in a human-modified savanna, Brazil [Электронный ресурс] // Journal of Natural History. - 2010. - Vol. 44, Issue 7&8. - P. 491-512. - Режим доступа: www.sprin-gerlink.com/content/451q6741128l0rr0.
8. Ellenberg H., Weber H., Dull R., Wirth W., Werner W., PauliBen D. Zeigerwerte von Pflanzen in Mitteleuropa. - 2 ed. // Scr. Geobot. - 1992. - V 18. - P. 1-258.
9. Ouin A., Paillat G., Butet A., Burel F. Spatial dynamics of wood mouse (Apodemus uralensis) in an agricultural landscape under intensive use in the Mont Saint Michel Bay (France) [Электронный ресурс] // Agriculture, Ecosystems & Environment. - 2000. - Vol. 78, Issue 2. - P. 159-165. - Режим доступа: www.sciencedirect.com.
10. The influence of habitat and landscape on small mammals in Estonian coastal wetlands/elupaiga tuubi ja maastiku mitmekesisuse moju pisiimetajatele Eesti ranniku-margaladel [Электронный ресурс] // Full-Text Online Library. -2008. - Режим доступа: www.thefreelibrary.com/The+influence+of+habitat+ and+landscape+on+small+mammals+in+Estonian...-a0199194799.
ЗАВИСИМОСТЬ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ БИФИДОБАКТЕРИЙ ОТ КИСЛОТНОСТИ СРЕДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
© Емельяненко В. А.*, Королюк А.М.*
Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов Федерального медико-биологического агентства, г. Санкт-Петербург
Показана сильная степень прямой корреляции (r = 0,9) между pH культуральной жидкости Bifidobacterium bifidum 1 в интервале от 3,5 до
* Микробиолог научно-производственного комплекса «Пробиотические препараты».
♦ Руководитель научно-производственного комплекса «Пробиотические препараты», доктор медицинских наук, профессор.
4,8 и числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в ней. Максимальное количество жизнеспособных клеток отмечено в ассоциации, состоящей из единичных колоний. Кислые аутометаболиты могут служить причиной появления в культуре нетипичных быстрорастущих форм, что, по-видимому, является одной из причин диссоциации бифидобактерий. Жизнеспособность нетипичной быстрорастущей формы В. Ы/Сыт 1 вар. 3 не зависит от конечной кислотности среды.
Бифидобактерии - облигатный компонент в составе биоценозов желудочно-кишечного тракта. Эти микроорганизмы выполняют важнейшие физиологические функции, обеспечивающие здоровье человека. Поэтому они используются для получения пробиотических средств коррекции дис-биозов. Вместе с тем, из-за некоторых особенностей физиологии бифидо-бактерий возникают определенные трудности не только при их культивировании, но и при лечебно-профилактическом использовании. В ряду многих отличительных свойств этих бактерий следует отметить их потребность в анаэробной атмосфере, а также кислотообразование в питательной среде, которое с определенного момента тормозит их рост и размножение. Поэтому их культивирование требует особых условий. Бифидосодержа-щие препараты и продукты теряют часть своей активности, преодолевая кислотный барьер желудка. Эти технологические и биомедицинские проблемы могут решаться еще более успешно, чем сейчас, если шире использовать высокую вариабельность свойств разных штаммов и популяций бифидобактерий.
Целью настоящей работы было исследование характера влияния кислотности среды культивирования на способность бифидобактерий к размножению. Это важно в практическом отношении, т.к. позволит оптимизировать управление процессом роста В. Ы/гСыт 1 в условиях их повышенной чувствительности к кислой среде.
Материалы и методы. Объектом исследования служил штамм В. Ы/гСыт 1, применяемый для производства пробиотических препаратов Би-фидумбактерин сухой, БИФИНОРМ®. В работе также использовали вариант этого штамма В. Ы/гСыт 1 вар. 3, полученный в результате селекции-онной работы [1]. Жизнеспособность бифидобактерий определяли методом последовательных десятикратных разведений в среде Блаурокка. Культуры инкубировали 72 ч при 38 после чего вели количественный учёт колоний в последнем разведении. Активность кислотообразования определяли потенциометрически.
Результаты и обсуждение. На первом этапе работы изучали зависимость жизнеспособности культуры от состояния посевного материала. Для посева использовали три варианта: 1) 1 мл 72-часовой культуры из первой пробирки в ряду десятикратных разведений; 2) одна крупная единичная колония В. Ы/гСыт 1 в среде Блаурокка после 72 ч культивирования
при 38 °С (из последней пробирки в ряду десятикратных разведений) в 1 мл среды Блаурокка; 3) десять крупных единичных колоний из разведения 10-7 в 1 мл среды Блаурокка. Перед посевом измеряли значение рН исследуемой культуры. Материал засевали в ряд пробирок с 9 мл среды Блаурокка с последующими десятикратными разведениями и инкубировали 72 ч при 38 °С
Было обнаружено, что крупные единичные колонии бифидобактерий обладают более высокой жизнеспособностью, чем многочисленные мелкие колонии из густой смеси В. Ы/гСыт 1 того же возраста. К тому же, количество жизнеспособных клеток в посевном материале прямо зависело от кислотности среды - в 1 мл 72-часовой нативной культуры при рН 3,8 находилось ^ 4,5 КОЕ/мл, одна крупная единичная колония из разведения 10-8 содержала ^ 8 КОЕ/мл, а десять крупных единичных колоний из разведения 10-7 - соответственно ^ 8,8 КОЕ/мл.
Возможно, мелкие многочисленные колонии, создавая вокруг себя сильно закисленную среду, снижают свою жизнеспособность. Было замечено, что кислая среда обладает бактериостатическим действием: засеянные в ряд десятикратных разведений единичные колонии давали рост, заметный уже через 48 ч, а не 72 ч, как у смешанных жидких культур. В случае единичных крупных колоний в пробирке кислотность среды незначительна, поэтому практически все клетки колонии способны к дальнейшему размножению.
На следующем этапе работы провели количественную оценку жизнеспособных бифидобактерий в каждой пробирке ряда десятикратных разведений В. Ы/гСыт 1 и измерение рН культур в каждой пробирке ряда после 72 ч культивирования при 38 °С. Результаты исследования приведены на рисунке, где показана зависимость количества жизнеспособных клеток В. Ы/гСыт 1 от значения рН культуры.
Коэффициент корреляции этих двух признаков в исследуемом интервале рН (3,8-6,0) - г = 0,5. Это средняя зависимость двух варьирующих величин. В интервале рН (3,8-4,8) г = 0,9, что показывает сильную степень прямой корреляции кислотности среды и числа колониеобразующих единиц в ней.
Полученные данные продемонстрировали, что количество жизнеспособных клеток В. Ыг/гСыт 1 зависит от состояния посевного материала, возраста культуры, концентрации клеток в ней. Клетки бифидобактерий в популяции, имеющей большую концентрацию, обладали пониженной скоростью роста и пониженной жизнеспособностью. Если материал брался из более разведённой гомогенной культуры или состоящей из различимых отдельных колоний, содержащей меньшее количество кислых метаболитов, то жизнеспособность этих клеток была выше, чем в более концентрированной культуре. Следовательно, в посевном материале должны быть клетки, минимально контактирующие с продуктами аутометаболизма,
особенно с органическими кислотами, обладающими бактериостатиче-ским действием. Число жизнеспособных клеток в 1 мл культуры обратно пропорционально количеству находящихся там колоний. Максимальное количество жизнеспособных клеток отмечено в ассоциации, состоящей из отдельных единичных колоний. Таким образом, варьируя состоянием посевного материала и временем культивирования, можно добиться выхода более концентрированной биомассы.
ю
3,8 4,4 4,6 4,8 4,9 5 5,8 5,9 6 6 6 6 ЗначениярН культуры
Рис. 1. Зависимость количества жизнеспособных В. Ы/гёиш 1 от значения рН среды культивирования.
Для проверки этого предположения была поставлена серия опытов по оптимизации культивирования бифидобактерий. Установлено, что схема производства должна включать в себя отбор единичных колоний на первом этапе работы и строгого соблюдения.
В наших предыдущих исследованиях и в работах других авторов [2-4] было показано, что бифидобактериям для роста нужны и внеклеточные компоненты культуральной жидкости, за счёт чего снижается негативное влияние стрессовых факторов и возрастает стимулирующий эффект экзо-метаболитов. Сопоставив эти факты, можно найти противоречие - единичная колония без окружающих метаболитов более жизнеспособна, чем жидкая культура с метаболитами. Но это внешнее противоречие. По сути, единичная колония всегда окружена метаболитами, концентрация их достаточна для стимуляции роста, а кислых угнетающих веществ в такой системе меньше.
Кроме того нами замечено, что в некоторых случаях при посеве 72-96-часовых густых культур В. Ы/гёыш 1, представляющих собой пробирки с 9 мл среды Блаурокка, засеянных 1 мл посевного материала, в ряду десятикратных разведений обнаруживались нетипичные быстрорастущие колонии бифидобактерий кометовидной формы, вместо привычных «крошек» и «гвоздиков». Эти колонии находились в убывающей концентрации в разведениях от 10-1 до 10-4-10-5 через 24 ч культивирования при 38 °С, а к 72 ч роста только в некоторых случаях появлялись типичные медленнорастущие колонии. Это может свидетельствовать о том, что слишком концентрированная 96 ч культура из пробирки с посевным материалом не содержала уже жизнеспособных типичных медленнорастущих клеток. Возможно, слишком долгий контакт их с кислыми метаболитами, находящимися в большом количестве из-за начальной сильной степени размножения клеток, привёл к тому, что жизнеспособность типичных медленнорастущих бифидобактерий упала практически полностью. Наличие в этих условиях нетипичных быстрорастущих форм можно связать с их большей устойчивостью к кислотам. Причина образования таких форм - диссоциация типичных медленнорастущих бактерий. Это стало возможным, по-видимому, под влиянием кислой реакции среды. Диссоцианты в силу своих особенностей выжили в среде с повышенной кислотностью и стали более заметны при отсутствии типичных медленнорастущих колоний. Исследование зависимости жизнеспособности нетипичных быстрорастущих форм бифидобактерий, когда в качестве посевного материала использовали культуру бифидобактерий В. Ы/гёыш 1 вар. 3 по предложенной выше схеме, показало, что в каждой пробирке ряда десятикратных разведений через 72 ч роста при 38 °С содержалось приблизительное одинаковое число жизнеспособных бактерий - 2 х 107. Если через 24 ч в ряду разведений быстрорастущие колонии находились в убывающей концентрации, то к 72 ч в пробирках появлялась гомогенная взвесь. Измерение рН этого материала показало приблизительно одинаковую величину - 5,0 ± 0,2. Это позволило заключить, что жизнеспособность диссоциированной формы бифидобакте-рий В. Ы/гёыш 1 вар. 3 в минимальной степени зависит от рН среды.
Таким образом, исследование влияния кислотности среды культивирования на жизнеспособность типичной формы бифидобактерий В. Ы/гёыш 1 показало среднюю степень прямой корреляции (г = 0,5) между кислотностью среды в интервале рН 3,8-6,0 и числом колониеобразующих единиц в ней. В интервале рН 3,8-4,8 имеется прямая корреляция сильной степени (г = 0,9) между этими показателями. Максимальное количество жизнеспособных клеток отмечено в ассоциации, состоящей из отдельных единичных колоний. Выявленная закономерность легла в основу технологической схемы производства пробиотического препарата БИФИНОРМ®. Кислые аутометаболиты бифидобактерий в некоторых случаях вызывают
в культуре появление нетипичных быстрорастущих форм, что, по-видимому, является одной из причин диссоциации бифидобактерий. Было обнаружено, что жизнеспособность нетипичной быстрорастущей формы бифидобактерий B. bifidum 1 вар. 3 не зависит от конечной кислотности среды, в которой находится культура. Причиной этому может быть как повышенная кислотоустойчивость данной формы бактерий, так и общее снижение её активности кислотообразования.
Список литературы:
1. Младзиевская Ю.А. Совершенствование биотехнологического производства и методов контроля качества пробиотиков на основе бифидо-бактерий и лактобацилл: автореф. дисс. ... канд. биол. н. / Ю.А. Младзиевская. - СПб., 2005. - 22 с.
2. Емельяненко В.А. Влияние аутометаболитов и клеточных структур на рост Bifidobacterium bifidum 1 // Материалы 6-й Объединённой научной сессии и 2-го Международного конгресса по пробиотикам «Санкт-Петербург - Пробиотики-2009» (28-29 октября 2009 года) / В.А. Емельяненко, А.М. Королюк // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. - 2009. - № 4.
3. Вахитов Т.Я. Ауторегуляторы роста нормальной микрофлоры, как основа для создания новых пребиотиков / Т.Я. Вахитов, Л.Н. Петров // «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования»: междун. науч.-практ. конференция памяти Г.И. Гончаровой: материалы конф., Москва, 2002. - М., 2002. - С. 17-18.
4. Вахитов Т.Я. Регуляторные функции бактериальных экзометаболи-тов на внутрипопуляционном и межвидовом уровнях: автореф. дисс. ... докт. биол. н. / Т.Я. Вахитов. - СПб., 2007. - 40 с.
ВЛИЯНИЕ КВЧ-ИЗЛУЧЕНИЯ НА ВСХОЖЕСТЬ СЕМЯН ЯЧМЕНЯ И НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТА АМИЛАЗЫ В ЯЧМЕННОМ СОЛОДЕ
© Калье М.И.*
Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия, г. Нижний Новгород
Показано влияние КВЧ-излучения с различными частотными характеристиками на лабораторную всхожесть ячменя. Изучали воздействие излучения на активность фермента амилазы и содержание сахаров в ячменном солоде.
* Аспирант кафедры Ботаники и физиологии растений.
