Зависимость экспрессии генов мембранно-связанных субъединиц сукцинатдегидрогеназы от степени метилирования отдельных CG-динуклеотидов их промоторов Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 577.1

ЗАВИСИМОСТЬ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ МЕМБРАННО-СВЯЗАННЫХ СУБЪЕДИНИЦ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ОТ СТЕПЕНИ МЕТИЛИРОВАНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ CG-ДИНУКЛЕОТИДОВ ИХ

ПРОМОТОРОВ*

© 2017 Д. Н. Федорин1, М. А. Добычина2, Г. Б. Лопырева3, М. В. Черкасских4, А. Т. Епринцев5

1канд. биол. наук, доцент кафедры биохимии и физиологии клетки

e-mail: rybolov@mail.ru 2магистрант направления подготовки Биология, профиль Биохимия

e-mail: mzenishheva@yandex.ru 3магистрант направления подготовки Биология, профиль Биохимия

e-mail: galinalpyreva@rambler. ru 4магистрант направления подготовки Биология, профиль Биохимия

e-mail: fess-ru@mail. ru 5 докт. биол. наук, профессор, зав. кафедрой биохимии и физиологии клетки e-mail: bc366@bio.vsu.ru

Воронежский государственный университет

Показано изменение содержания транскриптов генов sdh3 и sdh4 в щитках кукурузы при прорастании семян, что связано с переходом растительного организма на автотрофный тип питания и изменением основного метаболизма. Исследование нуклеотидного состава промоторов исследуемых генов показало различие в содержании CG-динуклеотидов в их составе. Показана роль метилирования CG-динуклеотидов промоторов генов мембранно-связанных субъединицы В СДГ в регуляции их экспрессии при прорастании семян.

Ключевые слова: сукцинатдегидрогеназа, уровень транскриптов, промотор, метилирование ДНК, CpG-островок, метилспецифичная полимеразная цепная реакция

Сукцинатдегидрогеназа (СДГ, КФ 1.3.99.1) - ключевой фермент, который принимает участие одновременно в ЦТК и ЭТЦ митохондрий. Этот фермент представляет чрезвычайный интерес для изучения, так как обеспечивает протекание как энергетического, так и конструктивного метаболизма в клетке. Растения - это сложные системы, в процессе развития которых происходит переход с гетеротрофного типа питания на автотрофный. В результате этого перехода происходит серьезное перестроение всех метаболических процессов в организме растения. На начальных этапах развития растение существует как гетеротроф и использует в качестве источника питания запасные вещества. В щитках кукурузы жиров содержится до 50% от массы [White, Weber 2003; Logan et al. 2001], поэтому очевидным является тот факт, что они служат основным источником питания, метаболизируясь до углеводов через глиоксилатный цикл. В процессе дальнейшего развития семени происходит изменение типа метаболизма, где основным поставщиком энергии становится фотосинтез, а цикл Кребса выполняет функцию поставки субстратов для биосинтетических процессов

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (РНФ), грант № 14-1400721.

[Епринцев и соавт. 2007]. Сукцинатдегидрогеназа является ключевым ферментом, так как связывает биосинтетические и энергетические процессы в клетке. СДГ-комплекс состоит из четырех субъединиц. При этом СДГ-система имеет сложную генетическую детерминацию: СДГА кодируется двумя генами, СДГВ - тремя, СДГС - двумя и СДГБ - одним геном [Scheffler 1998; Figueroa et al. 2002]. Ранее было показано, что гены каталитического димера имеют дифференциальную экспрессию в период прорастания семян кукурузы, что отражается на изменении изоферментного состава [Епринцев и соавт. 2010]. Но в, то, же время, практически нет данных о вкладе мембраносвязанных субъединиц в регуляцию функционирования сукцинатдегидрогеназы. Поэтому интересным представляется изучить роль субъединиц С и D в работе СДГ-системы при прорастании семян кукурузы.

Материалы и методы исследования. В качестве объектов исследования использовали щитки Zea mays L., выращенные гидропонным методом в течение 10 дней при 25°С, 12-часовом световом дне с интенсивностью света 25 Вт/м2.

Суммарную РНК из щитков кукурузы выделяли методом фенол-хлороформной экстракции. В качестве осадителя использовался LiCl.

Полимеразную цепную реакцию в реальном времени проводили на приборе LightCycler96 (Roche, Швейцария), используя в качестве красителя SYBR Green I. Для проведения реакции брали кДНК, полученную с использованием 100 нг суммарной клеточной РНК. В качестве референсного гена использовали ген фактора элонгации ef-1а. В качестве праймеров использовали следующие нуклеотидные последовательности к генам sdh3 и sdh4: sdh3-f -AAGGAGGCTTCTCCATCTCC; sdh3-r -CAGAGCTGCTACAGGGGAAG; sdh4-f -AACCCACTGGGAAGAGACCT; sdh4-r -GACGATTGACGCGAGAATTT.

Параметры амплификации были следующие: предварительная денатурация при 950С 5 минут, цикл 950С - 30 сек., 590С - 30 сек., 720С - 30 сек. (детекция) (35 циклов), финальная элонгация - 720С - 10 мин.

Определение относительного уровня транскриптов исследуемых генов проводили с применением 2"ААа-метода с использованием программного обеспечения Opticon Monitor™ Software (Biorad, США).

Для анализа промоторов генов sdh3 и sdh4 на наличие CpG-островков и подбора праймеров для метилспецифичной ПЦР была использована программа MethPrimer (http://www.urogene.org/methprimer/index1.html). Нуклеотидные последовательности промоторных областей генов СДГ кукурузы были взяты из базы данных NCBI (США, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Полимеразную цепную реакцию с метилспецифичными праймерами проводили с помощью набора реактивов AmpliSence (Хеликон, Россия). Реакция ПЦР осуществлялась на приборе «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) со следующими параметрами амплификации: предварительная денатурация при 95оС в течение 5 мин, затем 35 циклов: 95оС - 20 с, 59оС - 20 с, 72оС - 30 с и, наконец, 72оС - 4 мин.

Расчет численных значений МС-ПЦР проводился на основании результатов электрофореграмм ПЦР-продуктов. Значения степени метилирования промотора являются суммарным показателем результатов ПЦР анализа исследуемых CG-динуклеотидов в промоторе конкретного гена [Епринцев и соавт. 2012].

Опыты проводили в трехкратной биологической и аналитической повторности. Полученные данные обрабатывали с использованием стандартных статистических методов с помощью критерия Стьюдента [Лакин 1990].

Результаты и их обсуждение. Изменение уровня транскриптов генов sdh3 и sdh4 было исследовано в щитках кукурузы в течение десяти дней прорастания.

Федорин Д. Н., Добычина М. А., Лопырева М. В., Черкасских М. В., Епринцев А. Т.

Зависимость экспрессии генов мембранно-связанных субъединиц сукцинатдегидрогеназы от степени метилирования отдельных СО-динуклеотидов их промоторов

Проведенный анализ содержания транскриптов гена $йЬ,3 свидетельствует о его дифференциальной экспрессии в этот период развития растения, при этом не наблюдалось достоверных различий в уровне экспрессии этого гена в первые дни прорастания семян. В дальнейшем, начиная с шестого дня, происходит увеличение уровня транскриптов исследуемого гена, который достигает максимума к восьмому дню эксперимента (рис. 1).

л 1 ^

X

«и

со сг

о ш т

£ а °<8

>5 2 Т

......

4 5 6 7 Дни прорастания

Рис. 1. Изменение уровня транскриптов гена $(Лк3 в щитках кукурузы при прорастании семян.

Значения экспрессии гена рассчитывались относительно уровня экспрессии гена фактора элонгации в/-1а

л-дда методом 2

Иная картина наблюдается при исследовании содержания транскриптов гена sdh4. Для этого гена данный показатель значительно (примерно на 40%) увеличивается уже к первому дню развития, по отношению к сухим семенам (0 день). Максимальный

уровень транскриптов обнаружен на третий день прорастания семян кукурузы (рис. 2).

1,2

0,8

0,6

0,4

0,2

0

II

I

10

0123456789 Дни прорастания

Рис. 2. Изменение уровня транскриптов гена sdh4 в щитках кукурузы при прорастании семян. Значения

экспрессии гена рассчитывались относительно уровня экспрессии гена фактора элонгации в/-1а методом 2

-дда

Высокая скорость функционирования гена sdh4 наблюдается в период наиболее интенсивной мобилизации запасных веществ семени. Об этом свидетельствуют данные ряда исследователей [Епринцев, Попов 1999]. Вероятно, исследуемый ген принимает участие в формировании изоформ сукцинатдегидрогеназы, вовлеченных в цикл Кребса и ЭТЦ митохондрий и обеспечивающих протекание энергетического и конструктивного метаболизма. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что ген sdh4 участвует в формировании форм исследуемого фермента, обеспечивающих гетеротрофный тип метаболизма растений.

Увеличивающийся уровень фотосинтеза, как основного источника энергии, к восьмому дню прорастания семян приводит к изменению картины экспрессии генов сукцинатдегидрогеназного комплекса. Резко снижается экспрессия генов каталитического димера, что было показано ранее [Епринцев и соавт. 2012а].

Увеличивающаяся экспрессия гена sdh3 на последних днях прорастания семян, вероятно, обусловлена необходимостью синтеза дополнительных форм сукцинатдегидрогеназной системы, участвующих в анаплеротических реакциях, в том числе альтернативных механизмах электронного транспорта в митохондриях [Епринцев и соавт. 2010].

Дифференциальная экспрессия генов мембранно-связанных субъединиц сукцинатдегидрогеназы может быть обусловлена наличием регулирующих механизмов экспрессии генов. Таким механизмом может быть метилирование промоторов sdh3 и sdh4. Так, для генов sdh1-1 и sdh1-2 Arabidopsis thaliana была обнаружена корреляция между уровнем транскрипции и степенью метилирования промоторов этих генов [Епринцев и соавт. 2012]. Подобные результаты были получены и для генов субъединицы В сукцинатдегидрогеназы и нитратредуктазы [БЪта et й. 2006; Nandula et й. 1999; Raghuram et й. 1999]

Таким образом, полученные данные по изменению экспрессии генов, кодирующих субъединицы С и D сукцинатдегидрогеназы, позволяют сделать предположение о их значительной роли в процессе прорастания семян и переходе к фотосинтезу. В течение первых дней развития проросток требует большого количества энергии и субстратов для биосинтетических процессов, что требует интенсификации цикла Кребса и ЭТЦ и, как следствие, увеличения экспрессии гена sdh4. В условиях отсутствия фотосинтеза проростки получают энергию, в том числе в процессе превращения запасных жиров в углеводы через процесс глюконеогенеза [Епринцев с соавт. 2007]. Резкая активация всех метаболических процессов и метаболизация резервных питательных веществ, окисляемых через ЦТК, имеет место при условии активной транскрипции гена sdh4 и высокой каталитической активности сукцинатдегидрогеназы.

Значительную роль в регуляции работы генов СДГ-комплекса может играть эпигенетический механизм, имеющий важное значение при переключении метаболизма растительной клетки. Важным моментом исследования был анализ нуклеотидного состава промоторов генов, кодирующих мембранно-связанные субъединицы исследуемого фермента, на наличие в них CpG-островков (рис. 3). Показано, что CpG-островок обнаружен только в составе промотора гена sdh4, что обусловливает возможность его регуляции за счет изменения статуса метилирования CG-динуклеотидов в его составе. Эти результаты позволили разработать праймеры для метилспецифичной полимеразной цепной реакции.

I I I I I I I 1 I I I I I I I I I I I 1 I I I I I I I I I I I 0 100 bp 200 bp 300 bp 400 bp 500 bp 600 bp 700 bp 800 bp 900 bp CpGII I

sdh3

sdh4

— CpG-островок

Рис. 3. Анализ CG-динуклеотидов в составе промоторов генов субъединиц С и D сукцинатдегидрогеназы Zea mays. Вертикальными линиями указаны положения CG-динуклеотидов

Федорин Д. Н., Добычина М. А., Лопырева М. В., Черкасских М. В., Епринцев А. Т.

Зависимость экспрессии генов мембранно-связанных субъединиц сукцинатдегидрогеназы от степени метилирования отдельных СО-динуклеотидов их промоторов

Анализ результатов метилспецифичной ПЦР свидетельствует о незначительных изменениях статуса метилирования СО-динуклеотидов промоторов генов сукцинатдегидрогеназного комплекса в щитках кукурузы при прорастании семян. При этом установлено, что на всем протяжении эксперимента изменение степени метилирования СО-динуклеотидов промоторов генов мембранно-связанных субъединиц сукцинатдегидрогеназы не проявляет четкой зависимости (табл.).

Степень метилирования СО-динуклеотидов промоторов генов, кодирующих субъединицы С и Б сукцинатдегидрогеназы, при прорастании семян кукурузы

Дни прорастания семян

ген 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

I + - - - ± - + + + +

sdh3 II - ± - - - - - + + +

III ± - - - ± - - - + +

I + + ± + ± + + ± ± +

sdh4 II + - ± ± - - - ± - ±

III ± ± ± ± ± ± ± ± ± -

Проведена аналитическая работа по выявлению корреляции между степенью метилирования промоторов исследуемых генов и уровнем транскриптов генов мембранно-связанных субъединиц сукцинатдегидрогеназы при прорастании семян растений. Данные, полученные в нашей работе, свидетельствуют о слабой роли метилирования CG-динуклеотидов промоторов генов СДГ-комплекса в регуляции экспрессии фермента, на что указывает отсутствие прямой корреляция между статусом метилирования промоторов и уровнем транскриптов генов sdh3 и sdh4 СДГ при прорастании семян кукурузы. Следовательно, эпигенетический механизм не является ключевым способом регуляции транскрипции генов мембранно-связанных субъединиц сукцинатдегидрогеназы при прорастании семян кукурузы.

Библиографический список

Епринцев A.T., Федорин Д.Н., Селиванова H.B., Ахмад Дж.А., Попов В.Н. Роль дифференциальной экспрессии генов sdh1-1 и sdh1-2 в изменении изоферментного состава сукцинатдегидрогеназы в прорастающих семенах кукурузы // Известия РАН. Серия биологическая. 2010. № 3. C. 324-332.

Епринцев А.Т., Попов В.Н. Ферментативная регуляция метаболизма ди- и трикарбоновых кислот в растениях. Воронеж: Изд-во Воронеж. ун-та, 1999. 192 с.

ЕпринцевА.Т., ПоповВ.Н., ШевченкоМ.Ю. Глиоксилатный цикл: универсальный механизм адаптации? М.: Академкнига, 2007. 228 с.

Епринцев А.Т., Селиванова Н.В., Федорин Д.Н., Башкин С.С., Селезнева Е.А., Дадакина И.В., Махмуд Али С. Роль катионов кальция в механизме фигохром-зависимой регуляции экспрессии гена sdh1-2 и активности сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы // Биологические мембраны. 2012а. Т. 29. № 3. С. 165-168.

Епринцев А.Т., Федорин Д.Н., Селиванова Н.В., Ву Т.Л., Махмуд А.С., Попов В.Н. Роль метилирования промоторов в регуляции генов сукцинатдегидрогеназы в проростках кукурузы // Физиология растений. 2012. Т 59. № 3. С. 332-340.

Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. шк., 1990. 351 с.

Elorza A., Roschzttardtz H., Gomez I., Mouras A., Holuigue L., Araya A., Jordana X. A Nuclear Gene for the Iron-Sulfur Subunit of Mitochondrial Complex II Is Specifically

Expressed during Arabidopsis Seed Development and Germination // Plant Cell Physiol. 2006. V. 47. P. 14-21.

Figueroa P., Leo'n G., Elorza A., Holuigue L., Araya A., JordanaX. The four subunits of mitochondrial respiratory complex II are encoded by multiple nuclear genes and targeted to mitochondria in Arabidopsis thaliana // Plant Mol. Biol. 2002. V. 50. P. 725-734.

Logan D.C., Millar A.H., Sweetlove L.J., Hill S.A., Leaver C.J. Mitochondrial biogenesis during germination in maize embryos // Plant Physiol. 2001. V. 125. P. 662-672.

Nandula R., Meena R.C., Sudhir K.S. Light Regulation of Nitrate Reductase Gene Expression in Maize Involves a G-Protein // Mol. Cell Biol. Res. Commun. 1999. V. 2. P. 8690.

Raghuram N., ChandokM. R., Sopory S. K. Light regulation of nitrate reductase gene expression in maize involves a G-protein // Molecular Cell Biology Research Communications. 1999. Т. 2. №. 2. С. 86-90.

Scheffler I.E. Molecular genetics of succinate:quinone oxidoreductase in eukaryotes // Progr. Nucleic. Acid. Res. Mol. Biol. 1998. V. 60. P. 267-315.

White P.J., Weber E.J. Lipids of the kernel // Chemistry and Technology. American Association of Cereal Chemists, Inc., St. Paul / in editors P.J. White, L.A. Johnson. Corn, 2003. P. 356-406.