CC BY
34
Физико-химическая биология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2012, № 2 (3), с. 241-245
УДК 616-006.66
ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫХ МОЛЕКУЛ В КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ,
ПОЛУЧЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ РАКОМ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА
© 2012 г. С.В. Шумилова1, А.Д. Перенков1, Н.А. Сахарнов1, Д.В. Новиков1, К.И. Ексина1,
Е.Н. Филатова1, А.Ю. Барышников2, В.В. Новиков1
1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского 2 Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
mar_mot@list.ru
Поступила в редакцию 22.03.2012
Исследованы профили экспрессии генов, кодирующих молекулы CD25 (IL-2Ra), CD38, CD95 (Fas), CD122 (IL-2RP) и CD132 (IL-2Ry) в клетках линий COLO 205, HCT116, HCT15, SW-620, T84, Сасо-2. Выявлена гетерогенность экспрессии генов CD38 и CD95 и отсутствие в клетках мРНК CD25. Исследование эпигенетической регуляции генов CD25, CD38 и CD95 показало, что только у гена CD25 метилирование регуляторных элементов строго соответствовало молчанию гена в опухолевой клетке.
Ключевые слова: рак толстого кишечника, клеточные линии, профиль экспрессии генов, CpG-метилирование.
Введение
Рак толстого кишечника сегодня можно без преувеличения обозначить как проблему мирового масштаба. По заболеваемости данный тип рака занимает одну из ведущих позиций среди всех онкологических заболеваний и имеет тенденцию к непрерывному росту частоты возникновения и смертности от него. Важным шагом на пути борьбы с онкологическими заболеваниями является изучение биологии опухолевой клетки. В связи с этим, одной из наиболее актуальных проблем онкологии является исследование молекулярно-биологических процессов, характерных для раковой клетки.
Гены, кодирующие дифференцировочные молекулы CD95, CD38, CD25, CD122, CD132, вовлечены в реализацию реакций иммунной системы человека. Белки, кодируемые данными генами, относятся к дифференцировочным антигенам клеток иммунной системы и экспрессируются на их поверхности.
Ген Fas (CD95) расположен в длинном плече 10-й хромосомы человека. Он кодирует трансмембранный гликопротеин Fas, который участвует в передаче сигналов в клетку. Через Fas передается два типа сигналов. Сигналы одного типа инициируют дифференциацию клеток, второго - приводят к Fas-зависимому апоптозу [1].
Ген CD38 кодирует трансмембранный гликопротеин второго типа, который обнаруживается на многих типах клеток и считается марке-
ром активации лимфоцитов. Белок обладает энзиматической активностью и катализирует образование циклической АДФ-рибозы, а также выполняет функцию молекулы адгезии [2].
Интерлейкин-2 (1Ь-2) регулирует активацию, дифференцировку и рост клеток иммунной системы через связывание с соответствующим рецепторным комплексом (1Ь-2Я) на мембране клеток. В состав данного рецепторного комплекса входят три нековалентно связанные гли-копептидные субъединицы: альфа-цепь (1Ь-2Яа, СБ25), бета-цепь (1Ь-2Яр, СБ122) и гамма-цепь (1Ь-2Яу, СБ132). Все три субъединицы рецептора выполняют разные функции. Альфа-цепь ответственна за связывание 1Ь-2 и чувствительность рецептора к лиганду. Бета-субъединица также играет роль в образовании комплекса «лиганд-рецептор». Бета- и гамма-цепи участвуют в передаче сигнала в клетку [3].
Известно, что в опухолевой клетке происходит существенный сдвиг профиля экспрессии многих генов, сопровождающийся синтезом продуктов, не свойственных данному типу ткани в норме. Так, опухолевый процесс может обусловливать появление на поверхности неопластической клетки белков, характерных для клеток иммунной системы. Одним из механизмов, приводящих к изменению экспрессии генов в раковой клетке, является метилирование СрО-островков промоторных регионов. Изменение профиля метилирования промоторных регионов некоторых генов является характерной чертой опухолевых клеток.
Таблица 1
Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных в ОТ-ПЦР анализе экспрессии генов
CD95, CD38, CD25, CD122, CD132
Название гена Название праймера Нуклеотидная последовательность праймера Ссылка
CD38 CD38-F1 5'- CTATGGCCAACTGCGAGTTC-3' Праймеры разработаны в рамках данного исследования
CD38-R1 5'- AAgAAACTTgTCAggTCTgT-3'
CD38-F2 5'- ATGAGACATGTAGACTGCCA-3'
CD38-R2 5 '-ATCCATTGAGCATCACATGG-3'
CDm (IL2RG) CD132-F1 5’-AAgACACCACAgCTgATTTC-3’
CD132-R1 5’-TCATgTACTCgACATT gAAC-3’
CD132-R2 5' -CGCAGGTGGGTTGAATGAAGGAA-3' [4]
CD122 (IL2RB) CD122- F1 5'-GTGAGCTGCTCCCCGTGAGTC-3'
CD122- R1 5'-GACAGCGTCCGGGCCTCGAAC-3'
CD25 (IL2RA) CD25-R1 5’-TGACTTCTGTTGTCTGTTCC-3’ [5]
CD25-F1 5’-CTGGCTGCCAGGCAGAGCTC-3’
CD25-R2 5’-GCTACCTCTAGATCTGTTGTAAATATGGACG-3’
CD25-F2 5’-AATGCACAAGCTCTGCCACT-3’
CD95 (Fas) CD95-F1 5'-CggAggATTgCTCAACAACC-3' [б]
CD95-R1 5'-TAgACCAAgCTTTggATTTC-3'
CD95-F2 5'- ATgCTgggCATCTggACCCT-3'
CD95-R2 5'-TTCCTTTCTCTTCACCCAA-3'
CD95-R3 5'-TTCCTTTCTCTTCACTTCC-3'
Данное исследование посвящено изучению особенностей экспрессии генов, кодирующих CD95, CD38, CD25, CD122 и CD132 молекулы, в опухолевых клетках на примере клеток рака толстой кишки линий COLO 205, HCT116, HCT15, SW-620, T84, Ca^-2.
Материалы и методы
Материалом для исследования явились клетки линий Caco-2, COLO 205, SW-620, T84, HCT15, HCT116, хранящиеся в банке клеток Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН. Выделение суммарного пула нуклеиновых кислот из клеток проводили с помощью фенол-хлороформной экстракции.
Реакции обратной транскрипции и ПЦР проводили с использованием специфических праймеров, последовательность которых представлена в табл. 1. Результаты ОТ-ПЦР оценивали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле.
Анализ метилирования CpG-динуклеотидов промоторных областей исследуемых генов осуществляли с использованием рестриктаз HpaII, HhaI, AciI («Fermentas», Латвия), чувствительных к метилированию CpG-динуклеотидов, и последующей ПЦР. Для оценки полноты гидролиза ДНК использовали плазмиду pPicZa2alb, содержащую последовательность гена альбумина человека, которая описана ранее [7]. Последовательность ДНК
гена альбумина имеет сайты узнавания для всех использованных рестриктаз. Праймеры, фланкирующие эту последовательность, имели следующий дизайн: AOX1-F 5-
ACTGGTTCCAATTGACAAGC-3', AOX1-R 5'-CAAATGGCATTCTGACATCC-3'.
Для проведения ПЦР на матрице ДНК, гидролизованной рестриктазами, были подобраны специфичные олигонуклеотидные праймеры (табл. 2). Результаты ПЦР оценивали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Положительный результат ПЦР свидетельствовал о метилировании изучаемого CpG-динуклеотида.
Нуклеотидные последовательности исследуемых генов, полученные в базе данных EMBL/GenBank [8], анализировали с использованием компьютерных программ пакета «DNA STAR» (США).
Результаты и их обсуждение
Шесть клеточных линий рака толстого кишечника исследовали на наличие в клетках экспрессии матричных РНК пяти дифференциро-вочных молекул клеток иммунной системы. Результаты реакций ОТ-ПЦР представлены в табл. 3.
Установлено, что в клеточных линиях рака толстого кишечника наблюдается экспрессия генов CD95, CD38, CD122 и CD132. Матричная РНК CD95 выявлялась во всех исследованных клетках опухолевых линий. Матричная РНК CD38 обнаружена в клетках линий COLO 205,
Таблица 2
Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных для анализа статуса метилирования
промоторных областей генов СБ95, СБ38, СБ25
Название гена Название рестриктазы Позиция в гене цитозина, исследуемого на метилирование с помощью рестриктазы Нуклеотидная последовательность праймеров, использованных для выявления метилирования цитозина
СБ95 НЬаІ -201 СБ95-Ь3 5'-AATAgTgACTTTgAACAgTg-3' СБ95-Я4 5'-TggCATgCTCACTTCAggTg-3'
-367
СБ38 АсіІ + 754 СБ38-Ь3 5 '-AGATGCAGGGTGTCGCTGAC-3' СБ38-Я3 5 '-AACCACTTAAGTGTCCTCTG-3'
+ 761
+ 765
НраІІ + 791
СБ25 НраІІ -313 СБ25-Ь3 5'- CCAGAATCTTGTCAGGACTT-3' СБ25-Я3 5'-GAGAGAAGAGAGTGCTAGGC-3'
+128 СБ25-Ь4 5'-AGAGAGTGCTAGGCAGTTTC-3' СБ25-Я4 5'-CCAGTTGCCGTCAGCCTCTT-3'
НЬаІ +131 СБ25-Ь5 5'-AGAGAGTGCTAGGCAGTTTC-3' СБ25-Я5 5'-CCAGTTGCCGTCAGCCTCTT-3'
НраІІ +198 СБ25-Ь6 5'-CCTTCTGCAGAGAAAGACCT-3' СБ25-Я6 5'-GCCAGGCACCATGATGAACG-3'
Таблица 3
Результаты обнаружения мРНК СБ95, СБ38, СБ25, СБ122, СБ132 в клеточных линиях рака толстого кишечника
Название клеточной линии мРНК СБ95 мРНК СБ38 мРНК СБ25 мРНК СБ122 мРНК СБ132
СОЬО 205 + + - + +
НСТ116 + + - + -
НСТ15 + + - + +
SW-620 + - - - +
Т84 + + - - +
СаСо-2 + - - - +
+ - мРНК обнаружена методом ОТ-ПЦР.
- - мРНК не обнаружена методом ОТ-ПЦР.
Т84, НСТ15 и НСТ116 и не выявлена в клетках линий Сасо-2 и SW-620. В клетках СОЬО 205, НСТ116, НСТ15 показана экспрессия бета-цепи ІЬ-2Я. Матричная РНК гамма-цепи рецептора интерлейкина-2 детектировалась во всех тестируемых линиях клеток, кроме НСТ116. Матричная РНК альфа-цепи рецептора интерлейкина-2 человека не обнаружена в клетках ни одной из шести тестированных линий.
По данным литературы, ген СБ95 активно экспрессируется в клетках нормального эпителия толстой кишки человека, но при злокачественном перерождении его экспрессия часто снижается вплоть до полного отсутствия. При этом было показано, что в клеточных линиях карцином толстого кишечника чувствительность к СБ95-индуцированному апоптозу (и, соответственно, агрессивность опухоли)
связана с уровнем экспрессии мРНК СБ95
[9].
По данным Атласа белков человека [10], экспрессия гена СБ38 в нормальной ткани кишечника человека не обнаруживается. Однако невысокий уровень экспрессии данного белка был зафиксирован в клеточной линии Сасо-2, а с использованием метода ОТ-ПЦР было показано присутствие мРНК СБ38 в клеточных линиях рака толстого кишечника НЯ8348 и НСТ116 [11, 12]. Эти данные, а также данные, полученные в ходе нашего исследования, позволяют сделать вывод о том, что в опухолевых линиях рака толстого кишечника может происходить активация гена СБ38. Однако такое включение гена характерно не для всех клеточных линий, что свидетельствует о вариабельной экспрессии гена в опухоли.
Известно, что повышение уровня экспрессии гена CD25 в неопластической клетке является одним из молекулярных механизмов экспансии опухолевых клонов и ассоциировано с высоким уровнем злокачественности опухоли. Установлено, что высокая экспрессия IL-2Ra в опухолевых клетках приводит к повышению пролиферативной, трансформирующей активности, устойчивости к лекарственным препаратам и коррелирует с плохим прогнозом для пациента
[13].
Возможно, синтез мРНК CD25 антигена в исследованных нами изолированных культурах опухолевых клеток не происходит из-за отсутствия активатора, подобного активатору синтеза CD25 антигена в клетках гемопоэтической системы (Т-клеточный рецептор, интерлейкин-1). Также вероятно, что индукция экспрессии a-цепи рецептора в тестированных типах клеток происходит только после воздействия экзогенного IL-2. Возможным объяснением появления мРНК IL-2RP и IL-2Ry в некоторых культурах опухолевых клеток может быть участие этих молекул в сигнальных путях, инициируемых не IL-2, а другими факторами роста, в частности интерлейкином-15.
В регуляции экспрессии генов важную роль играют процессы метилирования. В рамках данного исследования был проведен анализ метилирования остатков цитозина в составе СрG-динуклеотидов промоторных областей изучаемых генов в клетках тестированных линий. Используемый метод основан на способности метил-чувствительных рестрик-таз расщеплять неметилированную ДНК. На основе компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей промоторных регионов генов CD95, CD38, CD25 были обнаружены сайты связывания метил-чувствительных эндонуклеаз рестрикции (HpaII, HhaI, AciI), расположенные в участках присоединения регуляторов транскрипции. Для проведения ПЦР были подобраны праймеры, ограничивающие нуклеотидные последовательности этих сайтов (табл. 2). В промоторе гена CD95 выбраны два сайта рестриктазы Hha I (позиции -367, -201), находящиеся вблизи участка связывания фактора транскрипции AP-1. В регуляторной области гена CD38 обнаружены сайты рестриктаз Aci I (позиции +754, +761, +765) и Hpa II (позиция + 791), которые располагаются в области присоединения транскрипционного фактора Sp1 и ретиноевой кислоты. Сайты эндонуклеаз рестрикции Hpa
II (позиции -313, +128, +198) и HhaI (позиция +131) обнаружены в промоторной области
гена СБ25 вблизи основного сайта инициации транскрипции гена. Хромосомную ДНК исследуемых клеточных линий обрабатывали рестриктазами и анализировали гидролиз ДНК с использованием ПЦР, как описано в разделе «Материалы и методы».
Метилирование промоторного региона гена СБ95 вблизи участка связывания фактора транскрипции АР-1 варьировало среди изучаемых культур клеток. В образцах клеточных линий Сасо-2 и СОЬО 205 цитозин в позициях -367 и -201 был деметилирован, в то время как в клеточных линиях Б'^620, Т84, НСТ15 и НСТ116 наблюдалось метилирование данных участков. По-видимому, сайты -367 и -201 не играют ключевой роли в работе гена СБ95.
Во всех клеточных линиях установлено метилирование CpG-динуклеотидов гена CD38 в регионе связывания транскрипционного фактора Sp1 и участке присоединения ретиноевой кислоты. Связи между присутствием мРНК СБ38 и метилированием областей связывания транскрипционных факторов в промоторном регионе гена не обнаружено.
Во всех образцах клеточных линий Сасо-2, СОЬО 205, Б'^620, Т84, НСТ15, НСТ116 обнаружено метилирование СрО-динуклеотидов вблизи основного сайта инициации транскрипции гена СБ25. Одновременно во всех этих образцах зафиксировано отсутствие экспрессии мРНК СБ25. Полученные данные позволяют сделать предположение о влиянии метилирования цитозина в позициях -313, +128, +131, +198 относительно точки инициации транскрипции гена СБ25 на его экспрессию в клетках линий рака толстого кишечника.
Таким образом, в перевиваемых клеточных линиях, имеющих происхождение от клеток опухолей толстого кишечника, наблюдалась гетерогенная картина экспрессии генов СБ95, СБ38, СБ25, СБ122, СБ132. Исследование эпигенетической регуляции генов СБ95, СБ38 и СБ25 показало, что только у гена СБ25 метилирование регуляторных элементов строго соответствовало молчанию гена в опухолевой клетке. Вероятно, в регуляцию экспрессии генов СБ95 и СБ38 вовлечены другие механизмы, или метилирование исследуемых СрО-динуклеотидов не оказывает влияния на работу этих генов.
Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2007— 2012 гг.».
Список литературы
1. Carlile G.W., Smith D.H., Wiedmann M. A non-apoptotic role for Fas/FasL in erythropoiesis // FEBS Letters. 2009. V. 583. P. 848-854.
2. Deaglio S., Mehta K., Malavasi F. Human CD38: a (r)evolutionary story of enzymes and receptors // Leukemia Res. 2001. № 25. P. 1-12.
3. Johnston J.A., Kawamura M., Kirken R.A. et al. Phosphorylation and activation of the Jak-3 Janus kinase in response to interleukin-2 // Nature. 1994. № 370. P. 151-153.
4. Bani L., David D., Moreau J-L. et al. // International Immunology. Oxford University Press, 1997. V. 9. №. 4. P. 573-580.
5. Новикова С.В., Алясова А.В., Новиков Д.В. Разработка и апробация метода детекции мРНК альфа-цепи рецептора интерлейкина-2 человека в клетках опухолевых очагов // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. Сер. Биология. 2010. № 2 (2). С. 563-565.
6. Новиков Д.В., Новиков В.В. Новый метод детекции мРНК мембранной и доминирующей растворимой формы Fas-протеина // Матер. II Московского
междунар. конгресса «Биотехнология: Состояние и перспективы развития». М., 2003. С. 71-72.
7. Новиков Д.В., Первушкин П.М., Новиков В.В. Штамм дрожжей Pichia pastoris X-33/2albumin для секреции человеческого альбумина / Патент на изобретение RU № 2306333 С2; заявлено 27.05.2005; опубл. 20.09.2007, Бюл. № 26.
8. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore (дата обращения: 23.04.2011)
9. Tillman D.M., Harwood F.G., Gibson A.A. et al. Expression of genes that regulate Fas signalling and Fas-mediated apoptosis in colon carcinoma cells // Cell Death Differ. 1998. V. 5. P. 450-457.
10. http://www.proteinatlas.org (дата обращения: 02.02.2012)
11. Yang S.L., Tang Y.M., Shen H.Q. et al. Expression of leucocyte cell-surface antigens on colon cancer cell line HR8348 // J. Zhejiang University. Medical sciences. 2004. № 33. P. 118-120.
12. http://www.genecards.org (дата обращения: 02.02.2012)
13. Kuhn D.J., Dou Q.P. The role of interleukin-2 receptor alpha in cancer. Biomarkers. 2008. № 13 (1). Р. 1 -26.
SOME FEATURES OF EXPRESSION OF DIFFERENTIATION-RELATED GENES IN CELL LINES DERIVED FROM PATIENTS WITH COLORECTAL CANCER
S. V. Shumilova, A.D. Perenkov, N.A. Sakharnov, D.V. Novikov, K.I. Eksina, E.N. Filatova,
A. Yu. Baryshnikov, V. V. Novikov
The expression profiles of genes encoding molecules CD25 (IL-2Ra), CD38, CD95 (Fas), CD122 (IL-2RP) and CD132 (IL-2Ry) were investigated in cell lines COLO 205, HCT116, HCT15, SW-620, T84, CaCo-2. The heterogeneity of CD38 and CD95 genes expression and the absence of CD25 mRNA were observed in cells. The study of CD25, CD38 and CD95 genes epigenetic regulation has shown that only in CD25 gene the methylation of regulatory elements is in strict conformity with the gene silence in tumor cells.
Keywords: colon cancer, cell lines, profile of gene expression, CpG-methylation.
