CC BY
90
УДК 616-006.81-085.37:577.21.088
A. V. Smirnova, M. I. Lukashina, I. N. Mikhailova, L. V. Demidov, E. V. Ogorodnikova, L. Yu. Vishnyakova, K. D. Nikitin, A. Yu. Baryshnikov
ROLE OF HLA I AND II CLASS MOLECULES IN LYMPHOCYTE ACTIVATION
N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
ABSTRACT
Recent advances of immunology and molecular biology have led to the development of new approaches in immunotherapy of tumors. It is proposed that cell-based anticancer vaccines are effective in treatment ofmelanoma patients. Recently, we have obtained several human melanoma cell lines differing in expression of HLA I and II classes molecules. The present study has been carried out to survey the immunogenicity of melanoma cell lines. The focus of the research was surface expression oflymphocyte activation markers (CD25, CD71, CD95, HLA-DR) in the mixed lymphocyte-tumor culture reaction. The results have shown that the melanoma cells carrying both classes of HLA molecules possess the highest immunogenicity and can be the most likely candidates for development of antitumor vaccines. Further research is needed for better understanding of mechanisms of antitumor immune response.
Key words: immunotherapy, melanoma, activation markers, HLA I and II classes.
А. В. Смирнова, М. И. Лукашина, И. Н. Михайлова, Л. В. Демидов, Е. В. Огородникова, Л. Ю. Вишнякова, К. Д. Никитин, А. Ю. Барышников
ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ЭКСПРЕССИИ МОЛЕКУЛ HLA I И II КЛАССОВ В АКТИВАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
РЕЗЮМЕ
Успехи иммунологии и молекулярной биологии дают основание рассматривать иммунотерапию как один из перспективных методов лечения злокачественных новообразований. Так, в качестве одного из методов иммунотерапии меланомы были предложены вакцины на основе опухолевых клеток. Ранее в нашем центре были получены линии клеток меланомы человека, различающиеся по экспрессии на их поверхности молекул HLA I и II класса. Целью настоящей работы явилось изучение потенциальной иммуногенности клеток линии меланомы кожи, различающихся по экспрессии HLA I и II классов. Иммуногенность оценивалась в смешанной опухолево-лимфоцитарной реакции по изменению экспрессии поверхностных маркеров активации (CD25, CD71, CD95, HLA-DR). На основании полученных результатов можно предположить, что наиболее высокая иммуногенность характерна для клеточной линии меланомы с фенотипом HLA+/+. Таким образом, для создания стимуляторов иммунного ответа больных меланомой кожи представляется более перспективным использование линии, несущей молекулы обоих классов HLA. Для дальнейшего уточнения механизмов активации противоопухолевого ответа требуются дополнительные исследования.
Ключевые слова: иммунотерапия, меланома, маркеры активации, HLA I и II классов.
ВВЕДЕНИЕ
История попыток активации иммунной системы пациента против опухоли насчитывает уже более 100 лет. Хотя проводимые в настоящее время исследования противоопухолевых вакцин демонстрируют различные клинические эффекты (от регрессии до про-
грессии опухоли), активная иммунотерапия до сих пор не стала терапией выбора. Достижение максимального эффекта во время вакцинотерапии может ограничиваться особенностями опухоли, в частности, ускользанием ее от иммунологического надзора [1012; 15; 16; 18; 20].
Как один из механизмов ускользания от иммунного ответа рассматривается потеря опухолевой клеткой молекул главного комплекса гистосовместимости [19]. У человека эти молекулы принято называть человеческими лейкоцитарными антигенами, или, в англоязычной версии, - human leukocyte antigen, HLA.
Выделяют 2 класса антигенов МНС. К классу I относятся антигены A, B и C, к классу II - антигены DR, DP и DQ. Антигены класса I присутствуют на поверхности всех ядросодержащих клеток и тромбоцитов, антигены класса II - на поверхности B-лимфоцитов, активированных T-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и дендритных клеток.
Т-клетки могут отвечать только на опухолевые антигены, представленные в комплексе с молекулами HLA I или II классов на поверхности антигенпрезен-тирующих клеток (АПК). Подготовка антигена к распознаванию различными классами лимфоцитов начинается с захвата АПК чужеродных белков. Дальнейшая судьба антигена зависит от его происхождения: после внутриклеточного процессинга эндогенные антигены экспрессированы на поверхности АПК в комплексе с молекулами I класса, в то время, как экзогенные - с молекулами HLA II класса. Однако строго это правило не соблюдается. Было обнаружено, что вместе с HLA I может происходить презентация экзогенных антигенов (например, бактериальных), а с HLA II
- эндогенных (например, опухолевых, вирусных), причем такой эффект наблюдается не у всех АПК, а только у дендритных клеток. Механизмы этого явления до конца не ясны.
Ранее нами было показано, что на части перевиваемых клеточных линиях меланомы человека, полученных и стабилизированных в ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, утрачена экспрессия молекул HLA I и/или II классов [4], что может быть механизмом ускользания опухоли от иммунологического надзора. Целью настоящей работы явилось изучение потенциальной иммуногенности клеток линии меланомы кожи, различающихся по экспрессии HLA I и II классов. Им-муногенность оценивалась в смешанной опухолеволимфоцитарной реакции по изменению экспрессии поверхностных маркеров активации (CD25, CD71, CD95, HLA-DR).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы
В работе использованы 3 клеточные линии меланомы, различающиеся по экспрессии HLA I и II класса, полученные от пациентов с диагнозом диссеминированная меланома, проходивших лечение в ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН [4].
Клеточные линии, имеющие монослойный характер роста, культивировали в питательной среде RPMI-1640, содержащей 10 % телячьей эмбриональной сыворотки, L-глутамин (2 mM), 10 mM буфер HEPES Na и гентами-цин (100 мкг/мл) при 37 °С в атмосфере 5 % СО2. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоян-
ным пересевом культуры через 3-4 дня. Для открепления клеток с пластика использовали раствор Версена.
Выделение мононуклеаров периферической крови
Мононуклеары периферической крови (МПК) выделяли в градиенте плотности фиколл-урографин (р=1,077 г/мл) по стандартной методике [3]. Для этого кровь наслаивали на раствор фиколл-урографин и центрифугировали при 1500 об/мин 30 мин при комнатной температуре. Интерфазные кольца собирали и трижды отмывали в чистой среде RPMI-1640. Жизнеспособность клеток оценивали по стандартной методике - включению трипанового синего.
Смешанная опухолево-лимфоцитарная культура (СОЛК)
В реакции в качестве клеток-респондеров использовали МПК здоровых доноров, а в качестве клеток-стимуляторов - опухолевые клетки. Их обрабатывали митомицином С (100 мкг/мл клеточной суспензии для предотвращения пролиферации) в течение 30 мин при 37 °С, затем отмывали в чистой среде RPMI-1640 3 раза. МПК и опухолевые клетки совместно культивировали в полной среде (ПС): среда RPMI-1640, содержащая 5 % человеческой сыворотки IV группы, L-глутамин (324 мкг/мл), пируват натрия (10 mM), аминокислоты, витамины, 10 mM буфер HEPES Na, гентамицин 100 мкг/мл.
МПК (клетки-респондеры) в количестве 5х106 вносили в лунки 6-луночного планшета, где находились опухолевые клетки в количестве 2,5х105 (соотношение опухолевые клетки : МПК = 1:20 соответственно). Инкубацию проводили 5 сут при температуре 37 °С в атмосфере 5 % CO2. Отрицательным контролем служили клетки-респондеры, культивируемые в тех же условиях без опухолевых клеток.
Реакция прямой поверхностной иммунофлюоресценции
Активация лимфоцитов в СОЛК оценивалась по изменению процента лимфоцитов, экспрессирующих маркеры активации с использованием моноклональных антител ООО НПЦ «МедБиоСпектр», Россия (табл. 1).
После культивирования клетки собирали и дважды отмывали в PBS (двусолевой фосфатно-солевой буфер), pH 7,5. 50 мкл клеточной суспензии вносили в пробирки, добавляли по 20 мкл МКА, конъюгированных с флюоресцеинтиоцианатом (FITC) или по 10 мкл МКА, конъюгированных с фикоэритрином (PE), и инкубировали при +4 °C в темноте 30 мин. Клетки дважды отмывали в 1 мл PBS центрифугированием, затем фиксировали 1%-ным раствором формальдегида в PBS.
Результаты СОЛК учитывали в реакции иммунофлюоресценции на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США).
Полученные результаты анализировали с применением пакета статистических программ Statistica 6.0 при помощи непараметрического критерия Колмого-
Таблица 1
Моноклональные антитела, использованные в работе
МКА (клон) Значение показателя в норме Функции, клеточная специфичность
ОБ 25 (ІСО-105) 0-5 % а-цепь рецептора для ИЛ-2. Активированные Т-лимфоциты, В-лимфоциты, моноциты
НЬЛ-БЯ (ІСО-1) 7-15 % Антиген II класса главного комплекса гистосовместимости, экспрессирован на активированных Т-лимфоцитах, дендритных клетках, В-лимфоцитах, моноцитах/макрофагах, клетках эндотелия сосудов
00 5 со ^ ° Я С (ІС 20-50 % лимфоцитов, >40 % моноцитов NAD-гликогидролаза. Усиливает пролиферацию В-лимфоцитов. Незрелые В- и Т-лимфоциты, В-лимфоциты в герминативных центрах, активированные Т-лимфоциты, плазмоциты
СБ 71 (ІСО-92) 0-5 % Рецептор для трансферрина. Все пролиферирующие клетки
СБ95 (ІСО-160) 15-40 % Суперсемейство рецепторов для фактора некроза опухолей (ТОТ). Рецептор для БаБ-лиганда. Индуцирует апоптоз в клетке
ИЛ-2 - интерлейкин-2; NAD - никотинамид динуклеотид
рова-Смирнова. Результаты считались статистически достоверными при уровне значимости р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Активацию мононуклеаров периферической крови в смешанной опухоль-лимфоцитарной культуре (СОЛК) проводили с использованием клеточных линий, экспрессирующих и не экспрессирующих молекулы НЬЛ I и II классов (табл. 2). Результаты экспериментов показали увеличение экспрессии маркеров активации на МПК в ответ на стимуляцию клеточными линиями меланомы.
ИЕЛ-БИ
Молекула ИЬЛ II класса НЬЛ-БЯ представляет собой главный трансплантационный антиген. Считается, что представление антигена в комплексе с молекулой НЬЛ-БЯ определяет развитие иммунного ответа преимущественно по клеточному типу. Имеется связь между уровнем экспрессии ИЬЛ II на поверхности опухолевой клетки и тем, как будет развиваться иммунный ответ. Было показано [16], что течение иммунологической реакции при прививке/трансплантации мышам опухоли, трансфеци-рованной ИЬЛ II класса, развивается по 2 путям:
1) через взаимодействие комплекса НЬЛ-пептид с Т-клеточным рецептором;
2) через повышение экспрессии 0080/86 на АПК и их взаимодействие с СБ28-рецептором Т-клеток.
Уровень экспрессии маркера НЬЛ-БЯ на поверхности МПК контроля составил 10±4 %, в то время, как на МПК, культивированных с исследуемыми линиями, -21±12,8 (с линией ИЬЛ-/-), 23±12,6 (с линией НЬЛ+/-) и 40,1±13,1 (с линией НЬЛ+/+). Достоверного статистического различия уровня экспрессии маркера между МПК,
сокультивированных с линиями, показано не было, но заметна выраженная тенденция к увеличению НЬЛ-БЯ в ответ на стимуляцию (см. табл.2).
Статистический анализ экспрессии НЬЛ-БЯ на МПК по функции распределения по критерию Колмогорова-Смирнова с использованием пакета программ Се^еБ! показал выраженную разницу между гистограммами, соответствующими экспрессии НЬЛ-БЯ на МПК отрицательного контроля, и НЬЛ-БЯ на МПК, культивировавшихся совместно с линией НЬЛ+/+; разница составила Б/б(п) = 23,68 (рис. 1, А и Б). При сравнении функции распределения «полярных» линий была обнаружена незначительная разница в пользу большей иммуногенности линии НЬЛ+/+, что, возможно, объясняется присутствием на опухолевых клетках этой линии молекул НЬЛ I и II классов (см. табл. 2).
Таким образом, мы предполагаем, что потенциально большей иммунногенностью обладает линия, несущая молекулы обоих классов НЬЛ.
еБ71
СБ71 - рецептор трансферрина, исследуемый в связи с гематологическими патологиями, связанными с расстройством системы интернализации железа; кроме того, повышение уровня его экспрессии на пролиферирующих клетках является маркером ранней активации [6; 9].
Процент МПК, экспрессирующих на поверхности маркер активации СБ71, составил: в контроле
11,7±5,0, с линией НЬЛ-/- 16,1±7,0, с линией НЬЛ+/-30,1±6,2 и с линией НЬЛ+/+ 35,1 ±6,9. При анализе данных была показана достоверная разница в уровнях экспрессии СБ71 при сравнении контроля и МПК, сокультивировавшихся с опухолевыми клетками в случае НЬЛ+/- и НЬЛ+/+ (р<0,05). При сравнительном анализе уровня экспрессии СБ71 между линиями
БИОТЕРАПИЯ 11
Рис. 1. Статистический анализ по критерию Колмогорова-Смирнова, маркер HLA-DR:
А - сравнение функций распределений контрольных МПК (2) с МПК, культивированными с опухолевой линией меланомы НЬЛ-/-(1);
Б - сравнение функций распределений контрольных МПК (2) с МПК, культивированными с опухолевой линией меланомы НЬЛ+/+ (1).
По оси абсцисс - канал БЫ;
по оси ординат - процент положительных клеток.
Таблица 2
Экспрессия поверхностных маркеров активации на МПК доноров в ответ на активацию опухолевыми линиями
Антиген- положительные клетки Контроль Mean±StD Линия НЬЛ-/-* Mean±StD Линия НЬЛ+/-* Mean±StD Линия НЬЛ+/+* Mean±StD
НЬЛ-БЯ 10,0±4,0 21,0±12,8 23,0±12,6 40,1±13,1
СБ71 11,7±5,0 16,1±7,0** 30,1±6,2*** 35,1±6,9*****
СБ25 5,5±2,4 10,1 ±2,8*** 16,9±12,8 16,9±6,1***
СБ38 23,5±5,9 27,4±11,0 27,8±13,0 27,7±14,4
СБ95 56,9±22,7 39,5±15,6 26,9±7,5*** 53,2±24,3
НЬЛ-/- линия не экспрессирует молекул НЬЛ ни I, ни II класса; НЬЛ+/- линия не экспрессирует молекул НЬЛ II класса; НЬЛ+/+ линия экспрессирует молекулы НЬЛ и I, и II классов; показана статистически достоверная разница между уровнями экспрессии исследуемого маркера на МПК, сокультивировавшихся с линией НЬЛ-/- и МПК, сокультивировавшихся с линией НЬЛ+/+; показана статистически достоверная разница между уровнями экспрессии исследуемого маркера на МПК, сокультивировавшихся с клеточной линией, и МПК контроля
выявили статистически достоверные различия в случае сокультивирования с «полярными» линиями (НЬЛ-/- и НЬЛ+/+) (р<0,05) (см. табл.2).
Статистический анализ экспрессии СБ71 на МПК по функции распределения по критерию Колмогорова-Смирнова показал невыраженную разницу между гистограммами, соответствующими экспрессии СБ71 на МПК отрицательного контроля, и СБ71 на МПК, культивиро-
вавшихся совместно с опухолевыми линиями. При сравнении функции распределения «полярных» линий была обнаружена разница в пользу большей иммуногенности линии НЬЛ+/+ (Б/б(п) = 12,92) (см. рис. 2, А и Б, табл. 2).
еБ25
Антиген СБ 25 представляет собой а-цепь рецептора интерлейкина-2 (ИЛ-2). ИЛ-2, синтезируемый
Рис. 2. Маркер CD71:
А - сравнение гистограмм распределения МПК, культивированными с опухолевой линией меланомы НЬЛ—/— (2) с МПК, культивированными с опухолевой линией меланомы НЬЛ+/+ (1): по оси абсцисс - антитела CD71FITC; по оси ординат - процент положительных клеток.
Б - статистика по критерию Колмогорова-Смирнова сравнение функций распределений МПК, культивированными с опухолевой линией меланомы НЬЛ-/- (2) с МПК, культивированными с опухолевой линией меланомы НЬЛ+/+ (1):
по оси абсцисс - канал БЬ1;
по оси ординат - процент положительных клеток.
преимущественно Т-лимфоцитами, необходим для пролиферации Т-хелперов, Т-супрессоров, Т-киллеров. Активация Т-лимфоцитов сопровождается синтезом ими ИЛ-2 и увеличением экспрессии CD25, что ведет к дальнейшей ауто- и паракринной стимуляции иммунного ответа [8].
ИЛ-2 способен непосредственно стимулировать В-клетки к синтезу иммуноглобулинов (^М, IgG, ^), усиливает активность и пролиферацию КК-клеток [2].
При анализе изменения уровня экспрессии поверхностного маркера CD25 на МПК были получены следующие данные: контроль 5,5±2,4, линия НЬЛ-/—
10,1±2,8, линия НЬЛ+/— 16,9±12,8, линия НЬЛ+/+ -16,9±6,1. Достоверные различия по сравнению с контролем выявляются при сокультивировании МПК с линиями НЬЛ-/- и НЬЛ+/+ (р<0,05) (см. табл.2).
Статистический анализ экспрессии CD25 на МПК по функции распределения по критерию Колмогорова-Смирнова выявил не выраженную разницу между гистограммами, соответствующими экспрессии CD25 на МПК отрицательного контроля и CD25 на МПК, культивировавшихся совместно с опухолевыми линиями.
При сравнении функции распределения «полярных» линий не было обнаружено значительной разницы в пользу большей иммуногенности какой-либо из линий.
ЄБ38
Поверхностная молекула CD38 представляет собой NAD-гликогидролазу [13], экспрессирующуюся
на активированных Т- и В-лимфоцитах и на 80 % покоящихся КК-клеток [6]. Кроме того, молекула постоянно экспрессируется на зрелых плазмоцитах и покоящихся моноцитах. По литературным данным, экспрессия этого маркера может повышаться под действием провоспалительных цитокинов. Она характеризуется как молекула-преобразователь/трансдуктор активационного и пролиферативного сигналов, улучшает процесс адгезии к эндотелию сосудов через лиганд CD31 [14].
Процент МПК, положительных по экспрессии маркера CD38, в группе контроля составил 23,5±5,9, экспериментальных группах НЬЛ-/-, НЬЛ+/- НЬЛ+/+ составил 27,4±11,0; 27±13; 27,7±14,4 соответственно. Достоверность не была показана ни для одной из групп (см. табл.2).
ЄБ95 (Fas/Apo-1)
Данный антиген является рецептором клеточной поверхности, относящимся к семейству «рецепторов смерти». Этот трансмембранный белок экспрессируется в клетках иммунной и других систем организма. Он участвует в развитии иммунной системы, иммунном ответе, клеточном гомеостазе и патогенезе некоторых заболеваний человека. Влияние «рецептора смерти» на клеточную популяцию происходит вследствие его взаимодействия с лигандом FasL. Выделение Fas-лиганда происходит при чрезмерной актива-
ции Т-клеток, при распознавании слишком большого количества антигена [5; 7; 17]. Этот механизм призван предохранять организм от аутоагрессии. На нормальных лимфоцитах людей экспрессия БаБ/ЛРО-1 антигена регулируется интерлейкином-2, интерфероном-у и др. [1]. Важным свойством МКА против антигена БаБ/ЛРО-1 (СБ95) является способность индуцировать апоптоз, но МКА клона ГС0-160 только регистрируют наличие рецептора на поверхности клетки [6].
Относительно механизмов приобретения опухолевыми клетками способности к синтезу БаБЬ нет единого мнения [16].
Экспрессия СБ95 в группе контроля составила 56,9±22,7; в исследуемых группах - 39,5±15,6; 26,9±7,5; 53,2±24,3 (НЬЛ-/-, НЬЛ+/-, НЬЛ+/+ соответственно). Достоверные различия были показаны только при оценке уровня экспрессии клеток, позитивных по СБ95 при сравнении с контролем при сокультивировании с линией НЬЛ+/- (р<0,05) (см. табл. 2).
В процессе культивирования клеток были выявлены особенности жизнедеятельности МПК, культивировавшихся совместно с линией НЬЛ-/-: на 2-е - 4-е сут начиналось активное закрепление МПК на опухолевых клетках и их (МПК) массовая гибель. Мы предположили, что в процессе длительного культивирования линия приобрела способность к синтезу БаБЬ, который является защитной реакцией опухолевых клеток от цитотоксического действия клеток иммунной системы. Было проведено ИЦХ (иммуноцитохимиче-ское исследование) клеток линии НЬЛ-/- для выявления экспрессии БаБЬ данной линией, подтвердившее наше предположение (рис. 3).
ВЫВОДЫ
На основании полученных результатов можно предположить, что наиболее высокая иммуногенность характерна для клеточной линии меланомы с фенотипом НЬЛ+/+. Мы предполагаем, что потенциально более перспективным для создания стимуляторов иммунного ответа больных меланомой кожи будет ис-
Рис. 3. Экспрессия FasL на линии HLA -/-. Увеличение 100 раз
пользование линии, несущей молекулы обоих классов HLA. Для дальнейшего уточнения механизмов активации противоопухолевого ответа требуются дополнительные исследования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Барышников А. Ю., Шишкин Ю. В. Fas\APO-l антиген - молекула, опосредующая апоптоз // Гематология и трансфузиология. - 1995.
- № 6. - С. 40.
2. Лесков В. П., Чередеев А. Н. и др. Клиническая иммунология для врачей - М.: Фармарус Принт, 1997.
3. Лимфоциты. Методы. - Под ред. Дж. Клауса.
- М.: Мир, 1990.
4. Михайлова И. Н., Лукашина М. И., Барышников А. Ю. и др. Клеточные линии меланомы - основа для создания противоопухолевых вакцин // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2005. - С. 37-40.
5. Полосухина Е. Р., Заботина Т. Н., Шишкин Ю. В. и др. Получение и характеристика моноклональных антител IC0-160 против антигена CD95 (Fas\APO-1), опосредующего апоптоз // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1998. - Т. 125, № 6.
6. Тяжелова В. Г. Механизмы активации лимфоцитов периферической крови. - М.: Наука, 2003.
7. Фильченков А. А. Степанов Ю. М. Участие системы Fas/Fas лиганд в регуляции гомеостаза и функционировании клеток иммунной системы // Аллергология и иммунология. - 2002. - Т. 3, № 1. - С. 24-35.
8. Фрейдлин И. С. Паракринные и аутокринные механизмы цитокиновой и иммунорегуляции // Иммунология. - 2001. - № 5. - С. 4-7.
9. Camaschella C. Why do humans need two types of transferring receptor? Lessons from a rare genetic disorder // The hematologica /the hematology journal. -2005. - 90(3). - P. 296-8.
10. Cesana G. S., DeRaffele G. et al. Characterization of CD4+CD25+ regulatory Tcells in patients treated with high-dose interleukin-2 for metastatic melanoma or renal cell carcinoma // 2006. - Vol. 24. - P. 1169-77.
11. Chen L., McGowan P., Ashe S. et al. Tumor immunogenicity determines the effect of B7 costimulation on T cell-mediated tumor immunity // J Exp Med. - 1994.
- 179(2). - P. 523-32.
12. Greten T. F., Jaffe. E. M J. Cancer vaccines // Clin. Oncol. - 1999. - 17. - P. 1047-60.
13. Human C. D. Guide. - www.ebioscience.com
14. Musso T., Delgado S., Franco L. et al. CD 38 expression and functional activities are up-regulated by INF-y on human monocytes and monocytic cell lines // J. leukoc. Biol. - 2001. - Vol. 69. - P. 605-12.
15. Nussenzweig M., Golstein P. Lymphocyte activation and effector functions // Current Opinion in Immunology. - 2000. - Vol.12, No 3. -P. 239-41.
16. Ostrand-Rosrnberg S., Pulaski B. A., Clements V. K. et al. Cell-basrd vaccines for the
stimulation of immunity to metastatic cancer // Immunological Reviews. - 1999. - Vol. 170. - P. 101-14.
17. Ribas A., Butterfield L. H., Economou J. S. Genetic immunotherapy for cancer // The Oncologist. -2000. - 5. - P. 87-98.
18. Smyth M. J., Snook M. B. Perforin-dependent cytolytic responses in beta2-microglobulin-deficient mice
// Cell Immunol. - 1999. - 196(1). - P. 51-9.
19. Squier M. K. Apoptosis in leukocytes // J Leukoc Biol. - 1995. - Vol. 57, No 1. - P. 2-10.
20. Yu Z., Restifo N. P. Cancer vaccines: progress reveals new complexities // J Clin Invest. - 2002. - 110. -P. 289-94.
Поступила 28.11.2006.
