CC BY
23
ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 579.22
А. В. Кобелев, Т. В. Вдовина, Т. В. Багаева ЗАВИСИМОСТЬ БИОСИНТЕЗА ЛЕКТИНОВ ОТ РОСТА СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ
И КОМПОНЕНТОВ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ
Ключевые слова: сульфатредуцирующие бактерии, лектины, динамика, питательная среда, аминокислоты.
С целью повышения продукции экзогенных лектинов сульфатредуцирующими бактериями, были проведены эксперименты, устанавливающие взаимосвязь их биосинтеза культурой Thermodesulfobacterium mobile ВКМ-1128 в зависимости от периода роста популяции клеток и состава питательной среды. Изучение динамики роста и накопления лектинов микроорганизмами показало, что синтез внеклеточных лектинов происходит параллельно росту клеток. Максимальная гемагглютинирующая активность (титр 256 ед.) наблюдалась в период начала стационарной фазы роста популяции (на 3 сутки). Изменение состава питательной среды, включающей замену лактата на этанол, снижение концентрации сульфатов или их частичная замена на нитраты либо на карбонаты, приводило к снижению активности лектинов. Дополнительное внесение в среду культивирования сульфатредуцирующих бактерий аминокислот или пептона в качестве дополнительных источников азота оказывало существенное влияние на активность лектинов. Так, добавление аспарагина и аргинина в среду роста в концентрации 0,5 мг/мл увеличивало активность лектинов в 4 раза, триптофана и треонина - в 2 и 4 раза, соответственно. Внесение пептона в питательную среду вызывало значительное снижение прироста биомассы и резкое падение (в 32раза) активности лектинов по сравнению с контролем.
Keywords: sulfate-reducing bacteria, lectins, dynamics, nutrient medium, amino acids.
In order to increase the production of exogenous lectins sulfate-reducing bacteria, were performed experiments establishing the relationship of their biosynthesis culture Thermodesulfobacterium mobile ECM - 1128, depending on the cell population growth period and the composition of the culture medium. Study the dynamics of growth and accumulation of microorganisms lectins showed that extracellular lectins synthesis occurs in parallel with cell growth. Maximum hemagglutinating activity (titer of 256 units.) Was observed in the beginning of the stationary phase of population growth (on 3th day). Changing the composition of the nutrient medium comprising replacing lactate to ethanol, reduction of sulphate concentration or partial replacement for their nitrates, carbonates, either of the reduction in activity of lectins. Additional introduction to the culture medium sulfate-reducing bacteria amino acids or peptone, as additional nitrogen sources had a significant effect on the activity of lectins. Thus, the addition of asparagine and arginine in the growth medium at a concentration of 0.5 mg / mL, increased activity of lectins in 4 times, and tryptophan and threonine at 2 and 4 times respectively. Adding peptone medium resulted in a significant reduction in biomass growth, and a sharp drop in activity of 32 times compared to the control lectins.
Введение
В настоящий момент возрос значительный интерес к лектинам различных групп микроорганизмов, в том числе сульфатредуцирующих бактерий, поскольку установлено, что у пациентов с язвенным колитом, наблюдался высокий уровень данных бактерий. Кроме того, сульфатредуцирующие бактерии кишечника человека, влияя на увеличение продукции сероводорода, опосредовано снижают выработку бутирата, а также потентируют метаболическую пролиферацию [1,2]. Лектины микроорганизмов исследуются в связи с их адгезионной способностью, с участием в регуляции межклеточных взаимодействий между бактериальными клетками, в системе бактерия-хозяин [3]. Однако, исследований, посвященных физиологическим особенностям синтеза лектинов микроорганизмами, не много и они касаются, в основном, патогенной микрофлоры [4,5,6]. Так, была установлена взаимосвязь между ростом патогенных бактерий и образованием ими токсичных для животных и человека лектинов. Показано, что бактериальные лектины условно патогенного микроорганизма Pseudomonas aeruginosa принимают участие в регуляции процессов роста и деления клеток [4,6,7]. Кроме того, микробные
культуры одного и того же вида в зависимости от стадии роста популяции могут продуцировать различные лектины [4].
Ранее в наших исследованиях была показана способность штамма Thermodesulfobacterium mobile ВКМ - 1128 к синтезу внеклеточного лектина. Его гемагглютинирующая активность была в 2 раза выше по сравнению с другими штаммами сульфатредуцирующих бактерий [8]. Дальнейшая очистка лектина и изучение ряда его физико-химических свойств, показали, что он отличается от ранее полученных лектинов других микроорганизмов, однако вопрос о взаимосвязи роста Thermodesulfobacterium mobile ВКМ - 1128 и синтеза ими активных лектинов, оставался открытым [9].
Целью данной работы было изучение кинетики биосинтеза и повышения активности лектинов сульфатредуцирующих бактерий в зависимости от роста клеток и компонентов питательной среды.
Материалы и методы
В работе использовался штамм сульфатредуци-рующих бактерий Thermodesulfobacterium mobile ВКМ - 1128, полученный из Всесоюзной коллекции микроорганизмов РАН (г. Пущино) и хранимый в
музее культур кафедры биохимии и биотехнологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета.
Бактерии выращивали на питательной среде, следующего состава (г/л): K2HPO4 - 0,5; NH4CI - 1,0; Na2SO4 -1,0; CaC^*2H20 - 0,1; MgSO4*7H20 -2,0; лактат - 2,0; дрожжевой экстракт - 1,0. В среду вносили также незначительное количество микроэлементов. Общее содержание сульфатов - 3,0 г/л.
Периодическое культивирование проводили без доступа воздуха, в герметично закрытых флаконах объемом 500 мл. Температура культивирования составляла 45oC.
О способности сульфатредуцирующих бактерий расти в условиях эксперимента судили по изменению содержания белка в культуральной жидкости, определенного спектрометрически при 280 нм с использованием микроспектрофотометра NanoDrop™ 2000 / 2000c фирмы Thermo Fisher Scientific. По-вторность опыта трехкратная.
Экзогенные лектины сульфатредуцирующих бактерий получали после двукратного центрифугирования при 8000 g, в течение 10 минут, а затем при 15000 g, в течение 30 минут, что позволяло полностью удалить клетки из культуральной жидкости. Дополнительную очистку полученного супернатан-та проводили с помощью 0.45^m Durapore фильтра, имеющего мембрану из поливинилиденфторида (фторопласта) (Merck Millipore, Ltd.).
Активность лектинов определяли реакцией агглютинации с нативными эритроцитами человека 1 группы крови [10]. Нативные эритроциты для реакции гемагглютинации получали по методу Луцика с соавторами [11].
Динамику накопления экзогенных лектинов Thermodesulfobacterium mobile ВКМ - 1128 исследовали с помощью геммаглютинирующей реакции культуральной жидкости в течение 0 - 7 суток роста бактерий.
Для определения влияния субстрата на рост и образование лектинов в питательную среду вносили лактат кальция в концентрации 2 г/л, 3 г/л и этанол (96%) - 2 мл/л.
Для определения влияния конечных акцепторов электронов на рост и активность лектинов в питательной среде снижали концентрацию сульфатов до 1,5 г/л, либо проводили частичную замену сульфатов на нитраты (NaNO3) или карбонаты (MgCO3) в концентрации 1 г/л. Общее содержание сульфатов при внесении данных солей составляло 2,0 г/л.
Влияние аминокислот на активность лектинов изучали внесением в питательную среду - аргинина, аспарагина, треонина, триптофана, а также пептона в концентрациях 0,5 - 1,0 мг/мл.
Результаты
Для определения зависимости биосинтеза лек-тинов от роста сульфатредуцирующих бактерий Thermodesulfobacterium mobile ВКМ - 1128, были проведены опыты по изучению динамики роста
культуры и ее способности к синтезу лектинов (рис. 1-2).
Рис. 1 - Кинетика накопления микробного белка в процессе роста сульфатредуцирующих бактерий Thermodesulfobacterium mobile ВКМ - 1128
Рис. 2 - Кинетика биосинтеза лектинов суль-фатредуцирующими бактериями Thermodesulfobacterium mobile ВКМ - 1128
Результаты исследования показали, что рост культуры наблюдался с первых суток культивирования бактерий, что свидетельствует о начале экспоненциальной фазы роста популяции (рис. 1). В этот период, в культуральной жидкости появлялась гемагглютинирующая активность, которая возрастала по мере увеличения биомассы (рис.2). Максимальная активность лектинов (титр 256±0,15 ед.) наблюдалась на 3 сутки культивирования, в период начала стационарной фазы роста клеток. Концентрация биомассы по белку в этот период составляла 2,5±0,01 мг/мл. Однако, на 4 сутки роста бактерий (конец стационарной фазы роста), когда концентрация биомассы сульфатредуцирующих бактерий оставалась на достаточно высоком уровне (2,5±0,02 мг/мл), наблюдалось уменьшение активности лекти-нов в 2 раза, а затем падение активности до нулевых значений.
Таким образом, можно сказать, что синтез экзогенных лектинов сульфатредуцирующими бактериями связан с молодыми активными клетками культуры, поскольку прямая корреляция между ростом культуры и синтезом экзогенных лектинов наблюдалась только в период экспоненциальной и начала стационарной фазы роста популяции.
Для определения влияния источников углерода на рост сульфатредуцирующих бактерий и активность продуцируемых ими лектинов были проведены исследования с использованием питательных сред, содержащих различные концентрации основ-
ного субстрата - лактата, а также его замены на этанол (табл.1).
Таблица 1 - Влияние субстрата на рост суль-фатредуцирующих бактерий и активность экзогенных лектинов
Субстрат Концентрация (г/л) Титр ГА Белок (мг/мл)
Лактат 256,0± 2,3±
кальция 2,0 0,15 0,01
Лактат 64,0± 2,4±
кальция 3,0 0,10 0,02
16,0± 0,48±
Этанол 1,8 0,081 0,01
Как показали исследования, наиболее активный рост бактерий наблюдался на среде при концентрации лактата кальция 3,0 мг/мл. Однако активность лектинов в данных образцах была в 4 раза меньше, чем при росте культуры на питательной среде при концентрации лактата 2,0 мг/мл. С другой стороны, когда лактат кальция был заменен на этанол, прирост биомассы Thermodesulfobacterium mobile ВКМ - 1128 был значительно ниже, и составлял 0,48±0,01 мг/мл. Тем не менее, активность лектинов сохранялась, но была невысока (титр -16,0±0,081ед).
Таким образом, биосинтез лектинов зависит как от субстрата для роста клеток, так и от скорости роста бактерий. При достаточно высоком содержании субстрата, по-видимому, наблюдается активный рост клеток, при котором значительная часть аминокислот направляется на синтез основных белков клеток, а не на синтез лектинов. Однако, невысокий прирост биомассы, также не способствует накоплению активных лектинов в культуральной жидкости.
Известно, что на рост сульфатредуцирующих бактерий оказывают существенное влияние конечные акцепторы электронов [12]. В наших экспериментах, по влиянию компонентов питательной среды на рост и активность лектинов сульфатредуци-рующих бактерий, мы исследовали влияние различных концентраций сульфатов, и замены их на соли нитратов или карбонатов (табл.2).
Таблица 2 - Влияние конечных акцепторов электронов на рост сульфатредуцирующих бактерий и активность экзогенных лектинов
Акцепторы электронов Концентрация (г/л) Титр ГА Белок (мг/мл)
Сульфаты 3,0 256±0,15 2,5±0,01
Сульфаты 1,5 128±0,081 1,84±0,05
Сульфаты +нитраты 2,0+1,0 64±0,084 1,19±0,01
Сульфаты +карбонаты 2,0+1,0 16±0,1 0,63±0,04
Результаты исследований показали, что снижение концентрации сульфатов в среде культивирова-
ния микроорганизмов в 2 раза приводило к незначительному (в 1,4 раза) уменьшению прироста биомассы. Однако, активность лектинов, в данных условиях роста, снижалась в 2 раза и составляла 128±0,081ед. (таблица 2). Еще более значительное снижение активности лектинов наблюдалось при частичной замене сульфатов на нитраты или карбонаты (в 4 и 16 раз соответственно). Прирост биомассы сульфатредуцирующих бактерий в данных условиях культивирования также снижался (в 2 раза при внесении нитратов и в 4 раза при внесении карбонатов). Эксперименты показали, что уменьшение концентрации сульфатов или частичная их замена на нитраты или карбонаты позволяет влиять на рост клеток, но снижение накопления биомассы сопровождается уменьшением образования лектинов. Внесение дополнительных источников органического азота (аминокислот или пептона) в среду культивирования сульфатредуцирующих бактерий показало, что они по-разному влияют на рост микроорганизмов и образование ими активных лектинов (табл.3).
Таблица 3 - Влияние аминокислот и пептона на рост и активность экзогенных лектинов суль-фатредуцирующих бактерий
Вещества Концентрация (мкг/мл) Титр ГА Белок (мг/мл)
Аргинин 50 1024±0,17 3,17±0,05
100 64±0,07 1,70±0,02
Аспарагин 50 1024±0,21 3,20±0,06
100 32 ± 0,08 1,00±0,01
Треонин 50 512±0,10 2,80±0,03
100 1024±0,23 3,10±0,05
Триптофан 50 1024±0,18 3,30±0,06
100 1024±0,20 3,00±0,04
Пептон 50 16±0,02 0,40±0,01
100 8±0,01 0,28±0,01
Контроль 256±0,15 2,5±0,01
Добавление аминокислот аргинина и аспарагина в питательную среду в концентрации 50 мкг/мл приводило к увеличению прироста биомассы в 1,3 раза, а активности лектинов в 4 раза. Однако концентрация 100 мкг/мл данных аминокислот вызывала снижение роста и падение активности лектинов в 4 и 8 раз соответственно.
Треонин и триптофан при добавлении в среду культивирования в концентрациях 50 - 100 мкг/мл, также способствовали небольшому увеличению биомассы сульфатредуцирующих бактерий и активации лектинов.
Значительное снижение роста и активности лектинов наблюдалось при внесении пептона в среду культивирования бактерий. Можно предположить, что в наших экспериментах, компоненты пептона выступают катаболитным репрессором клеточного метаболизма данных бактерий, что объясняет снижение в 6-9 раз роста клеток и в 16-32 раз активности лектинов по сравнению с контролем.
Заключение
Изучение динамики биосинтеза лектинов суль-фатредуцирующих бактерий в зависимости от роста клеток показало, что максимальная активность лектинов Thermodesulfobacterium mobile ВКМ - 1128 наблюдается на 3 сутки роста бактерий, что соответствует периоду начала стационарной фазы роста популяции. Интересным является факт, что рост активности лектинов происходит параллельно приросту биомассы, что свидетельствует о том, что только активно делящиеся клетки способны к синтезу лектинов.
Замена основного субстрата для роста суль-фатредуцирующих бактерий - лактата на этанол, а также снижение его концентрации в питательной среде, приводило к уменьшению прироста биомассы Thermodesulfobacterium mobile ВКМ - 1128 и значительной потере активности лектинов.
Такая же закономерность наблюдалась и при частичной замене сульфатов, как конечных акцепторов электронов сульфатредуцирующих бактерий, на нитраты или карбонаты. Прирост биомассы Thermodesulfobacterium mobile ВКМ - 1128 в данных условия роста был невысоким, а активность лектинов снижалась в 4-16 раз.
Повышение прироста биомассы и активности лектинов сульфатредуцирующих бактерий наблюдалось только при дополнительном внесении в питательную среду аминокислот аргинина, аспарагина, триптофана и тирозина в концентрации 50 мкг/мл.
Литература
1. Chassaing B., Darfeuillemichaud A. The commensal micro-biota and enteropathogens in the pathogenesis of inflamma-
tory bowel diseases. Gastroenterol 2011; Vol 140 (6). -P.1720.
2. De Vrese M., Schrezenmeir J. Probiotics, prebiotics, and synbiotics. Advances in Biochemical Engineering. Biotechnology 2008; Vol 111.- P. 1-66.
3. Осипенко М.Ф., Скалинская М.И., Размерица А.А. Про-биотики и воспалительные заболевания кишечника. Гастроэнтерология. 2013; № 02. С. 28-31.
4. Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Симоненко И.А. Лектины бактерий. Киев: Наук. Думка, 1992. С.204.
5. Sharon N., Lis H. Lectins. Kluwer Academic Publishers, 2003. P. 440.
6. Sharon N. // J. Biol. Chem. 2007. Vol. 282. № 5. - P. 27532764.
7. Gilboa-Garber N., Avichezer D., Garber N.C. Gly-co_sciences: Status and Perspectives / Eds. Gabius HJ.,Gabius S. Weinheim: Chapman and Hall, 1997. P. 369398.
8. Kobelev A.B., Mukhammadiev R. S., Mukhammadiev R. S., Bagaeva T.B. Screening of sulfate-reducing bacteria according to their ability to synthesize lectins. RJPBCS.2015; Vol 6 (4). - P. 2167- 2174.
9. Kobelev A.B., Bagaeva T.B. Purification and characterization of extracellular lectin extracted from culture liquid Thermodesulfobacterium Mobile ECM - 1128. RJPBCS.2015; Vol 6 (4). - P.2159 - 2166.
10. Поспелов С.В. Лектины представителей рода Эхина-цея (Echinacea Moench).1.Методические аспекты оценки активности. // Полтава: Химия растительного сырья. 2012. № 3. С.143-148.
11. Луцик М.Д., Панасюк Е.Н., Луцик А.Д., 1981. Лектины. // Виша школа. Львов. С. 156.
12. Dev S., Patra A.K., Mukherjee A., Bhattacharya J. Suitability of different growth substrates as source of nitrogen for sulfate reducing bacteria. Biodegradation. 2015. Vol. 26(6). - P.415-430.
© А. В. Кобелев - ассистент каф. ТОМЛП КНИТУ, alexei-ksu@mail.ru; Т. В. Вдовина - к.т.н., доцент каф. ПБТ КНИТУ, tvkirilina@gmail.ru; Т. В. Багаева - д.б.н., проф., каф. биохимии и биотехнологии КФУ, tatbag@rambler.ru.
© A. V. Kobelev - Assistant of the department of Technological Equipment of Medical and Light Industry KNITU, alexei-ksu@mail.ru; T. V. Vdovina - Candidate of technical sciences, Docent of the department of Industrial Biotechnology KNITU, tvkirilina@gmail.ru; Т. V. Bagaeva - Doctor of biological sciences, Professor of the department of Biochemistry and biotechnology KFU, tatbag@rambler.ru.
