CC BY
21
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
иркутским государственный технический университет
ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ ПРИКЛАДНАЯ ХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ
Научный журнал Выпуск № 1 (6)
ИЗДАТЕЛЬСТВО Иркутского государственного технического университета
2014
СОДЕРЖАНИЕ
ОРГАНИЧЕСКИЙ И НЕОРГАНИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ
Раскулова Т.В., Черниговская М.А., Халиуллин А.К. Радикальная сополимери-
зация винилхлорида и дивиниловых эфиров гликолей......................................... 5
Баяндин В.В., Мултуев П.В., Шаглаева Н.С. Модификация поливинилхлорида натриевыми и калиевыми производными гетероароматических и ароматических HN- и HS-кислот............................................................................................. 11
ХИМИЯ И ТЕХНОЛОГИЯ ПРИРОДНОГО И ТЕХНОГЕННОГО СЫРЬЯ
Евстафьев С.Н., Тигунцева Н.П. Биологически активные вещества одуванчика
лекарственного Taraxacum officinale wigg. (обзор)................................................ 18
Гришин А.А., Зорина Н.В., Луцкий В.И. Хитин и хитозан: химия, биологическая
активность, применение................................................................................... 29
Шкетова Л.Е., Селезнев А.Н. Применение биогеотехнологии при извлечении золота из сульфидных углистых руд..................................................................... 34
ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ
Цивилева О.М., Панкратов А.Н., Бычков Н.А., Былинкина Н.Н., Никитина В.Е.
Приемы дифференциации хроматографических свойств экстраклеточных белков
высшего гриба с участием катионов меди (II)...................................................... 43
Перфильева А.И., Рымарева Е.В. Влияние монойодацетата натрия и теплового
шока на дыхание Clavibacter michiganensis ssp. Sepedonicus................................. 51
Годжаев Э.М., Кахраманов К.Ш., Алиева Ш.В., Нагиев А.Б. Квазифрактальная
поверхность чешуи рыб................................................................................... 56
Рогожин В.В. Комплексообразование n-этиламида о-сульфобензоилуксусной кислоты с пероксидазой хрена.......................................................................... 61
Перфильева А.И. Пестициды-ингибиторы митохондрий: механизм действия и
опасность применения..................................................................................... 68
Молокова К.В., Привалова Е.А., Адамович С.Н., Мирсков А.Н., Мирсков Р.Г. Влияние протонных ионных жидкостей на бродильную активность спиртовых дрожжей........................................................................................................ 70
ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ ХИМИИ И ТЕХНОЛОГИИ
Кузнецова О.В. Изучение источников погрешностей фотометрического определения mn в аэрозолях воздуха............................................................................. 74
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ Коляда А.В. Актуальные направления и перспективы развития спортивных напитков на современном этапе спортивной деятельности........................................... 79
Бегунов А.И., Бегунов А.А. Прикладные задачи глобальных технологий.............. 82
Полякова М.С., Пензина Т.А., Горностай Т.А., Осипенко С.Н. Зависимость скорости роста мицелия разных штаммов Piptoporus betulinus (Bull.: Fr) Karst. от температурного и субстратного факторов............................................................... 86
Горностай Т.Г., Полякова М.С., Осипенко С.Н., Пензина Т.А., Боровский Г.Б. Влияние температурного и субстратного факторов на скорость роста Inonotus
rheades, Hericium coralloides, Hypsizygus ulmarius................................................ 90
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ............................................................................... 94
ПРАВИЛА ДЛЯ АВТОРОВ............................................................................... 98
УДК 582.28:57.083
ПРИЕМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЭКСТРАКЛЕТОЧНЫХ БЕЛКОВ ВЫСШЕГО ГРИБА С УЧАСТИЕМ КАТИОНОВ МЕДИ (II)
О.М. Цивилева1, А.Н. Панкратов2, Н.А. Бычков2,
О 1
Н.Н. Былинкина2, В.Е. Никитина1
1Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН,
410049, г. Саратов, проспект Энтузиастов, 13, tsivileva@ibppm.sgu.ru, nikitina@ibppm.sgu.ru
2Саратовский государственный университет им Н.Г. Чернышевского,
410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83, PankratovAN@info.sgu.ru
Установлено избирательное взаимодействие иона меди(Н) с одним из двух внеклеточных лекти-нов Lentinula edodes F-249. Оптимальная концентрация ионов меди(Н) в синтетической среде культивирования L. edodes составляет 1 х 10 3 моль/л и приводит к двукратному повышению удельной внеклеточной лектиновой активности. В соответствии с предложенной и реализованной на примере экзолектинов L. edodes методологией расчета отношения концентраций веществ в образце по данным рентгенофазового анализа с точностью до постоянной величины, культивирование в присутствии меди(Н) позволяет более чем в 18 раз повысить эффективность разделения исследуемых белков путем дифференциации их хроматографических свойств. Ил. 5. Табл. 2. Библиогр. 16 назв.
Ключевые слова: медь(Н); рентгенофазовый анализ; электронная абсорбционная спектроскопия; выделение и очистка белков; культуральная жидкость; Lentinula edodes; окислительный стресс, антиоксидантная защита.
APPROACHES TO DIFFERENTIATION OF CHROMATOGRAPHIC PROPERTIES OF THE HIGHER FUNGUS' EXTRACELLULAR PROTEINS INVOLVING THE COPPER (II) CATIONS
О.М. Tsivileva1, A.N. Pankratov2, ^А. Bychkov2, N.N. Bylinkina2, V.E. Nikitina1
Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, RAS 13, Entuziastov Ave., Saratov, 410049, Russia, tsivileva@ibppm.sgu.ru, nikitina@ibppm.sgu.ru 2N.G. Chernyshevskii Saratov State University
83, Astrakhanskaya St., Saratov, 410012, Russia, PankratovAN@info.sgu.ru
Selective interaction of copper(II) ions with one of the two extracellular lectins of Lentinula edodes F-249 has been ascertained. The optimal concentration of copper(II) ions in the synthetic medium of L. edodes cultivation is 1 х 10 3 mol/l, and leads to two-fold increase in the specific extracellular lectin activity. Methodology of calculating the ratio of substances' concentrations in the probe by the X-ray phase analysis data up to a constant has been proposed and realized exemplified by L. edodes exolectins. According to that, cultivation in the presence of copper(II) provides the 18-fold enhancement of efficiency of proteins separating under study by means of their chromatographic properties differentiation. 5 sources. 2 tables. 16 sources.
Key words: copper(II); X-ray phase analysis; electron absorption spectroscopy; proteins isolation and purification; culture liquid; Lentinula edodes; oxidative stress; antioxidative defense.
ВВЕДЕНИЕ
Хотя медь и является необходимым элементом питания, она вызывает окислительный стресс в результате образования свобод-
ных радикалов в реакциях Габера - Вайса и Фентона [1, 2]. В условиях индуцированного металлом окислительного стресса время жиз-
ни образовавшихся активных форм кислорода и их токсическое действие контролируются системой актиоксидантной защиты клетки, т.е. соответствующими метаболитами [3, 4].
Известно явление взаимозависимости окислительного стресса, цитодифференци-ровки и перехода к репродуктивной стадии развития грибного мицелия, необходимости при этом усиления антиоксидантной защиты (АОЗ) [5]. Базидиомицет Lentinula edodes (Berk.) Pegler, или шиитаке - один из самых популярных культивируемых грибов в мире. Биомасса этого гриба в настоящее время широко используется в качестве защитного и профилактического средства, обладающего высокой биологической активностью [6]. Лек-тины - белки неиммуноглобулиновой природы, способные к специфическому узнаванию и обратимому связыванию с углеводной частью гликоконъюгатов без нарушения ковалентной структуры последних [7] - составляют важный биохимический аспект развития шиитаке [811]. Культура L. edodes, штамм F-249 синтезирует два внеклеточных лектина, L1 и L2, различающихся по составу и физико-химическим свойствам [12].
Ряд соединений, проявляющих себя как антиоксиданты, способны усиливать АОЗ при участии лектинов L. edodes [13]. Интересно выявить результаты взаимодействия лектинов с эффектором противоположного свойства, т.е. способствующим углублению окислительного стресса и активизации тех вторичных метаболитов гриба (мы полагаем, и лектинов), которые принимают участие в развитии последствий этого стресса, в конечном итоге в формировании признаков генеративной стадии развития мицелия. Еще раз в ином аспекте подойти к рассмотрению описанной проблемы помогает, на наш взгляд, изучение взаимодействия меди(П) с лектинами шиитаке.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Культура Lentinula edodes (Berk.) Pegler [Lentinus edodes (Berk.) Singer], штамм F-249, использованный в работе, был получен из коллекции высших базидиальных грибов кафедры микологии и альгологии Московского государственного университета им. Н.В. Ломоносова. При глубинном культивировании L. edodes использовали синтетические среды с источником углерода D-глюкоза (концентрация 300 ммоль/л по углероду); мольное соотношение углерод : азот в среде составляло 15 : 1. Культивирование мицелия проводили в стационарных условиях при температуре 26 °С, в темноте, в течение 14 сут.
Гемагглютинирующую (ГА) активность жидких сред определяли реакцией гемагглю-тинации с самопроизвольным оседанием эритроцитов, используя 2%-ную суспензию трипсинизированных кроличьих эритроцитов в серии последовательных разведений лектина [14]. Титр гемагглютинации (ТГА) выражали как наибольшее разведение раствора, вызывающее агглютинацию эритроцитов.
Внеклеточные лектины (.1 и 12) культуры
1 edodes Р-249 были выделены и очищены методом, разработанным и описанным нами ранее [12].
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В ряду катионов, представленных как последовательность в порядке уменьшения положительного эффекта катионов металлов (II) на активность внеклеточных лектинов шиитаке [15]:
Mg > Ca > ^ > Fe > Mn > Zn = Sn > ^ > N
нас прежде всего заинтересовала медь(П). При использовании в качестве добавки к синтетической среде культивирования I edodes F-249 двухзарядных катионов меди имела место зависимость «лектиновая активность -концентрация катиона», противоположная наблюдаемой для других металлов. Наибольшая активность внеклеточных лектинов проявлялась на среде с максимальным содержанием меди; титр гемагглютинации (ТГА) составил 1024 при возрасте культуры 5 и 2128 сут. И, если до 3 сут выращивания оптимальной является концентрация 6-8 ммоль/л (ТГА составляет 256, по сравнению с ТГА, равным 128, для концентрации 10 ммоль/л С^+), то в течение всего периода культивирования (5-28 сут) ТГА жидкой среды наиболее высок при концентрации 810 ммоль/л С^+. Обсуждаемые выше для других ионов металлов концентрации 1 ммоль/л и
2 ммоль/л в случае способствуют проявлению максимальной для этих концентраций лектиновой активности с ТГА 256 и 512, соответственно, при возрасте культуры 21-28 сут. Можно сформулировать несколько предположений о причинах и последствиях указанной положительной корреляции между лектиновой активностью и концентрацией экзогенной ме-ди(М):
- добавки ионов меди приводят к усилению биосинтеза внеклеточных лектинов I edodes, при этом в неодинаковой степени для 11 и 12. Возможно также, что в присутствии имеет место накопление внеклеточных неактивных по гемагглютинации лектинов
(например, связанных с металлом в комплекс или неактивных из-за токсического действия металла на грибную культуру). В этом случае удельная лектиновая активность (ТГА/белок) не должна возрастать, она сохраняется или даже снижается из-за увеличения массы белка;
- значительно повышается активность экстрацеллюлярных лектинов, а прирост белковой массы «отстает» - происходит в гораздо меньшей степени. Тогда удельная лектиновая активность заметно возрастает. Сопровождаться такой эффект мог бы активным взаимодействием Си2+ с внеклеточными лек-тинами в культуральной жидкости L. edodes. Если бы к тому же ионы меди проявляли «предпочтение» в отношении одного из лектинов, продукция и/или увеличение активности которого стимулируется ионами меди, -это могло бы способствовать дифференциации белков культуральной жидкости (КЖ) и иметь положительные последствия для процесса предварительного разделения компонентов КЖ с целью дальнейшей очистки лектинов. Ниже приводим экспериментальное подтверждение своих предположений.
Более подробное исследование в динамике внеклеточной лектиновой активности шиитаке при выращивании на синтетических средах с разными концентрациями Си2+ (в ин-
тервале концентраций катиона от 2 х 10- до 1 х 10-2 моль/л) проводили, определяя удельную лектиновую активность, достигаемую в КЖ при используемых концентрациях компонентов среды. Наилучший результат получался при концентрации ионов меди(11) в синтетической среде культивирования L. edodes -1 ммоль/л, О-глюкозы - 300 ммоль/л по углероду, L-аспарагина - 20 ммоль/л по азоту. При возрасте глубинной культуры 14 сут. достигалось более чем 8-кратное увеличение удельной лектиновой активности при указанной концентрации Си2+ по сравнению с более низкими концентрациями меди из приведенного выше интервала значений. Результаты иллюстрирует рис. 1. Оптимальная концентрация Си2+ в синтетической среде культивирования L. edodes составляет 1 х 10-3 моль/л, при этом удельная лектиновая активность на 14-е сут. культивирования более чем в 2 раза выше, чем в контрольном эксперименте (кривые 3 и 7, соответственно, на рис. 1).
Далее мы подтвердили, что ион меди (II) образует с лектинами комплексы, отличающиеся по хроматографическим свойствам.
Для получения неочищенных белковых экстрактов использовали культуральную жидкость гриба. Среда культивирования была упарена в 10 раз при температуре 30 оС, далее был добавлен ацетон до соотношения
£ 600
ц. 2
.о н о о
500
400
Ё га
к га m о
300
200
О) Ц
к га
л ц
О)
5 0
100
10 15 20
Возраст культуры, сут
25
1 2 3 -4 •5 «-6 Н—7
30
0
5
Рис. 1. Зависимость удельной лектиновой активности (ТГА/(белок, мкг/мл)) культуральной жидкости L. edodes F-249 с добавкой меди(И) от времени культивирования. Концентрация Cu2+, (моль/л) х104: 1 - 2; 2 - 5; 3 - 10; 4 - 20; 5 - 50; 6 - 100; 7 - 0
А280 = 0.10
Рис. 2. Гель-хроматограмма осажденной фазы в отсутствие добавок Си(11) в среде культивирования
водная среда : ацетон = 2 : 1 по объему. При температуре +4 оС в течение 1-3 сут. Выпадает осадок, содержащий в основном лектин 1 (.1), в супернатанте (надосадочной жидкости) преобладает лектин 2 (12). В течение 1014 сут. осадок претерпевал старение - наблюдался более полный переход лектина 11 в осадок, а 12 - в раствор. Далее осадок и су-пернатант раздельно подвергали хромато-графированию на колонке (наполнитель -Sephadex G-25). Хроматограмма растворенного осадка представлена на рис. 2.
Как видно на хроматограмме (рис. 2), не удалось добиться не только полного разделения, что не удивительно для начальной стадии - отделения белка от низкомолекулярных веществ, но и величина пика мала, то есть в осадке мало белка. Для повышения эффективности разделения далее мы использовали соль меди(П) в качестве добавки к питательной среде - источнику внеклеточных лекти-нов.
К питательной среде (состоящей из О-глюкозы, 5 х 10 моль/л и 1-аспарагина, 1 х 10 моль/л), характеризующейся по нашим данным высокой активностью внеклеточных лектинов I edodes, был добавлен пента-
2
гидрат сульфата меди до концентрации 10 -104 моль/л. Далее спустя 14 сут. выращивания грибной культуры получали фильтрат КЖ и проводили осаждение ацетоном, как упомянуто чуть выше. Более полно произошло осаждение (по количеству полученного осадка), была обнаружена третья фаза примесных соединений меди, нерастворимая в используемых смесях вода - ацетон (2 : 1 по объему). Хроматограммы реакционных смесей (рис. 3) были получены для разных концентраций Cu2+, возрастающих от 2 х 10-4 моль/л до 1 х 10-2 моль/л. Величины максимумов поглощения А280 приведены для идентифицированного по элюируемому объему лектина 2.
В отличие от значительно увеличенной степени осаждения искомого белка (судя по поглощению при 280 нм, в 7,5 раз в случае (б) по сравнению с контролем), картина для су-пернатантов осталась практически неизменной, мало отличаются их гель-хроматограммы (рис. 4).
Продукты разделения (на Sephadex G-25) фильтрата КЖ гриба L. edodes, выращенного в присутствии сульфата меди(И) указанных выше концентраций, осажденного ацетоном и растворенного в воде, анализировали мето-
J
А280 = 0.15
а)
Осадок 1
А280 = 0.75 Осадок 6
V w ^ -
б)
Рис. 3. Гель-хроматограммы осажденной фазы при концентрации добавки Си(11) в среде культивирования, моль/л: а - 2 х 10'4; б - 1 х 102
А280 = 0.25
^ о
V
/1
'чд
I
il
uj чи ^J Ч
I U kjvJ
I _ 1
а) б) в) г) д) е) ж)
Рис. 4. Гель-хроматограммы супернатанта при концентрации добавки Си(11) в среде культивирования, моль/л: а - 2 х10-4; б - 5 х 10-4; в - 1 х 10-3; г - 2 х 10-3; д - 5 х 10-3; е - 1 х 10-2; ж - 0
дом электронной абсорбционной спектроскопии. Данные приведены на рис. 5. Различия спектров начинают проявляться при концен-
2+ 3
трации Си 2 х 10 моль/л и выше, поэтому кривые поглощения для вариантов опыта 2 х х 10-4, 5 х 10-4, 1 х 10-3, 2 х 10-3 моль/л Си2+ практически совпадают.
На всех кривых, в том числе «Ж» (без добавок меди), имеется максимум в области 200 нм. Возможно, это полоса Е1 или Е2 ароматического кольца или результат наложения этих полос.
Меняется интенсивность и положение полосы 270 нм - ароматическое кольцо, находящееся в сопряжении (В-полоса). При переходе к концентрации Си2+ от 0 (рис. 5, Ж) к 1 х х 10-2 моль/л (там же, Е) происходит возрастание интенсивности этой полосы. Вероятно, это обусловлено увеличением количества лектина при возрастании концентрации Си2+ до 2 х 10- моль/л (рис. 5, Г). Смещение перегиба на кривой поглощения из области 270 нм в область 230 нм, имеющее место при дальнейшем повышении концентрации ионов ме-ди(11), слишком велико для неспецифических сольватохромных эффектов. Скорее всего, полоса с длиной волны в максимуме поглощения ~230 нм - это уже не В-, а К-полоса ароматического кольца, то есть некие гете-роатомы (^ О, S), неподеленные электронные пары которых находились в сопряжении с п-системами ароматических колец, координируются с медью(11) и тем самым выключаются
из цепи сопряжения. Происходит химическое взаимодействие, вероятно, комплексообразо-вание с медью(11). В связи с этим можно предположить, что при увеличении концентрации меди до 5 х 10-3 моль/л возрастает количество комплекса меди(11) с лектином (там же, Д). Наконец, концентрация меди(11), составляющая 1 х 10-2 моль/л (там же, Е) оказывается достаточно высокой для связывания значительного количества лектина, что приводит к скачкообразному увеличению содержания указанного комплекса, и кривая «E» отличается от остальных на рис. 5. Полученные данные подтверждают приведенную выше (рис. 1) информацию о том, что оптимальна в отношении удельной лектиновой активности именно миллимолярная концентрация Cu2+, стимулирующая, очевидно, биосинтез лектина без потери его гемагглютинирующих свойств. Избыточная концентрация меди(11) (выше 5 х х 10-3 моль/л) препятствует проявлению лектином этих свойств.
Проведенные эксперименты наводят на мысль, что взаимодействие иона меди(11) с лектинами действительно привело к дифференциации их хроматографических характеристик. Одновременно с параметрами разделения белков при использовании ионов меди(11) в качестве добавки к синтетической питательной среде (рис. 3), изменяется и продукция грибной культурой одного из лектинов (L2), но из-за связывания лектинов медью(11) (рис. 5) с увеличением ее концентрации удельная лек-
Рис. 5. Электронные спектры продуктов разделения (Sephadex 0-25) осажденной фазы при концентрации добавки Си(11) в среде культивирования, моль/л: Г - 2 х 10-3; Д - 5 х 10-3; Е - 1 х 10-2; Ж - 0. По оси абсцисс отложены значения оптической плотности, по оси ординат - длины волн (нм)
тиновая активность (титр/белок) проходит через максимум (рис. 1).
Образование хелатов иона металла свнеклеточными соединениями, часто не-идентифицированными, исследователи связывают с адаптацией микроорганизмов к высоким концентрациям металла. Причем предполагается, что клетки выделяют хелатирую-щие агенты именно при длительном культивировании в присутствии иона металла, когда последний добавлен в период лаг-фазы [16]. Выделение в среду гликопептида, хелати-рующего медь(П), отмечено, например, у Eu-glena gracilis, которая сохраняет нормальную скорость роста даже при высоких концентрациях металла [17].
Насколько дифференцировано взаимодействие L1 и L2 с Cu +, насколько превалирует усиление биосинтеза одного из лектинов
(.2, судя по гель-хроматографическим характеристикам)? Как меняется их массовое соотношение с изменением концентрации соли меди(И) в питательной среде? В пределах возможностей метода ответить на эти вопросы нам помогло осуществление рентгенофа-зового анализа экзолектинов I edodes, полученных осаждением ацетоном из фильтрата культуральной жидкости, в дальнейшем очищенных с помощью колоночной хроматографии (методами, описанными в [12]). Таким образом, были проанализированы 10 образцов, обозначенных как 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11 + + .2, .1, .2, а также образцы D-галактозы и D-глюкозы (основные компоненты углеводной части лектинов). Порядок перечисления образцов отвечает последовательности стадий выделения и очистки.
Образцы 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 получены осаж-
дением ацетоном из фильтрата КЖ в течение 5 сут при 4 °С. В образце 1 не было меди(11), в образцы 2, 3, 4, 5, 6 в питательную среду добавлялось 5 хю4, 1 х 103, 2 х 103, 5 х 103, 1 х 10 моль/л пентагидрата сульфата ме-ди(11). Образец 7 получен в результате отделения образца 1 от низкомолекулярных примесей методом гель-хроматографии на неподвижной фазе 8ерИа<ех С-25.
Образцы И и 12 представляют собой лектины I. вбобвв. Образец И + 12 - промежуточная стадия разделения белков И и £2, когда оба они присутствуют в смеси.
Условия эксперимента: медный катод, сила анодного тока 75-150 А, катодное напряжение 75-150 В.
Рентгенограммы образцов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, И + 12 содержат две группы пиков (табл. 1). Интенсивность пиков первой группы уменьшается от образца 1 к образцу 6, а интенсивность пиков второй возрастает. Первая группа пиков соответствует лектину И, а вторая - 12.
Однозначное отнесение пиков позволило нам развить подход к определению (на примере экзолектинов 1впИпиз вбобвз) отношения концентраций двух веществ на основе данных рентгенофазового анализа.
Высота каждого пика (Н) пропорциональна его интенсивности (/) и концентрации вещества (С): H = КС/, где К - некий коэффициент пропорциональности. Тогда
C =
H щ = KXI1 и2 KI' K2I2H1
Так как сравнение лишь по одному сигналу статистически неправомерно, отношение концентраций следует выразить через параметры многих пиков. Тогда последняя формула приобретает вид:
^L-V У Hm - У Hn Г ~K т2 ■ ¿^ А
C1 m +m n 1 n
где К = К1/К2;
Н - высота пика;
I - его интенсивность.
Верхний индекс (1 или 2) показывает принадлежность пика к тому или иному веществу, а нижний индекс (т или п) - номер пика.
Используя последнее выражение, мы получили результаты, представленные в табл. 2.
Таблица 1
Межплоскостные расстояния и интенсивности пиков для лектинов L1 и L2
Межплоскостное расстояние (А) Интенсивность
(% от максимального пика)
лектин L1
7,500 29
5,906 19
4,874 100
4,720 67
4,484 73
4,374 67
4,077 79
3,520 71
3,209 24
3,132 76
3,048 95
2,747 24
лектин L2
9,408 80
5,791 25
5,022 100
4,796 13
3,604 47
3,401 32
3,158 41
2,894 13
2,374 9
Таблица 2
Соотношения (С2/С1) концентраций лектинов 1-1 и 1-2 с точностью до постоянной К
Образец 1 2 3 4 5 6 L1 + L2
C2/C1 1,00 1,65 2,27 5,18 18,4 14,8 1,33
Определить постоянную K не представляет трудности. Для этого необходимо провести рентгенофазовый анализ синтетической смеси - образца с заданным соотношением лектинов. Корректность развитого подхода подтверждается результатами независимого гель-хроматографического исследования со спектрофотометрическим детектированием.
Для образцов .1, .2, 53 пиков, аналогичных остальным образцам, не получено, из чего следует, что лектины .1 и .2 взаимодействуют друг с другом. Отсутствуют также пики, соответствующие свободным углеводам Р-галактоза и D-глюкоза), то есть углеводы входят в состав кристаллических форм глико-протеинов.
ВЫВОДЫ
На основании проведенных исследований можно заключить, что:
-Ион меди(П) избирательно взаимодействует с одним из двух внеклеточных лектинов Lentinus edodes. В результате двух возможных процессов - усиления биосинтеза лектинов в присутствии меди(П) и/или участия меди(И) в дифференциации белков КЖ на
стадии получения ацетонового осадка белковой природы - в отделенной осаждением части культуральной жидкости значительно увеличивается количество только одного (.2) из лектинов.
-Оптимальная концентрация ионов меди (II) в синтетической среде культивирования I. edodes составляет 1 х 10-3 моль/л, при этом удельная лектиновая активность в 2 раза выше, чем в контрольном эксперименте, а количество не растворимого в ацетоне примесного осадка соединений меди достаточно мало. Более низкие концентрации меди недостаточно активны, а более высокие характеризуются значительным количеством указанного осадка.
-Предложена и реализована, на примере экзолектинов I. edodes, методология расчета отношения концентраций веществ в образце по данным рентгенофазового анализа с точностью до постоянной величины.
-На основании предложенного подхода можно судить о взаимодействии двух экзолек-тинов I. edodes между собой, а также о полноте разделения этих белков на разных стадиях их очистки.
1. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals, and disease // Biochemical Journal. 1984. V. 219, № 1. P. 1-14.
2. Деви С.Р., Прасад М.Н.В. Антиокислительная активность растений Brassica juncea, подвергнутых действию высоких концентраций меди // Физиология растений. 2005. Т. 52, № 2. С. 233-237.
3. Mazhoudi S., Chaoui A., Ghorbal M.H., Ferjani E.E. Response of antioxidant enzymes to excess copper in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) // Plant Science. 1997. V. 127, № 2. P. 129-137.
4. Noctor G., Foyer C.H. Ascorbate and glutathi-one: keeping active oxygen under control // Annual review of plant biology. 1998. V. 49, № 1. P. 249-279.
5. Белозерская Т.А., Гесслер Н.Н. Окислительный стресс и цитодифференцировка у Neurospora crassa // Микробиология. 2006. Т. 75, № 4. С. 497-501.
6. Bisen P.S., Baghel R.K., Sanodiya B.S., Thakur G.S., Prasad G.B.K.S. Lentinus edodes: A Macrofungus with Pharmacological Activities // Current Medicinal Chemistry. 2010. V. 17, №. 22. P. 24192430.
7. Kocourek J., Horejsi V. // Lectins - Biology, Biochemistry, Clinical Biochemistry. V.3. Berlin; New York: Walter de Gruyter, 1983. P. 3-6.
8. Jeune K.H., Moon I.J., Kim M.K., Chung S.R.
КИЙ СПИСОК
Studies on Lectins from Korean Higher Fungi; IV. A Mitogenic Lectin from the Mushroom Lentinus edodes // Planta Medica. 1990. V. 56. P. 592.
9. Wang H.X., Ng T.B., Ooi V.E.C. Studies on Purification of a Lectin from Fruiting Bodies of the Edible Shiitake Mushroom Lentinus edodes // Intern. J. Bio-chem. Cell Biol. 1999. V. 31, № 5. P. 595-599.
10.Цивилева О.М., Никитина В.Е., Гарибова Л.В., Завьялова Л.А., Игнатов В.В. Гемагглю-тинирующая активность Lentinus edodes (Berk.) Sing [Lentinula edodes (Berk.) Pegler] // Микробиология. 2000. Т. 69, № 1. С. 38-44.
11.Tsivileva O.M., Nikitina V.E., Garibova L.V., Ignatov V.V. Lectin activity of Lentinus edodes // International Microbiology. 2001. V. 4, № 1. P. 41-45.
12.Цивилева О.М., Никитина В.Е., Лощинина Е.А. Выделение и характеристика внеклеточных лектинов Lentinus edodes (Berk.) Sing // Биохимия. 2008. Т. 73, № 10. С. 1438-1446.
13.Панкратов А.Н., Цивилева О.М., Древко Б.И., Никитина В.Е. Квантовохимическое исследование и QSAR-свойства ароматических производных 3-селенпентан-диона-1,5: предпосылки взаимодействия с углеводсвязывающими белками // Известия Саратовского университета. Новая серия. 2010. Т. 10. Серия: Химия. Биология. Экология. Вып. 1. С. 7-13.
14.Луцик М.Д., Панасюк Е.Н., Луцик А.Д. Лекти-ны. Львов: Вища школа. Изд-во при Львовск. ун-те,
43, № 3. P. 227-234.
16.Налимова А.А., Попова В.В., Цоглин Л.Н., Пронина Н.А. Влияние меди и цинка на рост Spirulina platensis и аккумуляция клетками тяжелых металлов // Физиология растений. 2005. Т. 52, № 2. С. 259-265.
1981. 156 с.
15.Tsivileva O.M., Pankratov A.N., Nikitina V.E., Garibova L.V. Effect of media components on the mycelial film formation in submerged culture of Lentinus edodes (Shiitake) // Food Technol. Biotechnol. 2005. V.
Поступило в редакцию 15 марта 2014 г.
УДК:579.222
ВЛИЯНИЕ МОНОЙОДАЦЕТАТА НАТРИЯ И ТЕПЛОВОГО ШОКА НА ДЫХАНИЕ CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SSP. SEPEDONICUS
А.И. Перфильева1'2, Е.В. Рымарева1
Иркутский государственный технический университет, 664074, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 83, alla.light@mail.ru 2ФГБУН Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132
Изучали влияние ингибитора гликолиза монойодацетата натрия (МИА) и теплового шока (45 оС, 1 ч) на дыхание фитопатогенной бактерии Clavibacter michiganensis spp. sepedonicus (Cms). Показано угнетение дегидрогеназной активности и поглощения кислорода клетками бактерий после обработки МИА, тепловой шок усиливал этот эффект. Ил. 4. Библиогр. 15 назв.
Ключевые слова: дыхание; дегидрогеназная активность; поглощение кислорода; тепловой шок; монойодацетат натрия; Clavibacter michiganensis spp. sepedonicus.
IODOACETIC ACID SODIUM SALT AND HEAT SHOCK INFLUENCE ON CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SSP. SEPEDONICUS CELLULAR RESPIRATION
A.I. Perfileva1'2, E.V. Rymareva2
Irkutsk State Technical University,
83, Lermontov St., Irkutsk, 664074, Russia, alla.light@mail.ru 2Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, 132, Lermontov St., Irkutsk, 664033, Russia, matmod@sifibr.irk.ru
The effect of glycolysis inhibitor - iodoacetic acid sodium salt (MIA) and heat stress (45 оС, 1 h) on respiration of a phytopathogenic bacterium of Clavibacter michiganensis spp. sepedonicus (Cms) was examined. Dehydrogenase activity and oxygen absorption were reduced after bacterial cells incubation with MIA. Heat stress increased this effect. 4 figures. 15 sources.
Key words: breath; degidrogenase activity; oxygen absorption; heat shock; iodoacetic acid sodium salt; Clavibacter michiganensis spp. sepedonicus.
