CC BY
23«1нновацп в стоматологи», № 3, 2014 ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧНИЙ РОЗД1Л
УДК 577.15.016+616.31:599.323
С. А. Шнайдер, д. мед. н.
Государственное учреждение «Институт стоматологии Национальной академии медицинских наук Украины»
ЗАЩИТНЫЕ АДАПТАЦИОННЫЕ ЭФФЕКТЫ КВЕРЦЕТИНА В УСЛОВИЯХ КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ ПАТОГЕННЫХ ФАКТОРОВ
В опытах на 21 белой крысе-самце 1,5-мес. возраста изучено влияние кверцетина в условиях действия де-лагила, хронического эмоционально-болевого стресса и бесполифенольного рациона. Кверцетин проявил адаптационные, пародонтопротекторные, заместительные свойства, восстанавливая последствия действия комбинации патогенных факторов - делагила и хронического эмоционально-болевого стресса на фоне рациона, лишенного растительных полифенолов.
Ключевые слова: полифенолы, делагил, хронический эмоционально-болевой стресс, бесполифенольный рацион, кверцетин, защитные эффекты.
С. А. Шнайдер
Державна установа «1нститут стоматологи Нацюнально! академи медичних наук Украши»
ЗАХИСН1 АДАПТАЦ1ЙН1 ЕФЕКТИ КВЕРЦЕТИНУ В УМОВАХ КОМБ1НОВАНО1 Д11 ПАТОГЕНИХ ФАКТОР1В
В до^дах на 21 бшому щур^самщ 1,5-мс вку вивчено вплив кверцетину в умовах дИ делагилу, хротчного емоцшно-больового стресу та бесполiфенольного рацiону. Кверцетин виявив адаптацiйнi, пародонто-протекторнi, замiснi властивостi, як вiдтворюють наслiдки дп комбiнацii патогених факторiв - делагилу та хротчного емоцшно-больового стресу на тлi району, позбавленого рослинних полiфенолiв.
Ключовi слова: полiфеноли, делагил, хротчний емоцшно-больовий стрес, бесполiфенольний рацюн, кверцетин, захиснi эфекти.
S. A. Shnaider
State Establishment "The Institute of Stomatology of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine"
THE PROTECTIVE ADAPTIVE EFFECTS OF QUERCETHIN UNDER THE CONDITIONS OF THE COMBINED INFLUENCE OF PATHOGENIC FACTORS
The aim of the investigation. The study of the protective effects of quercethin under the combined influence of toxic agent chloroquine and chronic emotional and pain stress at alimentary deficiency ofpolyphenols.
The materials and the methods. At the experiments with 21 white he-rats of 1.5 months old the influence of quercethin under affection of chloroquine, chronic emotional and pain stress and polyphenol-free diet was studied.
The findings. The obtained data speak of the considerable pathogenic influence of the investigated factors -prooxidant toxic agent chloroquine and chronic emotional and pain stress and polyphenol-free diet - upon oral mucous membrane and osseous tissue of rat's periodontium. Quercethin is the most widely spread nutrition polyphenol, had stress-protective effect, expressed by the normalizing of cellular content of periphery blood; decrease in frequency of affection and growth of the thickness of stomachic mucous membrane of rats. Periodontoprotective antioxidant characteristics of quercethin have displayed by the considerable reduction of the content of peroxide products and activation of the enzymes of glutathione metabolism in oral mucous membrane; in periodontal osseous tissue - by the considerable decrease of osteoresorptive processes and strengthening of antioxidant protection.
In whole, quercethin has shown the expressed adaptive effect, pointing at the considerable value of polyphenol compounds in the provision of periodontal tissues with resistance to the pathogenic effect of harmful factors.
Key words: polyphenols, chloroquine, chronic emotional and pain stress, polyphenol-free diet, quercethin, protective effects.
© Шнайдер С. А., 2014.
«1нновацп в стоматологи», № 3, 2013
Возникновение стоматологической патологии зависит от уровня общей и местной резистентности организма к локальным (микрофлора) и системным (стресс, токсиканты и др.) факторам. К таким заболеваниям в полной мере можно отнести воспалительные заболевания па-родонта.
Эпителий слизистой оболочки полости рта (СОПР) относится к тканям высокой пролифера-тивной активности, нарушения постоянного обновления которых составляют начальное звено его патологии. В этой связи в качестве комплекса патогенных воздействий избраны политропный токсикант-прооксидант делагил и эмоционально -болевой стресс (ЭБС), индуцирующий активацию процессов неферментативного перекисного окисления липидов (ПОЛ).
Поиск новых адаптогенов и пародонтопро-текторов привел к изучению полифенолов (ПФ)
- флавоноидов, фенольных кислот и их производных в обеспечении оптимального уровня резистентности тканей ротовой полости к патогенным агентам.
Главными функциональными группами, определяющими химическую активность, биохимическое и фармакологическое действие, являются фенольные гидроксилы. Чем большее количество гидроксильных групп у ПФ, тем мощнее он как антиоксидант [1]. Кверцетин - один из самых сильных флавоноидов, содержит 5 ОН-групп, имеет широкий спектр биологической активности. Особенное внимание привлекают его антиоксидантные и антирадикальные свойства, на основе которых разрабатываются высокоэффективные лекарственные средства. Кверцетин локализуется возле поверхностного липидного бислоя мембран, в связи с чем он оказывает более сильный антиоксидантный эффект [2]. Кверцетин, найденный во фруктах и овощах, конъю-гирует in vivo, его производные циркулируют в крови, создавая тем самым общий пул антиокси-дантов в организме [3].
Цель исследования. Изучение защитных эффектов кверцетина при комбинированном влиянии токсиканта делагила и хронического эмоционально-болевого стресса в условиях алиментарной недостаточности полифенолов.
Материалы и методы. В опыт была взята 21 крыса-самец 1,5-мес. возраста. Длительность эксперимента составила 60 дней. 7 крыс интакт-ной группы содержались на стандартном рационе вивария. Крысы 2-й группы (7 особей) - контрольной, получали рацион, лишенный растительных ПФ или бесполифенольный рацион (БПР) [4]. Рацион включал: пшеничную муку в.с.
- 15 %, обезжиренное сухое молоко - 25 %, картофельный крахмал - 35 %, маргарин как источ-
ник жиров - 1,2 %, целлюлоза (фильтровальная бумага) - 5 %, смесь солей - 5 %, дрожжи сухие как источник витаминов группы В - 1,5 %, витамины А - 20 000 ЕД/1кг и D2 - 2000 ЕД на 1 кг корма. Спустя 30 дней от перевода на диету крысы этой группы подвергались комбинированному воздействию делагила («Алкалоида», Венгрия) per os в дозе 5 мг/кг массы тела крыс и стрессу тревожного ожидания, определяемый как эмоционально-болевой стресс (ЭБС) в клетке конструкции Дезидерато [5]. Случайная подача постоянного тока силой 5-6 мА на пол, либо на расположенную на нем платформу, воспроизводила состояние тревожного ожидания болевого воздействия. Такая ситуация воспроизводилась на протяжении 4 часов 3 раза в неделю в течение всего второго месяца содержания крыс на БПР. Таким образом, контрольная группа (К) подвергалась комбинированному патогенному воздействию.
Защитные эффекты кверцетина (гранулы производства Борщаговского ХФЗ, Украина) изучали в этих экспериментальных условиях. Для этого 7 крысам 3-й группы, спустя 30 дней от начала перевода крыс на БПР, ежедневно per os вводили кверцетин с помощью зонда на протяжении 30 дней в дозе 50 мг/кг массы тела крыс.
По завершению эксперимента животных забивали под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг) путем кровопускания из сердца. Предварительно отделив слизистую оболочку полости рта (СОПР), выделяли верхние и нижние челюсти, выделяли печень, селезенку и надпочечники. Влияние патогенных воздействий оценивали морфометрически. Определяли относительную массу селезенки и надпочечников [масса органа (мг)/масса крысы (г)] х 100.
Для оценки ульцерогенного эффекта определяли: 1) толщину слизистой оболочки желудка (СОЖ) по большой кривизне (мм), 2) частоту поражений (в %), 3) множественность поражений (число эрозий и язв).
Прижизненное морфологическое исследование крови крыс из хвостовой вены включало определение числа палочкоядерных (n) и сегмен-тоядерных (с) нейтрофилов (Н) (%), эозинофилов (Э) (Гл), моноцитов (М) (%), лимфоцитов (Лф) (%) и лейкоцитов (Ле) (Гл).
Выделенные челюсти крыс подвергались морфометрическому исследованию [6].
Объектами биохимических исследований служили печень, кость альвеолярного отростка, СОПР. Уровень ПОЛ оценивали по содержанию малонового диальдегида (МДА) тиобарбитуро-вым методом [7]. Состояние физиологической антиоксидантной системы (ФАС) оценивали по
«1нновацп в стоматологи», № 3, 2014
активности глутатион-редуктазы (ГР) [8], глута-тион-пероксидазы (ГПО) [9] и супероксиддисму-тазы (СОД) [10]. Активность кислой фосфатазы определяли методом Bessey et а1. в модификации А.П. Левицкого с соавт. [11].
Результаты экспериментов обрабатывали общепринятыми методами с определением ^ критериев достоверности различий по Стьюденту.
Результаты исследования. Рассмотрим, как повлияло комбинированное патогенное воздействие - пероральное введение токсиканта-прооксиданта делагила, а также хронический ЭБС на фоне алиментарной полифенольной недостаточности на организм крыс и локально - на ткани ротовой полости.
Относительная масса надпочечников в результате комбинированного патогенного воздействия достоверно увеличивалась: 25,0±1,0 мг/100 г (р<0,001) по сравнению с интактной группой: 17,0±1,6 мг/100 г. Относительная масса селезенки в контрольной группе также несколько увеличивалась: 436±27,0 мг/100г (р=0,08) против 353±37,0 мг/100 г в интактной группе.
В слизистой оболочке желудка (СОЖ) экспериментальных животных наблюдали 100 % частоту поражений. При изучении множественности поражений СОЖ число эрозий и язв у крыс контрольной группы достоверно увеличивалось: 1,3±0,4 (р=0,011) и 3,0±1,5 (р=0,06), соответственно, при полном отсутствии поражений на СОЖ интактных крыс. При этом толщина СОЖ (мм) в контрольной группе несколько истончалась: 0,6±0,05 мм (р=0,05) по сравнению с интактной группой: 0,8±0,08 мм.
В табл. 1 представлены результаты прижизненного исследования периферической крови крыс из хвостовой вены. Так, при комбинированном влиянии патогенных факторов количество палочкоядерных нейтрофилов увеличивалось в 2,1 раза (тенденция; р=0,09) по сравнению с ин-тактной группой. В контрольной группе выявлена значительная лейкоцитопения - количество лейкоцитов снижалось в 2,9 раза (р<0,001; табл. 1).
При введении делагила и влиянии хронического ЭБС в условиях БПР содержание МДА значительно увеличивалось: в печени - в 2 раза (р=0,012); в кости альвеолярного отростка - в 1,7 раза (р=0,030); в СОПР - в 4,9 раза (р<0,001), что свидетельствует об интенсификаации перекис-ных процессов на уровне организма и в тканях пародонта (табл. 2). Уровень активности антиок-сидантных ферментов в СОПР достоверно снижался по сравнению с интактной группой: глута-тион-редуктазы - вдвое (р=0,002); СОД - в 1,5 раза (р<0,001). Такое такое значительное снижение активности глутатион-зависимого фермента
вполне объяснимо в связи со снижением под действием делагила в цитозоле клеток восстановленного глутатиона ^^Н).
Комбинация патогенных воздействий при содержании крыс на БПР вызвала существенное увеличение активности провоспалительного фермента - кислой фосфатазы в слизистой оболочке полости рта крыс: 2,66±0,26 мккат/г (р=0,011) относительно интактной группы: 1,74±0,12 мккат/г, что говорит об усилении воспалительных явлений в данном объекте исследования.
Комбинированное патогенное воздействие вызвало усилении резорбции кости альвеолярного отростка верхней челюсти крыс на 21,4 % (от 100 % в интактной группе): 25,0±1,9 % (р=0,07) против 20,6±1,3 %. На нижней челюсти существенного увеличения резорбции выявлено не было: 33,9±1,3 % по сравнению с интактной группой: 31,7±0,95 %.
Таким образом, в результате проведения хронического ЭБС на фоне рациона, лишенного ПФ, у экспериментальных животных наблюдали изменения состава крови; в СОЖ проявился уль-церогенный эффект. Делагил частично инакти-вировал глутатионзависимые ферменты. Комбинированное воздействие делагила и хронического ЭБС активировало процессы ПОЛ на уровне организма, а также локально усиливало воспалительные и перекисные процессы в мягких тканях пародонта; в кости альвеолярного отростка -усиливало остеорезорбцию.
На фоне патогенных воздействий и алиментарной полифенольной недостаточности кверце-тин препятствовал увеличению относительной массы селезенки: 346±8,0 мг/100 г (р=0,008), наблюдавшуюся в контрольной группе: 436±27,0 мг/100 г. Относительная масса надпочечников соответствовала данным интактной группы: 27,0±1,00 мг/100 г против 25,0±1,00 мг/100 массы.
Кверцетин снижал на 28,6 % частоту поражений в слизистой оболочке желудка крыс: 71,4 % против 100 % в контрольной группе. И хоть применение кверцетина не повлияло на изменение количества эрозий и язв в СОЖ крыс, толщина СОЖ (мм) в данной группе достоверно увеличивалась: 0,9±0,10 мм (р1=0,02) против 0,6±0,05 мм в контрольной группе и нормализовалась относительно интактной группы: 0,8±0,08 мм.
Кверцетин предупреждал относительную лейкопению, наблюдавшуюся в условиях комбинации патогенных факторов (табл. 1). Остальные показатели морфологического исследования периферической крови крыс находились на уровне интактных групп.
«Ыновацп в стоматологИ», № 3, 2013
Таблица 1
Влияние кверцетина на показатели морфологиеского исследования крови крыс в условиях комбинированного действия патогенных факторов (М±m; р; р1)
Группы крыс Форменные элементы крови
Нейтрофилы (%) Э (Гл) М (%) Лф (%) Ле (Гл)
п с
Интактная 0,8±0,2 21±2,3 3,2±0,7 6,0±1,5 69±2,8 28,8±1,5
Контрольная (К) 1,7±0,3 р=0,04 23,6±7,0 3,8±0,9 3,0±0,5 р=0,09 68,2±7,4 9,8±0,8 р<0,001
К+Кверцетин 1,8±0,6 27±2,7 2,0±0,7 3,8±0,4 65,8±2,8 21,8±2,1 р1<0,001
Примечание . В табл. 1 и 2 показатель достоверности р рассчитан по сравнению с интактной группой; Р1- относительно контрольной группы (К).
Таблица 2
Влияние кверцетина на содержание МДА и активность антиоксидантных ферментов в тканях крыс в условиях комбинированного действия патогенных факторов (М± m; р; р1)
Содержание МДА (мкмоль/г) Активность ферментов в СОПР
Группы крыс Печень СОПР Кость альвеолярного ГР, ГПО, СОД,
отростка нмоль/с*г нмоль/с*г у.е.
Интактная 108±7,80 25,0±6,90 27,0±3,20 4,68±0,45 40,0±8,13 1,47±0,03
Контрольная (К) 217±34,0 122±17,2 45,0±6,60 2,29±0,32 50,0±6,73 0,97±0,08
р=0,012 р<0,001 р=0,03 р=0,002 р<0,001
К+Кверцетин 119±9,50 - 16,0±7,10 3,89±0,38 87,2±15,1 1,08±0,11
р1=0,02 р1=0,02 р1=0,011 р1=0,04
«1нновацп в стоматологи», № 3, 2014
Под действием кверцетина в печени крыс содержание МДА снижалось на 42,2 % (р1=0,02); в кости альвеолярного отростка - на 64,4 % (р:=0,02; табл. 2). Активность СОД в слизистой оболочке полости рта нормализовалась относительно интактной группы; активность глутатион-пероксидазы и глутатион-редуктазы увеличивалась в 1,7 раза, что говорит об активации ферментов обмена глутатиона в СОПР под действием кверцетина. В то же время активность глута-тион-пероксидазы превышала таковую в интакт-ной группе в 2,2 раза (табл.2)
В результате проведенных исследований были выявлены пародонто-протекторные свойства кверцетина на фоне патогенных воздействий. Резорбция кости альвеолярного отростка нижней челюсти крыс снижалась на 26,0 %: 25,1±1,0 % (р!<0,001) против 33,9±1,3 % в контрольной группе (100 %). Снижение резорбции кости альвеолярного отростка верхней челюсти крыс под действием кверцетина составило: 19,4±0,9 % (р:=0,02) против 25,0±1,9 % в контрольной группе (100 %), т.е. на 22,4 %.
Заключение. Полученные данные свидетельствуют о значительном патогенном влиянии изученных факторов - токсиканта-прооксиданта делагила, хронического ЭБС и бесполифеноль-ного рациона на слизистую оболочку полости рта и костную ткань пародонта крыс. В принятых экспериментальных условиях кверцетин -наиболее распространенный полифенол пищи, оказал стресс-протекторное действие, выразившееся в нормализации клеточного состава периферической крови; снижении частоты повреждений и увеличении толщины слизистой оболочки желудка крыс. Пародонтопротекторные антиок-сидантные свойства кверцетина проявились существенным уменьшением содержания перекис-ных продуктов и активацией ферментов обмена глутатиона в слизистой оболочке полости рта; в костной ткани пародонта - значительным снижением остеорезорбтивных процессов и усил е-нием антиоксидантной защиты.
В целом, кверцетин проявил выраженное адаптационное действие, указывающее на существенное значение полифенольных соединений в обеспечении резистентности тканей пародонта к патогенному действию повреждающих факторов.
Список литературы
1. Rice-Evans C. A. Antioxidant properties of phenolic compounds / C.A. Rice-Evans, N.J. Miller, G. Paganga // Trends in Plant Science. - 1997. - № 2 (4). - Р. 152-159.
2. Hollman P.C. Relative bioavailability of the antioxidant flavonoid quercetin from various foods in man / P.C. Hollman, M.P. John, M.N.Buysman // FEBS Lett. - 1997. - № 418. - P. 152-156.
3. Rice-Evans С. Flavonoid Antioxidants / С. Rice-Evans // Curr.Med.Chem. - 2001. - №8. - P. 797-807.
4. Прохончуков А. А. Руководство по терапевтической стоматологии / А.Прохончуков, Н.Жижина // Под ред. А.И. Евдокимова. - М.: Медицина. - 1967. - 572 с.
5. Desiderato O. Development of gastric ulcers in rats following stress termination / O. Desiderato, J. MacKinnon, H. Hissom // J Comp. Phisiol. Phychol. - 1974. - № 87. - P.208-214.
6. Николаева А. В. Влияние некоторых нейротроп-ных средств на состояние тканей при раздражении верхнего шейного симпатического узла: Автореф. дис. канд. мед. наук / А.В. Николаева - Харьков. - 1967. - 29с.
7. Стальная И. Д. Метод определения диеновых ко-нъюгаций ненасыщенных высших жирных кислот / И. Стальная, Т. Гаришвили // Современные методы биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. - М. - 1977. - С.63-64.
8. Путилина Е. Ф. Определения активности глута-тион-редуктазы / Е.Ф.Путилина // Методы биохимическитй исследований. - М.: Ин. Лит. - 1982. - С.181-183.
9. Пахомова В. А. Способ определения активности глу-татион-пероксидазы в биологических тканях / В. Пахомова, Н. Козлянина, Г. Крюкова // Патент А.С.922637 СССР. МКИ 01 33/48.- Опубл. 25.04.82, Бюл. № 15. - 2 с.
10. Чевари С. Роль супероксиддисмутазы в окислительных процессах клетки и метод определения её в биологическом материале / С. Чевари, И. Чаба, Й.Секей // Лаб. дело. - 1985. - №11. - С. 678-681.
11. Левицкий А. П. Сравнительная оценка трёх методов определения активности фосфатаз слюны человека / А.П. Левицкий, А.И. Марченко, Т.Л. Рыбак // Лаб. дело. -1972. - №10. - С. 624-625.
Поступила 16.06.14
