Защитные эффеты препаратов полифенолов растительного происхождения при экспериментальной патологи пародонта Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

«1нновацп в стоматологи», № 4, 2014 УДК (616.311.2+616.314.7-008.1-02-035.2):599.323.4

А. В. Николаева, к. мед. н.

Государственное учреждение «Институт стоматологии Национальной академии медицинских наук Украины»

ЗАЩИТНЫЕ ЭФФЕТЫ ПРЕПАРАТОВ ПОЛИФЕНОЛОВ

РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИ ПАРОДОНТА

В опытах на 33 белых крысах-самцах 1,5-мес. возраста изучены защитные эффекты препаратов растительных полифенолов - кверцетина и ПФ3 в условиях действия фенигидина и алиментарной полифенольной недостаточности. Препараты ПФ3 и кверцетин оказали нормализующее защитное действие, выразившееся в активации антиоксидантных ферментов в сыворотке крови, и локально - в слизистой оболочке полости рта, причем в большей степени под действием кверцетина. По данным цитоморфологических исследований кверцетин более значительно снижал в эпителиальном пласте глубину эрозий. Положительное влияние препарата ПФ3 на слизистую оболочку полости рта крыс уступало аналогичному действию кверцетина.

Ключевые слова: фенигидин, бесполифенольный рацион, растительные полифенолы, кверцетин, пере-кисное окисление липидов, антиоксидантные ферменты, защитное действие, слизистая оболочка полости рта, цитоморфологические исследования.

Г. В. Школаева

Державна установа «1нститут стоматологи Нацюнально! академи медичних наук Украши»

ЗАХИСН1 ЕФЕКТИ ПРЕПАРАТ1В ПОЛ1ФЕНОЛ1В РОСЛИННОГО ПОХОДЖЕННЯ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНШ ПАТОЛОГП ПАРОДОНТУ

В до^дах на 33 бших щурах-самцях 1,5-мю. вiку вивчет захиснi ефекти препаратiв рослинних полiфе-нолiв - кверцетину i ПФ3 в умовах дп фенiгiдiну та алiментарноi полiфенольноi недостатоностi. Препарати ПФ3 i кверцетин виявили нормализуючу захисну дт, виявлену в активацп антиоксидантних ферментiв в сиро-ватц кровi, а також локально - в слизовш оболонц порожнини рота, причому в бшьшому ступенi пiд впливом кверцетину. За даними цитоморфологiчних до^джень кверцетин бшьш значно знижував в эпiтелiальному пластi глибину ерозп. Позитивний вплив препарату ПФ3 на слизову оболонку порожнини рота щурiв поступа-лося аналогiчнiй ди кверцетину.

Ключовi слова: фенiгiдiн, бесполiфенольнмй ра^он, рослинш полiфеноли, кверцетин, перекисне окис-лення липiдiв, антиоксидантн ферменти, захисна дiя, слизова оболонка порожнини рота, цитоморфологiчнi до^дження.

A. V. Nikolaeva

State Establishment "The Institute of Stomatology of the National academy of medical science of Ukraine"

THE PROTECTIVE EFFECTS OF THE PREPARATIONS WITH VEGETATIVE POLYPHENOLS AT UNDER EXPERIMENTAL PATHOLOGY OF PERIODONTITIS

At the experiments with 33 white he-rats of 1.5 months old the protective effects of the preparations of vegetative polyphenols - quercethin and PP3 at the influence with phenyhydinum and alimentary polyphenol insufficiency were studied.

According to the data of biochemical studies the diet without polyphenols and in greater degree phenyhydinum at alimentary polyphenol insufficiency (system influence), has caused the partial inactivation of certain protective albumen-enzymes in blood serum and locally in oral mucous membrane. Besides, the inductor of gum hyperplasia combined with polyphenol insufficiency has caused resorption of periodontal osseous tissue.

The preparations of PP3 and quercethin have displayed the normalizing protective effect, expressed in activation of antioxidant enzymes in blood serum and locally in oral mucous membrane as well, at that mostly under the influence of quercethin. The preparations of vegetative polyphenols have reduced considerably the depth of erosions in the epithelial layer of oral mucous membrane; the coefficient of epithelial erosions twice as shortened. The degree of vacuolar dystrophy at quercethin influence was less expressed, than at the one with the preparation of PP3.

«iHHoeawï e chwmîihw:u^u», № 3, 2014

So, the positive influence of PP3 on oral mucous membrane of rats was worse than the same affection with quercethin.

Key words: phenyhydinum, polyphenol-free diet, vegetative polyphenols, quercethin, lipids peroxide oxidation, antioxidant enzymes, protective effect, oral mucous membrane, cytomorphological studies.

Известно, что некоторые ксенобиотики лекарственной природы вызывают побочное действие в тканях ротовой полости. Так, среди побочных эффектов антиангинального средства фенигидина (нифедипина) определяют гиперплазию десен.

В последнее время уже не вызывают сомнений данные о биологической активности и лечебных свойствах растительных полифенолов (ПФ), об их облигантой функции как пищевых факторов. В свою очередь, от ПФ пищи может зависеть резистентность тканей ротовой полости к повреждающим агентам, а их недостаточность может приводить к развитию стоматологической патологии.

Цель настоящего исследования. Изучение заместительных защитных эффектов препаратов растительных ПФ - кверцетина и ПФ3 в условиях действия индуктора гиперплазии десны - фе-нигидина и алиментарной полифенольной недостаточности.

Материалы и методы. Белые крысы в количестве 33 особей-самцов были взяты в опыт в 1,5-мес. возрасте. 5 крыс содержались на общем рационе вивария (ДВ); 28 крыс - на бесполифе-нольном рационе (БПР) [1]. Рацион включал: пшеничную муку в.с. - 15 %, обезжиренное сухое молоко - 25 %, картофельный крахмал -35 %, маргарин как источник жиров - 1,2 %, целлюлоза (фильтровальная бумага) - 5 %, смесь солей - 5 %, дрожжи сухие как источник витаминов группы В - 1,5%, витамины А - 20 000 ЕД/1кг и D2 - 2000 ЕД на 1 кг корма.

В 2-й группе 7 крыс содержались на БПР. Крысы 3-ей (7 крыс) получали per os суспензию фенигидина (ФН) (производного 1,4-дигидропиримидина) в дозе 5 мг/кг массы тела крыс (производства ООО «Фармацевтическая компания «Здоровье», Харьков, Украина) и содержались на рационе, лишенном ПФ (БПР+ФН). Крыс 4-й и 5-й групп (по 7 особей) получали, соответственно кверцетин (КВ) (производства Борщаговского ХФЗ, Украина) и препарат ПФ3 (рабочее название). Препарат ПФ листьев пшеницы, проростков овса и надземной части тысячелистника в соотношении 2:1:1, получен по оригинальной лабораторной технологии [2]. Сумма флавоноидов в препарате ПФ3 составляла 19 мг/100 исходного сырья. Действие обоих препаратов изучали при сочетанном влиянии перорального введения ФН и БПР. КВ вводили в дозе 25 мг/кг массы тела крыс, препарат

ПФ3 - по 0,1 мл/100 г массы. Препараты вводили per os 5 раз в неделю в протяжении 70 дней.

По завершению экспериментов крыс выводили из опытов путем тотального кровопускания из сердца, проводимого под наркозом (тиопентал натрия 40 мг/кг). Предварительно отделив десну и слизистую оболочку щеки, вычленяли верхние и нижние челюсти.

Выделенные челюсти крыс подвергались морфометрическому исследованию. Степень резорбции кости альвеолярных отростков нижней и верхней челюстей крыс оценивали методом А.В. Николаевой [2].

Объектами биохимических исследований служили сыворотка крови, печень (50 мг/мл), на-досадочная жидкость гомогенотов десны и слизистой оболочки щеки (25 мг/мл). Надосадочную жидкость получали путем центрифугирования в центрифуге РС-6 в течение 15 минут при 3000 об/мин при температуре +4°С.

Уровень процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по содержанию малонового диальдегида (МДА) тиобарбитуровым методом [3]. Состояние физиологической анти-оксидантной системы (ФАС) оценивали по активности глутатионредуктазы (ГР) [4], глутати-он-пероксидазы (ГПО) [5], каталазы [6].

После выведения животных из опыта у них иссекали фрагменты слизистой оболочки щеки, фиксировали в формалине и заключали в парафин. Срезы толщиной около 10 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, а также обрабатывали по Эйнарсону [7, 8]. Полученные препараты использовали для обзорных морфологических и морфометрических исследований. При малом увеличении микроскопа определяли коэффициент эрозирования эпителия (КЭЭ). Для этого измеряли с помощью окулярного микрометра протяженность участков наружного повреждения эпителиального слоя и определяли, какую долю составляла зона повреждения по отношению к протяженности всего эпителия (в усл. ед.). Это позволяло оценивать состояние эпителия в целом.

Для оценки реакции соединительной ткани собственной пластинки слизистой оболочки щеки, используя стереометрические подходы, рассчитывали коэффициент стеноза сосудов (КСС). Для этого определяли, какую часть (в усл. ед.) составляла площадь стенки сосуда микроцирку-ляторного русла к площади его просвета. Этот показатель объективно характеризовал направ-

«Ыновацп в стоматологи», № 4, 2014

ленность сосудистой реакции и степень её выраженности.

Результаты экспериментов обрабатывали общепринятыми методами с определением t-критериев достоверности различий по Стьюденту.

Результаты исследования. Содержание крыс в продолжении 70 дней на рационе, лишенном алиментарных ПФ, вызвало тенденции увеличения содержания МДА в печени в 2,5 раза.: 42,2±12,5 мкмоль/г по сравнению с интактной группой:17,1±8,22 мкмоль/г, что свидетельствовало об усилении процессов ПОЛ. В сыворотке крови значительно снижалась активность глута-тион-пероксидазы (табл. 1). В слизистой оболочке полости рта бесполифенольный рацион снижал активность данного фермента в 1,8 раза (р=0,02); активность каталазы снижалась в 2,2 раза (р=0,06; табл. 1). В слизистой оболочке полости рта под действием БПР активации ПОЛ выявлено не было.

Пероральное введение крысам фенигидина проводили при содержании крыс на диете, лишенной алиментарных ПФ (БПР). Фенигидин в

условиях БПР усиливал в сыворотке крови пере-кисные процессы - содержание МДА увеличивалось в 3,2 раза: 1,71±0,95 мкмоль/л против 0,53±0,04 мкмоль/л в контрольной групппе (БПР) (тенденции). Активность каталазы и глутатион-редуктазы в данном объекте исследования снижалась в 2,1 (р<0,001) и в 2,5 раза (р=0,001), соответственно (табл. 1). Фенигидин вызвал индуктивное увеличение активности глутатион-пероксидазы, вследствие усиления в сыворотке крови перекисных процессов.

Под действием фенигидина на фоне ПФ недостаточности достоверного увеличения процессов ПОЛ выявлено не было. В то же время в десне в 5,0 раз снижалась активность глутатион-пероксидазы по сравнению с группой БПР (табл. 1). Фенигидин на фоне бесполифенольного рациона усиливал резорбцию кости альвеолярного отростка верхней челюсти крыс на 13,8 % (от 100 % в группе БПР): 24,7±0,5 % против 21,7± 1,2 % в контрольной группе (р=0,04). Изменения резорбции костной ткани пародонта на нижней челюсти носили недостоверный характер.

Таблица 1

Активность антиоксидантных ферментов в сыворотке крови и слизистой оболочке полости рта крыс (М±т; р; рх)

Группы Активность

животных каталаза, ГПО, ГР,

(мкат/л, мкат/г) (мкат/мл, мкат/г) (нкат/мл, нкат/г)

сыворотка крови

ДВ 2,93±0,051 2,67±0,87 0,040±0,0063

БПР 2,77±0,15 0,22±0,14 0,071±0,0085

р=0,016

БПР+ФН 1,34±0,26 1,44±0,52 0,028±0,0038

р<0,001 р=0,04 р=0,001

БПР+ФН+КВ 2,95±0,14 0,91±0,38 0,043±0,0027

р1<0,001

БПР+ФН+ПФ3 1,57±0,41 3,15±0,48 0,029±0,0058

р:=0,04

слизистая оболочка щеки

ДВ 58,2±13,2 61,9±7,32 4,38±0,023

БПР 27,0±6,39 34,8±7,56 3,58±0,57

р=0,06 р=0,02

БПР+ФН 30,9±5,16 - 2,92±0,37

БПР+ФН+КВ 32,4±5,49 31,5±13,8 3,43±0,45

БПР+ФН+ПФ3 35,9±8,14 52,0±12,5 2,78±0,39

десна

ДВ 24,0±1,74 55,0±10,9

БПР 27,0±6,39 83,2±19,6

БПР+ФН 35,6±8,34 16,7±3,22

р=0,008

БПР+ФН+КВ 35,6±7,87 81,2±21,3

р!=0,013

БПР+ФН+ПФ3 37,3±5,88 40,3±1,45

р!<0,001

Примечание : в табл. 1 и 2 показатель достоверности р рассчитан относительно группы ДВ, р! - относительно группы БПР+ФН

«1нновацп в стоматологи», № 3, 2014

Коэффициент эрозии эпителия и коэффициент стеноза сосудов микроциркуляторного русла слизистой оболочки щеки крыс под влиянием препаратов растительных полифенолов (М±т; р; р1)

Таблица 2

Группы животных Эпителий поврежденный Эпителий исследованный (КЭЭ) (усл.ед.) Коэффициент стеноза сосудов (КСС) (усл. ед.)

ДВ 0,06±0,010 3,1±0,32

БПР+ФН 0,24±0,05 1,8±0,42

р=0,018 р=0,05

БПР+ФН+КВ 0,10±0,03 2,9±0,36

р1=0,05 р1=0,10

БПР+ФН+ПФ3 0,12±0,04 р1=0,11 2,7±0,40

На фоне перорального введения фенигидина у крыс с полифенольной недостаточностью были изучены защитные эффекты препаратов растительных ПФ - кверцетина и препарата ПФ3. Исследования показали, что оба препарата в данных экспериментальных условия существенно не повлияли на процессы ПОЛ в слизистой оболочке полости рта крыс; в сыворотке крови кверце-тин несколько снижал содержание МДА по сравнению с контрольной группой (БПР+ФН): 0,53±0,04 мкат/л против 1,71±0,95 мкат/л.

В то же время в сыворотке крови кверцетин в условиях действия фенигидина и бесполифе-нольного рациона существенно увеличивал активность антиоксидантных ферментов: каталазы - в 2,2 раза (р1<0,001), глутатион-редуктазы - в 1,5 раза (р1=0,008). Препарат ПФ3 увеличивал активность глутатион-пероксидазы в 2,2 раза (р1=0,04; табл. 1).

Под влиянием препарата ПФ3 в десне активность глутатион-пероксидазы увеличивалась в 2,4 раза (р1<0,001); кверцетин активировал глу-татион-пероксидазу более значительно - в 4,9 раза (р1=0,013) по сравнению с контрольной группой (табл. 1).

Рассмотрим результаты цитоморфологиче-ских исследований слизистой оболочки щеки по оценке действия препаратов растительных ПФ.

В группе крыс, получавших кверцетин на фоне фенигидина и полифенольной недостаточности (БПР+ФН+КВ), картина реакции тканей слизистой оболочки имела свои особенности. Так, в эпителиальном пласте расслоение и эрозия поверхностных слоев встречались реже, чем в контрольной группе (БПР+ФН), но чаще, чем ув группе интактных крыс (ДВ). Глубина эрозий была меньшей и практически не выходила за пределы ороговевающих слоев. Характерно при этом существенное уменьшение значения КЭЭ (в 2,4 раза; р1=0,05) относительно группы БПР+ФН

(табл. 2). В целом, эти показатели приближались к таковым в группе интактных животных (ДВ).

В ростковой зоне встречались очаги явления вакуолярной дистрофии и проявлялись в меньшей степени, чем в группе БПР+ФН. Патологические формы митозов практически не встречались.

Соединительная ткань собственной пластинки вклинивалась в эпителий относительно широкими и невысокими сосочками. Отечность собственной пластинки проявлялась очагово и за счет этого ее слой выглядел более тонким. Сосуды были расширены меньше, чем в группе БПР+ФН, что подтверждается и тенденцией нормализации КСС (табл. 2).

Общая картина тканей слизистой оболочки полости рта в этой группе внешне соответствовала таковой в группе интактных крыс. Таким образом, можно констатировать, что кверцетин существенно снижал эффект раздражающего действия бесполифенольного рациона и, частично, фенигидина.

При использовании препарата ПФ3 на фоне фенигидина и алиментарной ПФ недостаточности (БПР+ФН+ПФ3), в целом, отмечалась та же динамика изменений в эпителии и в собственной пластинке слизистой, как в группе с кверцетином (БПР+ФН+КВ). В эпителиальном пласте реже, чем в контрольной группе (БПР+ФН) встречались эрозии и расслоение ороговевающих слоев. Эрозии были обычно поверхностными и практически никогда не захватывали всю ороговеваю-щую зону. При этом участки эпителия со следами нарушения структуры соседствовали с внешне практически неизмененными его участками. Подтверждением установленного факта нормализации могут служить изменения коэффициента эрозии эпителия (КЭЭ) (табл. 2). Так, КЭЭ существенно снизился (в 2 раза; р1=0,11) по сравнению с контрольной группой и приблизился к та-

«1нновацп в стоматологи», № 4, 2014

ковому в интактной, что выглядело вполне естественным на фоне лучшей сохранности наружной зоны эпителиального пласта.

В отдельных участках ростковой зоны встречались очаги дистрофически измененных клеток разного размера. Однако, степень развития вакуолярной дистрофии и степень проявлений дистрофических изменений - вакуолизация цитоплазмы, уплотнение и сморщивание ядра, увеличение общих размеров клеток - выражены значительной меньше, чем в контрольной группе (БПР+ФН), но более существенно, чем в группе кверцетина (БПР+ФН+КВ).

Собственная пластинка внешне выглядела менее измененной, чем в контрольной группе. Не было выявлено глубоко вдающихся в эпителий разветвленных сосочков. Сосуды расширены умеренно, стенки их незначительно утолщены, что подтверждается тенденцией приближения КСС к его значениям в интактной группе (ДВ) (табл. 2). Отечность соединительной ткани имела место, но проявлялась очагово и была выражена несколько больше, чем при использовании квер-цетина. Клетки соединительной ткани были распределены сравнительно равномерно, практически не наблюдалось участков инфильтрации лейкоцитами. Картина волокнистых структур мало отличалась от таковой у интактных животных

(ДВ).

Заключение. Таким образом, по данным биохимических исследований рацион, лишенный полифенолов (БПР) и в большей степени фени-гидин при алиментарной полифенольной недостаточности (БПР+ФН) (системное воздействие) вызвали в сыворотке крови и (локально) в слизистой оболочке полости рта частичную инактивацию ряда защитных антиоксидантных белков-ферментов. Кроме того, индуктор гиперплазии десны в сочетании с полифенольной недостаточностью усиливал резорбцию костной ткани па-родонта.

Препараты ПФ3 и кверцетин в данных экспериментальных условиях оказали нормализующее защитное действие, выразившееся в актива-

ции антиоксидантных ферментов как в сыворотке крови, так и локально - в слизистой оболочке полости рта, причем в большей степени под действием кверцетина.

По данным общей микроскопии и сопоставлении цитоморфологических показателей препараты растительных ПФ значительно снижали глубину эрозий в эпителиальном пласте слизистой оболочки полости рта; коэффициент эрозии эпителия снижался вдвое. Степень вакуолярной дистрофии под действием кверцетина была менее выраженной, чем под влиянием препарата ПФ3.

На основании вышеизложенного можно утверждать, что положительное влияние препарата ПФ3 на слизистую оболочку полости рта крыс несколько уступало аналогичному действию кверцетина.

Список литературы

1. Прохончуков А. А. Руководство по терапевтической стоматологии / А.Прохончуков, Н. Жижина // Под ред. А.И. Евдокимова. - М.: Медицина. - 1967. - 572 с.

2. Николаева А. В. Влияние некоторых нейротроп-ных средств на состояние тканей при раздражении верхнего шейного симпатического узла: Автореф. дис. канд. мед. наук / А. Николаева - Харьков. - 1967. - 29с.

3. Стальная И. Д. Метод определения диеновых конъюгаций ненасыщенных высших жирных кислот / И. Стальная, Т. Гаришвили // Современные методы биохимии / Под ред. В. Н. Ореховича. - М. - 1977. - С.63-64.

4. А.С.922637 СССР. МКИ 01 33/48. Способ определения активности глутатион-пероксидазы в биологических тканях / В. Пахомова, Н. Козлянина, Г. Крюкова (СССР). -Опубл. 25.04.82, Бюл. №15. - 2 с.

5. Пахомова В. А. Способ определения активности глу-татион-пероксидазы в биологических тканях / В. Пахомова, Н. Козлянина, Г. Крюкова // Патент А.С.922637 СССР. МКИ 01 33/48.- Опубл. 25.04.82, Бюл. № 15. - 2 с.

6. Королюк М. А. Метод определения активности каталазы / М. Королюк., Д. Иванова, И. Майорова // Лабораторное дело. - 1988. - № 1. - С. 16-18.

7. Меркулов Г. А. Курс патологической техники / Меркулов Г.А. - Л., 1969. - 423 с.

8. Пирс Э. Гистохимия / Пирс Э. - М., ИЛ., 1962. -962 с.

Поступила 21.10.14