Научная статья на тему 'Защитное действие пептида пролил-глицил-пролина (pgp) при анафилактоидной реакции у мышей, вызванной веществом 48/80'

Защитное действие пептида пролил-глицил-пролина (pgp) при анафилактоидной реакции у мышей, вызванной веществом 48/80 Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
45
7
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
АНАФИЛАКТОИДНАЯ РЕАКЦИЯ / РЕГУЛЯТОРНЫЕ ПЕПТИДЫ / ВЕЩЕСТВО 48/80 / COMPOUND 48/80 / ANAPHYLACTOID REACTION / REGULATORY PEPTIDES

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Копылова Галина Николаевна, Бондаренко Надежда Сергеевна, Умарова Белла Анверовна, Самонина Галина Ефимовна, Гусева Александра Александровна

Целью работы было исследование влияния пептида PGP на развитие анафилактоидной реакции у мышей, вызванной введением вещества 48/80, и на секрецию гистамина тучными клетками при их активации веществом 48/80. Анафилактоидную реакцию вызывали внутрибрюшинным введением мышам вещества 48/80. Наблюдение за развитием реакции производилось в течение 1 ч. Отмечали число животных с проявлениями симптомов анафилактоидной реакции, тяжесть этих симптомов, количество погибших животных и время смерти. Для исследований in vitro тучные клетки получали из перитонеальной полости крыс. Секретируемый гистамин определяли по образованию флуоресцирующего комплекса в реакции конденсации с ортофталевым альдегидом. Предварительное введение PGP мышам (за 15 мин до вещества 48/80) снижало процент смертности животных и уменьшало выраженность симптомов анафилактоидной реакции. В опытах in vitro PGP не оказывал влияния на секрецию гистамина тучными клетками при их активации веществом 48/80. Полученные результаты свидетельствуют о наличии в механизме защитного действия PGP при анафилактоидной реакции компонента, не связанного со стабилизацией тучных клеток.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Копылова Галина Николаевна, Бондаренко Надежда Сергеевна, Умарова Белла Анверовна, Самонина Галина Ефимовна, Гусева Александра Александровна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Защитное действие пептида пролил-глицил-пролина (pgp) при анафилактоидной реакции у мышей, вызванной веществом 48/80»

УДК 616.092.19:612.122.93

ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДА

ПРОЛИЛ-ГЛИЦИЛ-ПРОЛИНА (PGP) ПРИ АНАФИЛАКТОИДНОЙ РЕАКЦИИ У МЫШЕЙ, ВЫЗВАННОЙ ВЕЩЕСТВОМ 48/80

Г.Н. Копылова, Н.С. Бондаренко, Б.А. Умарова,

Г.Е. Самонина, А.А. Гусева, Р.Д. Платонова

(кафедра физиологии человека и животных; e-mail: n.s.bondarenko@gmail.com)

Целью работы было исследование влияния пептида PGP на развитие анафилактоидной реакции у мышей, вызванной введением вещества 48/80, и на секрецию гистамина тучными клетками при их активации веществом 48/80.

Анафилактоидную реакцию вызывали внутрибрюшинным введением мышам вещества 48/80. Наблюдение за развитием реакции производилось в течение 1 ч. Отмечали число животных с проявлениями симптомов анафилактоидной реакции, тяжесть этих симптомов, количество погибших животных и время смерти. Для исследований in vitro тучные клетки получали из перитонеальной полости крыс. Секретируемый гистамин определяли по образованию флуоресцирующего комплекса в реакции конденсации с ортофталевым альдегидом.

Предварительное введение PGP мышам (за 15 мин до вещества 48/80) снижало процент смертности животных и уменьшало выраженность симптомов анафилактоидной реакции. В опытах in vitro PGP не оказывал влияния на секрецию гистамина тучными клетками при их активации веществом 48/80.

Полученные результаты свидетельствуют о наличии в механизме защитного действия PGP при анафилактоидной реакции компонента, не связанного со стабилизацией тучных клеток.

Ключевые слова: анафилактоидная реакция, регуляторные пептиды, вещество 48/80.

Анафилаксия — это аномальный ответ организма на определенный антиген, характеризующийся лавинообразным освобождением из тканей и клеток гистамина, в результате чего возникает местная или общая аллергическая реакция. В некоторых случаях развивается анафилактический шок — чрезвычайно сильная общая аллергическая реакция, при которой освободившийся из клеток гистамин вызывает отеки, сужение бронхиол, сердечную недостаточность, что может привести к летальному исходу.

В развитии аллергических реакций большая роль принадлежит воспалению, развивающемуся в ответ на высвобождение из тучных клеток гистамина и других провоспалительных медиаторов.

Ранее нами было показано, что регуляторные пептиды семейства глипролинов обладают противовоспалительными свойствами. PGP и его метаболиты предотвращали или снижали образование экссудата в перитонеальной полости и нарушения сократительной активности лимфатических сосудов при экспериментальном перитоните у крыс [1, 2]. Кроме того, глипролины уменьшали дегрануляцию тучных клеток [3]. Учитывая это, мы предположили, что глипролины могут облегчить течение анафилак-тоидной реакции у мышей, вызванной введением вещества 48/80, которое вызывает массированное высвобождение из тучных клеток гистамина и других провоспалительных медиаторов [4, 5]. Провер-

ка этого предположения и явилась целью настоящей работы.

Материалы и методы

Пептид (PGP) был синтезирован в Институте молекулярной генетики РАН, Россия.

Модель анафилактоидной реакции у мышей [6].

В экспериментах на животных использовали самцов белых лабораторных мышей весом 20—40 г. Анафилактоидную реакцию вызывали внутрибрюшинным введением вещества 48/80 (Sigma).

Мыши были разделены на две группы. Опытной группе животных предварительно, за 15 мин до введения вещества 48/80 (8 мг/кг), внутрибрю-шинно вводили PGP (1 мг/кг). Животным контрольной группы вместо пептида вводили физиологический раствор.

Наблюдения проводили в течение 1 ч, отмечая число животных с проявлениями симптомов ана-филактоидной реакции, тяжесть этих симптомов, количество погибших животных и время смерти.

Метод выделения тучных клеток из перитонеальной полости крыс [7]. Для получения пула тучных клеток использовали самцов белых беспородных крыс весом 230—450 г.

Наркотизированных животных декапитировали и обескровливали. Через разрез в брюшную полость вводили 10 мл раствора буфера Hepes-NaCl

(рН = 7,4) и массировали брюшную стенку в течение l мин. Жидкость из перитонеальной полости собирали и центрифугировали в течение S мин при 800 об/мин (4°). Супернатант удаляли, осадок суспендировали в 2 мл Hepes-NaCl (рН = 7,4). Тучные клетки очищали, нанося на градиент (30 и 40%) фи-колла и центрифугировали l0 мин при l200 об/мин (18°). Вошедшие в слой фиколла тучные клетки собирали и трижды промывали сбалансированным раствором (буфер Hepes-NaCl (рН = 7,4), содержащим S mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, S mM глюкозы и 0,1% BSA). После каждого промывания клетки центрифугировали в течение l0 мин последовательно при l000, 800 и 600 об/мин. Осадок пе-ритонеальных тучных клеток разводили в небольшом количестве (1—2 мл) сбалансированного раствора. Подсчет клеток проводили в камере Горяева.

Метод определения гистамина [S]. Метод основан на реакции конденсации гистамина с орто-фталевым альдегидом, в результате которой образуется флуоресцирующий комплекс. Для активации к 90 мкл тучных клеток добавляли вещество 48/80 (от 2 • 10-s до 2 мг/мл) и смесь инкубировали 10 мин при 37°. Реакцию останавливали, доводя объем проб до 400 мкл охлажденным сбалансированным буфером, и помещали на холод на S мин. Затем пробы центрифугировали l0 мин при l600 об/мин. В су-пернатанте определяли секретируемый гистамин. Для определения остаточного гистамина осадок растворяли в 400 мкл сбалансированного буфера. Тучные клетки разрушали кипячением на водяной бане в течение S мин, центрифугировали l0 мин при 1600 об/мин и отбирали по 100 мкл супернатанта.

Для определения содержания гистамина к 100 мкл пробы последовательно добавляли 20 мкл 1N NaOH, 10 мкл 0,1%-го раствора ортофталевого альдегида и через 4 мин для подкисления 10 мкл 3N HCl. После добавления каждого реактива смесь тщательно перемешивали.

Флуоресценцию измеряли на спектрофлуоримет-ре Thermo Fluoroscan Ascent при 460 нм, возбуждая при 33S нм. Количество секретируемого гистамина вычисляли по формуле: А/(А + В) • 100%, где А — содержание гистамина в супернатанте, В — содержание гистамина в осадке, и выражали в процентах относительно общего содержания в клетках.

Результаты были статистически обработаны с помощью t-критерия Стьюдента и критерия х-квадрат (с поправкой для малых выборок) в компьютерной программе STATISTICA 6. Критической величиной значимости считали 0,0S.

Результаты и обсуждение

В первой серии экспериментов in vivo мышам вводили вещество 48/80 в дозе 8 мг/кг. Развивающаяся у них анафилактоидная реакция сопровождалась проявлением таких симптомов, как корчи, зуд, отек морды, лап, гиперемия хвоста и судо-

80

I 70 60

¡¡50 al 40

3 20 M

10

Рис. 1. Влияние предварительного введения PGP на выживаемость мышей при анафилактоидной реакции, вызванной веществом 48/80. 1 — контроль — введение 0,85% NACl и вещества 48/80 (N = 18); 2 — опыт — введение PGP и вещества 48/80

(N = 18)

рожное дыхание. В 73% случаев животные погибали в течение получаса.

Увеличение дозы вещества 48/80 не приводило к изменению соотношения числа погибших и выживших животных.

Если за 15 мин до введения вещества 48/80 вводили PGP (1 мг/кг), уровень смертности животных достоверно (р = 0,0373) снижался. В этом случае погибли лишь 27% животных и уменьшилась выраженность таких симптомов, как отек морды, лап, гиперемия хвоста и судорожное дыхание. Аналогичный эффект оказывал PGP и при введении мышам вещества 48/80 в дозе 12 мг/кг. На рис. 1 и 2 представлены объединенные данные первой серии экспериментов.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что PGP может облегчать состояние организма и уменьшать смертность экспериментальных животных при анафилактоидных реакциях, вызванных введением экзогенного либератора гистамина — вещества 48/80.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Для того чтобы выяснить, связаны ли защитные свойства PGP со стабилизацией тучных клеток

70

гиперемия отек судорожное

дыхание

Щ-1 □ -2

Рис. 2. Количество животных (%) с проявлением симптомов ана-филактоидной реакции, развивающейся на фоне предварительного введения PGP. 1 — контроль — введение 0,85% NACl и вещества 48/80 (N = 18); 2 — опыт — введение PGP и вещества 48/80 (N = 18)

Рис. 3. Влияние PGP на секрецию гистамина перитонеальны-ми тучными клетками при их активации веществом 48/80. 1 — контроль — сбалансированный буфер + вещество 48/80;

2 — опыт — PGP + вещество 48/80. Цифры под столбиками — количество животных в каждой группе

или обусловлены иными механизмами, мы исследовали in vitro его влияние на секрецию гистамина очищенными перитонеальными тучными клетками крыс при их активации веществом 48/80.

Было показано, что вещество 48/80 в диапазоне исследуемых концентраций 2 ■ 10-6—2 ■ 10-1 мг/мл дозозависимо активирует перитонеальные тучные клетки. Средний уровень спонтанной секреции гистамина в этих опытах составил 18,2%. Предварительная инкубация клеток с PGP не предотвращала их активацию веществом 48/80, секреция гистамина при этом не изменялась (рис. 3).

Поскольку PGP не препятствует высвобождению гистамина при активации тучных клеток веществом 48/80 in vitro, можно полагать, что в механизме его защитного действия in vivo должен присутствовать компонент, не связанный со стабилизацией тучных клеток. Не зависимые от стабилизации тучных клеток механизмы могут включать в себя пеп-

тидную регуляцию тонуса сосудов [9], поддержание проницаемости эндотелия, поддержание адекватного кровотока [10, 11], повышение устойчивости клеток и тканей к окислительному стрессу [12]. Одной из причин гибели животных во время анафилактоидной реакции может быть спазм бронхов, приводящий к остановке дыхания. Однако сведения о действии глипролинов на бронхи отсутствуют.

Таким образом, реализация защитных свойств глипролинов на тканевом и органном уровне, по всей вероятности, осуществляется несколькими механизмами, среди которых существуют как зависимые, так и не зависимые от стабилизации тучных клеток. Существование механизмов, зависимых от стабилизации тучных клеток, подтверждается ранее полученными in vitro данными о способности глип-ролинов препятствовать активации тучных клеток эндогенным активатором синактеном — аналогом АКТГ [13].

Выводы

1. На модели анафилактоидной реакции у мышей, вызванной введением вещества 48/80, выявлены защитные эффекты пептида PGP.

2. В опытах in vitro установлено, что PGP не изменяет секреторный ответ тучных клеток на действие экзогенного активатора — вещества 48/80.

3. Полученные данные позволяют прийти к заключению, что стабилизация тучных клеток не является единственным механизмом, обеспечивающим защитное действие PGP.

* * *

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 09-04-00669а).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Умарова Б.А., Лелекова Т.В., Копылова Т.Н. и др. Роль протекторных эффектов пролинсодержащих пептидов (PGP, PG, GP) в нарушении сократительной функции лимфатических сосудов брыжейки при экспериментальном перитоните у крыс // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 2006. Т. 142. № 9. C. 248—251.

2. Умарова Б.А, Копылова Т.Н., Лелекова Т.В. и др. Пептидная коррекция нарушений микроциркуляции брыжейки крыс при воспалении // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 2007. Т. 144(1). С. 29—32.

3. Умарова Б.А., Копылова Т.Н., Лелекова Т.В. и др. Механизм протекторного действия глипролинов при стрессе и воспалении // Нейрохимия. 2008. Т. 25. № 1—2. С. 119—123.

4. Metcalfe D.D., Baram D., Mekori Y.A. Mast cells // Physiol. rev. 1997. Vol. 77. N 4. P. 1033—1079.

5. Palomaki V.A., Laitinen J.T. The basic secretagogue compound 48/80 activates G proteins indirectly via stimulation of phospholipase D-lysophosphatidic acid receptor axis

and 5-HT1A receptors in rat brain sections // Br. J. Pharmacol. 2006. Vol. 147(6). P. 596—606.

6. Kim S.H., Choi C.H., Kim S.Y. et al. Anti-allergic effects of Artemisia iwayomogi on mast cell-mediated allergy model // Exp. Biol. Med. (Maywood). 2005. Vol. 230(1). P. 82—88.

7. Thon I.L., Uvnas B. Degranulation and histamine release, two consecutive steps in the response of rat mast cells to compound 48/80 // Acta. Physiol. Scand. 1967. Vol. 71(4). P. 303—315.

8. Shore P.A. The chemical determination of histamine. Methods // Biochem. An. Suppl. 1971. P. 89—97.

9. Bakaeva Z.V., Badmaeva K.E, Sergeev I.Y., Samoni-na G.E. Effect of glyprolines on norepinephrine tone of isolated rat aortic rings // Bull. Exp. Biol. Med. 2003. Vol. 135(4). P. 334—336.

10. Жуйкова C.E., Самонина Т.Е. Гомеостаз слизистой оболочки желудка и кровоток. Сообщение 2. Роль ишемии в нарушении гомеостаза слизистой оболоч-

ки желудка // Успехи физиол. наук. 2002. Т. 33. № 1. С. 77—87.

11. Копылова Т.Н., Смирнова Е.А., Санжиева Л.Ц. и др. Глипролины и семакс уменьшают стрессогенные нарушения микроциркуляции в брыжейке крыс // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 2003. Т. 136. № 11. С. 497—499.

12. Safarova E.R., Shram S.I., Zolotarev Y.A., Myaso-edov N.F. Effect of Semax peptide on survival of cultured

rat pheochromocytoma cells during oxidative stress // Bull. Exp. Biol. Med. 2003. Vol. 135(3). P. 268—271.

13. Умарова Б.А., Копылова Т.Н., Смирнова Е.А. и др. Секреторная активность тучных клеток при стрессе — влияние пептидов пролил-глицил-пролина и семакса // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 2003. Т. 136. № 10. С. 371—373.

Поступила в редакцию 28.03.11

THE PROTECTIVE EFFECT OF PROLIL-GLYCIL-PROLINE (PGP) IN COMPOUND 48/80-INDUCED ANAPHYLACTOID REACTION IN MICE

G.N. Kopylova, N.S. Bondarenko, B.A. Umarova, G.E. Samonina, A.A. Guseva, R.D. Platonova

The influences of PGP on compound 48/80-induced anaphylactoid reaction development in mice and on histamine secretion from rat peritoneal mast cells (RPMC) were investigated. Anaphylactoid reaction was induced by intraperitoneal injection of compound 48/80 into mice. The amount of histamine secreted by RPMC was evaluated.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Injection of PGP 15 min before injection of compound 48/80 led to decrease of mortality, and some of anaphylactoid reaction symptoms reduced. PGP had no effect on compound 48/80-in-duced histamine secretion from (RPMC) in vitro.

Key words: anaphylactoid reaction, regulatory peptides, compound 48/80.

Сведения об авторах

Копылова Галина Николаевна — канд. биол. наук, доц. кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-46-04; e-mail: Kopylovagn@list.ru

Бондаренко Надежда Сергеевна — аспирантка кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-14-16; e-mail: n.s.bondarenko@gmail.com

Умарова Белла Анверовна — докт. биол. наук, вед. науч. сотр. кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-14-16; e-mail: bellaum@mail.ru

Самонина Галина Ефимовна — докт. биол. наук, вед. науч. сотр. кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-46-04; e-mail: samonina_ge@mail.ru

Гусева Александра Александровна — канд. биол. наук, доц. кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-46-04; e-mail: agusseva@gmail.com

Платонова Римма Дмитриевна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-46-04; e-mail: rdplatonova@mail.ru

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.