CC BY
15
УДК 616.092.19:612.122.93
ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДА
ПРОЛИЛ-ГЛИЦИЛ-ПРОЛИНА (PGP) ПРИ АНАФИЛАКТОИДНОЙ РЕАКЦИИ У МЫШЕЙ, ВЫЗВАННОЙ ВЕЩЕСТВОМ 48/80
Г.Н. Копылова, Н.С. Бондаренко, Б.А. Умарова,
Г.Е. Самонина, А.А. Гусева, Р.Д. Платонова
(кафедра физиологии человека и животных; e-mail: n.s.bondarenko@gmail.com)
Целью работы было исследование влияния пептида PGP на развитие анафилактоидной реакции у мышей, вызванной введением вещества 48/80, и на секрецию гистамина тучными клетками при их активации веществом 48/80.
Анафилактоидную реакцию вызывали внутрибрюшинным введением мышам вещества 48/80. Наблюдение за развитием реакции производилось в течение 1 ч. Отмечали число животных с проявлениями симптомов анафилактоидной реакции, тяжесть этих симптомов, количество погибших животных и время смерти. Для исследований in vitro тучные клетки получали из перитонеальной полости крыс. Секретируемый гистамин определяли по образованию флуоресцирующего комплекса в реакции конденсации с ортофталевым альдегидом.
Предварительное введение PGP мышам (за 15 мин до вещества 48/80) снижало процент смертности животных и уменьшало выраженность симптомов анафилактоидной реакции. В опытах in vitro PGP не оказывал влияния на секрецию гистамина тучными клетками при их активации веществом 48/80.
Полученные результаты свидетельствуют о наличии в механизме защитного действия PGP при анафилактоидной реакции компонента, не связанного со стабилизацией тучных клеток.
Ключевые слова: анафилактоидная реакция, регуляторные пептиды, вещество 48/80.
Анафилаксия — это аномальный ответ организма на определенный антиген, характеризующийся лавинообразным освобождением из тканей и клеток гистамина, в результате чего возникает местная или общая аллергическая реакция. В некоторых случаях развивается анафилактический шок — чрезвычайно сильная общая аллергическая реакция, при которой освободившийся из клеток гистамин вызывает отеки, сужение бронхиол, сердечную недостаточность, что может привести к летальному исходу.
В развитии аллергических реакций большая роль принадлежит воспалению, развивающемуся в ответ на высвобождение из тучных клеток гистамина и других провоспалительных медиаторов.
Ранее нами было показано, что регуляторные пептиды семейства глипролинов обладают противовоспалительными свойствами. PGP и его метаболиты предотвращали или снижали образование экссудата в перитонеальной полости и нарушения сократительной активности лимфатических сосудов при экспериментальном перитоните у крыс [1, 2]. Кроме того, глипролины уменьшали дегрануляцию тучных клеток [3]. Учитывая это, мы предположили, что глипролины могут облегчить течение анафилак-тоидной реакции у мышей, вызванной введением вещества 48/80, которое вызывает массированное высвобождение из тучных клеток гистамина и других провоспалительных медиаторов [4, 5]. Провер-
ка этого предположения и явилась целью настоящей работы.
Материалы и методы
Пептид (PGP) был синтезирован в Институте молекулярной генетики РАН, Россия.
Модель анафилактоидной реакции у мышей [6].
В экспериментах на животных использовали самцов белых лабораторных мышей весом 20—40 г. Анафилактоидную реакцию вызывали внутрибрюшинным введением вещества 48/80 (Sigma).
Мыши были разделены на две группы. Опытной группе животных предварительно, за 15 мин до введения вещества 48/80 (8 мг/кг), внутрибрю-шинно вводили PGP (1 мг/кг). Животным контрольной группы вместо пептида вводили физиологический раствор.
Наблюдения проводили в течение 1 ч, отмечая число животных с проявлениями симптомов ана-филактоидной реакции, тяжесть этих симптомов, количество погибших животных и время смерти.
Метод выделения тучных клеток из перитонеальной полости крыс [7]. Для получения пула тучных клеток использовали самцов белых беспородных крыс весом 230—450 г.
Наркотизированных животных декапитировали и обескровливали. Через разрез в брюшную полость вводили 10 мл раствора буфера Hepes-NaCl
(рН = 7,4) и массировали брюшную стенку в течение l мин. Жидкость из перитонеальной полости собирали и центрифугировали в течение S мин при 800 об/мин (4°). Супернатант удаляли, осадок суспендировали в 2 мл Hepes-NaCl (рН = 7,4). Тучные клетки очищали, нанося на градиент (30 и 40%) фи-колла и центрифугировали l0 мин при l200 об/мин (18°). Вошедшие в слой фиколла тучные клетки собирали и трижды промывали сбалансированным раствором (буфер Hepes-NaCl (рН = 7,4), содержащим S mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, S mM глюкозы и 0,1% BSA). После каждого промывания клетки центрифугировали в течение l0 мин последовательно при l000, 800 и 600 об/мин. Осадок пе-ритонеальных тучных клеток разводили в небольшом количестве (1—2 мл) сбалансированного раствора. Подсчет клеток проводили в камере Горяева.
Метод определения гистамина [S]. Метод основан на реакции конденсации гистамина с орто-фталевым альдегидом, в результате которой образуется флуоресцирующий комплекс. Для активации к 90 мкл тучных клеток добавляли вещество 48/80 (от 2 • 10-s до 2 мг/мл) и смесь инкубировали 10 мин при 37°. Реакцию останавливали, доводя объем проб до 400 мкл охлажденным сбалансированным буфером, и помещали на холод на S мин. Затем пробы центрифугировали l0 мин при l600 об/мин. В су-пернатанте определяли секретируемый гистамин. Для определения остаточного гистамина осадок растворяли в 400 мкл сбалансированного буфера. Тучные клетки разрушали кипячением на водяной бане в течение S мин, центрифугировали l0 мин при 1600 об/мин и отбирали по 100 мкл супернатанта.
Для определения содержания гистамина к 100 мкл пробы последовательно добавляли 20 мкл 1N NaOH, 10 мкл 0,1%-го раствора ортофталевого альдегида и через 4 мин для подкисления 10 мкл 3N HCl. После добавления каждого реактива смесь тщательно перемешивали.
Флуоресценцию измеряли на спектрофлуоримет-ре Thermo Fluoroscan Ascent при 460 нм, возбуждая при 33S нм. Количество секретируемого гистамина вычисляли по формуле: А/(А + В) • 100%, где А — содержание гистамина в супернатанте, В — содержание гистамина в осадке, и выражали в процентах относительно общего содержания в клетках.
Результаты были статистически обработаны с помощью t-критерия Стьюдента и критерия х-квадрат (с поправкой для малых выборок) в компьютерной программе STATISTICA 6. Критической величиной значимости считали 0,0S.
Результаты и обсуждение
В первой серии экспериментов in vivo мышам вводили вещество 48/80 в дозе 8 мг/кг. Развивающаяся у них анафилактоидная реакция сопровождалась проявлением таких симптомов, как корчи, зуд, отек морды, лап, гиперемия хвоста и судо-
80
I 70 60
¡¡50 al 40
3 20 M
10
Рис. 1. Влияние предварительного введения PGP на выживаемость мышей при анафилактоидной реакции, вызванной веществом 48/80. 1 — контроль — введение 0,85% NACl и вещества 48/80 (N = 18); 2 — опыт — введение PGP и вещества 48/80
(N = 18)
рожное дыхание. В 73% случаев животные погибали в течение получаса.
Увеличение дозы вещества 48/80 не приводило к изменению соотношения числа погибших и выживших животных.
Если за 15 мин до введения вещества 48/80 вводили PGP (1 мг/кг), уровень смертности животных достоверно (р = 0,0373) снижался. В этом случае погибли лишь 27% животных и уменьшилась выраженность таких симптомов, как отек морды, лап, гиперемия хвоста и судорожное дыхание. Аналогичный эффект оказывал PGP и при введении мышам вещества 48/80 в дозе 12 мг/кг. На рис. 1 и 2 представлены объединенные данные первой серии экспериментов.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что PGP может облегчать состояние организма и уменьшать смертность экспериментальных животных при анафилактоидных реакциях, вызванных введением экзогенного либератора гистамина — вещества 48/80.
Для того чтобы выяснить, связаны ли защитные свойства PGP со стабилизацией тучных клеток
70
гиперемия отек судорожное
дыхание
Щ-1 □ -2
Рис. 2. Количество животных (%) с проявлением симптомов ана-филактоидной реакции, развивающейся на фоне предварительного введения PGP. 1 — контроль — введение 0,85% NACl и вещества 48/80 (N = 18); 2 — опыт — введение PGP и вещества 48/80 (N = 18)
Рис. 3. Влияние PGP на секрецию гистамина перитонеальны-ми тучными клетками при их активации веществом 48/80. 1 — контроль — сбалансированный буфер + вещество 48/80;
2 — опыт — PGP + вещество 48/80. Цифры под столбиками — количество животных в каждой группе
или обусловлены иными механизмами, мы исследовали in vitro его влияние на секрецию гистамина очищенными перитонеальными тучными клетками крыс при их активации веществом 48/80.
Было показано, что вещество 48/80 в диапазоне исследуемых концентраций 2 ■ 10-6—2 ■ 10-1 мг/мл дозозависимо активирует перитонеальные тучные клетки. Средний уровень спонтанной секреции гистамина в этих опытах составил 18,2%. Предварительная инкубация клеток с PGP не предотвращала их активацию веществом 48/80, секреция гистамина при этом не изменялась (рис. 3).
Поскольку PGP не препятствует высвобождению гистамина при активации тучных клеток веществом 48/80 in vitro, можно полагать, что в механизме его защитного действия in vivo должен присутствовать компонент, не связанный со стабилизацией тучных клеток. Не зависимые от стабилизации тучных клеток механизмы могут включать в себя пеп-
тидную регуляцию тонуса сосудов [9], поддержание проницаемости эндотелия, поддержание адекватного кровотока [10, 11], повышение устойчивости клеток и тканей к окислительному стрессу [12]. Одной из причин гибели животных во время анафилактоидной реакции может быть спазм бронхов, приводящий к остановке дыхания. Однако сведения о действии глипролинов на бронхи отсутствуют.
Таким образом, реализация защитных свойств глипролинов на тканевом и органном уровне, по всей вероятности, осуществляется несколькими механизмами, среди которых существуют как зависимые, так и не зависимые от стабилизации тучных клеток. Существование механизмов, зависимых от стабилизации тучных клеток, подтверждается ранее полученными in vitro данными о способности глип-ролинов препятствовать активации тучных клеток эндогенным активатором синактеном — аналогом АКТГ [13].
Выводы
1. На модели анафилактоидной реакции у мышей, вызванной введением вещества 48/80, выявлены защитные эффекты пептида PGP.
2. В опытах in vitro установлено, что PGP не изменяет секреторный ответ тучных клеток на действие экзогенного активатора — вещества 48/80.
3. Полученные данные позволяют прийти к заключению, что стабилизация тучных клеток не является единственным механизмом, обеспечивающим защитное действие PGP.
* * *
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 09-04-00669а).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Умарова Б.А., Лелекова Т.В., Копылова Т.Н. и др. Роль протекторных эффектов пролинсодержащих пептидов (PGP, PG, GP) в нарушении сократительной функции лимфатических сосудов брыжейки при экспериментальном перитоните у крыс // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 2006. Т. 142. № 9. C. 248—251.
2. Умарова Б.А, Копылова Т.Н., Лелекова Т.В. и др. Пептидная коррекция нарушений микроциркуляции брыжейки крыс при воспалении // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 2007. Т. 144(1). С. 29—32.
3. Умарова Б.А., Копылова Т.Н., Лелекова Т.В. и др. Механизм протекторного действия глипролинов при стрессе и воспалении // Нейрохимия. 2008. Т. 25. № 1—2. С. 119—123.
4. Metcalfe D.D., Baram D., Mekori Y.A. Mast cells // Physiol. rev. 1997. Vol. 77. N 4. P. 1033—1079.
5. Palomaki V.A., Laitinen J.T. The basic secretagogue compound 48/80 activates G proteins indirectly via stimulation of phospholipase D-lysophosphatidic acid receptor axis
and 5-HT1A receptors in rat brain sections // Br. J. Pharmacol. 2006. Vol. 147(6). P. 596—606.
6. Kim S.H., Choi C.H., Kim S.Y. et al. Anti-allergic effects of Artemisia iwayomogi on mast cell-mediated allergy model // Exp. Biol. Med. (Maywood). 2005. Vol. 230(1). P. 82—88.
7. Thon I.L., Uvnas B. Degranulation and histamine release, two consecutive steps in the response of rat mast cells to compound 48/80 // Acta. Physiol. Scand. 1967. Vol. 71(4). P. 303—315.
8. Shore P.A. The chemical determination of histamine. Methods // Biochem. An. Suppl. 1971. P. 89—97.
9. Bakaeva Z.V., Badmaeva K.E, Sergeev I.Y., Samoni-na G.E. Effect of glyprolines on norepinephrine tone of isolated rat aortic rings // Bull. Exp. Biol. Med. 2003. Vol. 135(4). P. 334—336.
10. Жуйкова C.E., Самонина Т.Е. Гомеостаз слизистой оболочки желудка и кровоток. Сообщение 2. Роль ишемии в нарушении гомеостаза слизистой оболоч-
ки желудка // Успехи физиол. наук. 2002. Т. 33. № 1. С. 77—87.
11. Копылова Т.Н., Смирнова Е.А., Санжиева Л.Ц. и др. Глипролины и семакс уменьшают стрессогенные нарушения микроциркуляции в брыжейке крыс // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 2003. Т. 136. № 11. С. 497—499.
12. Safarova E.R., Shram S.I., Zolotarev Y.A., Myaso-edov N.F. Effect of Semax peptide on survival of cultured
rat pheochromocytoma cells during oxidative stress // Bull. Exp. Biol. Med. 2003. Vol. 135(3). P. 268—271.
13. Умарова Б.А., Копылова Т.Н., Смирнова Е.А. и др. Секреторная активность тучных клеток при стрессе — влияние пептидов пролил-глицил-пролина и семакса // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 2003. Т. 136. № 10. С. 371—373.
Поступила в редакцию 28.03.11
THE PROTECTIVE EFFECT OF PROLIL-GLYCIL-PROLINE (PGP) IN COMPOUND 48/80-INDUCED ANAPHYLACTOID REACTION IN MICE
G.N. Kopylova, N.S. Bondarenko, B.A. Umarova, G.E. Samonina, A.A. Guseva, R.D. Platonova
The influences of PGP on compound 48/80-induced anaphylactoid reaction development in mice and on histamine secretion from rat peritoneal mast cells (RPMC) were investigated. Anaphylactoid reaction was induced by intraperitoneal injection of compound 48/80 into mice. The amount of histamine secreted by RPMC was evaluated.
Injection of PGP 15 min before injection of compound 48/80 led to decrease of mortality, and some of anaphylactoid reaction symptoms reduced. PGP had no effect on compound 48/80-in-duced histamine secretion from (RPMC) in vitro.
Key words: anaphylactoid reaction, regulatory peptides, compound 48/80.
Сведения об авторах
Копылова Галина Николаевна — канд. биол. наук, доц. кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-46-04; e-mail: Kopylovagn@list.ru
Бондаренко Надежда Сергеевна — аспирантка кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-14-16; e-mail: n.s.bondarenko@gmail.com
Умарова Белла Анверовна — докт. биол. наук, вед. науч. сотр. кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-14-16; e-mail: bellaum@mail.ru
Самонина Галина Ефимовна — докт. биол. наук, вед. науч. сотр. кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-46-04; e-mail: samonina_ge@mail.ru
Гусева Александра Александровна — канд. биол. наук, доц. кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-46-04; e-mail: agusseva@gmail.com
Платонова Римма Дмитриевна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-46-04; e-mail: rdplatonova@mail.ru
